Xác Định Đồng Thời Một Số Kháng Sinh Nhóm Carbapenem Bằng Phương Pháp Điện Di Mao Quản Sử Dụng Detector Đo Độ Dẫn Không Tiếp Xúc (Ce-C4d).doc

Tải tài liệu tại sividoc.com
Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------
Lê Đức Dũng
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM
CARBAPENEM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN
SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC (CE-
C4
D)
LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC
I

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------
Lê Đức Dũng
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM
CARBAPENEM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN
SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC (CE-
C4
D)
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 8440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hướng dẫn 1: PGS.TS. Nguyễn Thị Ánh Hường
Hướng dẫn 2: PGS.TS. Phạm Thị Ngọc Mai
Hà Nội, năm 2020
II

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất cứ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm
trước pháp luật về những cam kết này.
Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2020
Tác giá luận văn
Lê Đức Dũng
III

LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian thực hiện đề tài, em tỏ lòng biết ơn chân thành của mình
tới những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ em trong thời gian qua.
Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Ánh Hường
và PGS.TS. Phạm Thị Ngọc Mai đã giao để tài, nhiệt tình hướng dẫn, và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này.
Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa
học và Công nghệ, các thầy cô giáo giảng dạy tại bộ môn hóa phân tích, khoa
hóa học của Học viện Khoa học và Công nghệ cùng trường đại học Khoa học
tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn
thành khóa học và có những đóng góp quý báu cho em trong thời gian nghiên
cứu.
Em xin chân thành cảm ơn NCS. Lê Thái Bình tại bộ môn Hóa phân
tích Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà
Nội đã tạo điều kiện, tư vấn và phối hợp trong quá trình thực hiện đề tài.
Luận văn được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của đề tài mã số
104.04-2018.305 của quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia
(NAFOSTED).
Cuối cùng, em xin cảm ơn công ty 3Sanalysis đã cung cấp thiết bị CE-
C4
D để thực hiện nghiên cứu này, cảm ơn các anh chị trong nhóm nghiên cứu
sử dụng thiết bị CE-C4
D của bộ môn Hóa phân tích, Khoa Hóa học, Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã giúp đỡ, hướng dẫn
tận tình trong thời gian qua.
Hà Nội, ngày 28 tháng 05 năm 2020
Học viên
Lê Đức Dũng
IV

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN..............................................................................................ii
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG.........................................................................................x
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................xii
MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.............................................................................2
1.1. Giới thiệu chung về nhóm carbapenem 3
1.1.1. Giới thiệu về nhóm carbapenem3
1.1.2. Cơ chế tác dụng và đặc điểm dược động học 7
1.2. Các phương pháp xác định carbapenem 9
1.2.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis 9
1.2.2. Phương pháp điện hóa 10
1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 11
1.3. Phương pháp điện di mao quản 19
CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.1. Mục tiêu nghiên cứu..........................Error! Bookmark not defined.
2.2. Nội dung nghiên cứu33
2.3. Phương pháp nghiên cứu 33
2.3.1.Phương pháp phân tích CE-C4
D 33
2.3.1.Thiết bị và hóa chất34
2.4. Phương pháp xử lý mẫu 36
V

2.4.1.Mẫu dược phẩm....................................................................36
2.4.2. Xử lý mẫu dược phẩm.........................................................36
2.5. Phương pháp đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích .. 37
2.5.1.Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng...........................37
2.5.2.Độ chụm (độ lặp lại của phương pháp)................................37
2.5.3.Độ đúng, độ thu hồi của phương pháp .................................38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................39
3.1. Khảo sát điều kiện tối ưu trong việc tách và xác định bốn kháng
sinh nhóm carbapenem bằng phương pháp CE-C4
D........................39
3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm .............................39
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu.......................49
3.1.4. Khảo sát chiều cao bơm mẫu ..............................................51
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thế tách.........................................53
3.2. Đánh giá phương pháp phân tích ...............................................55
3.2.1. Xây dựng đường chuẩn các carbapenem ............................56
3.2.2. Giới hạn định lượng (LOD) và giới hạn phát hiện của
phương pháp (LOQ) ......................................................................59
3.2.3. Độ chụm của phương pháp..................................................60
3.2.4. Độ đúng của phương pháp ..................................................61
3.3. Phân tích mẫu thực tế và đối chứng phương pháp tiêu chuẩn
HPLC...........................................................................................................62
3.3.1. Phân tích một số mẫu thuốc kháng sinh carbapenem .........62
3.3.2. Phân tích đối chứnghàm lượng các carbapenem trong mẫu
dược phẩm với phân pháp tiêu chuẩn HPLC-PDA.......................65
VI

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................68
Danh mục bài báo công bố liên quan đến nội dung luận văn .........................70
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................71
PHỤ LỤC........................................................................................................76
VII

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt
Ace Acetic Acid Axit axetic
Arg Arginine Arginin
Capacitively coupled
Detector độ dẫn không tiếp
C4
D contactless conductivity xúc
detector
CE Capillary electrophoresis
Phương pháp điện di mao
quản
CZE
Capillary zone Phương pháp điện di mao
electrophoresis quản vùng
EOF Electro osmotic flow Dòng điện di thẩm thấu
His Histidine Histidin
HPLC
High performance liquid
Sắc kí lỏng hiệu năng cao
chromatography
I.D Inner diameter Đường kính trong
LOD limit of detection Giới hạn phát hiện
LOQ limit of quantitation Giới hạn định lượng
MS mass spectrometry Khối phổ
PDA Photo Diode Array Detector mảng diot quang
RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối
SD Standard deviation Độ lệch chuẩn
VIII

MEKC
Micellar electrokinetic Điện di mao quản điện
chromatography động học Mixen
Tris
Tris (hydroxymethyl) Tris (hydroxymetyl)
aminomethane aminometan
UV-Vis Ultra violet - Visible Phổ phấp thụ phân tử
SDS Sodium dodecyl sulfate Natri dodecyl sulfat
IX

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu tách và xác định các carbapenem bằng
phương pháp quang phổ, điện hóa và sắc ký..................................14
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu tách và xác định các carbapenem bằng điện
di mao quản.....................................................................................29
Bảng 3.1: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Arg/Ace . 41
Bảng 3.2: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Arg/Asc . 41
Bảng 3.3: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Arg/Lactic
43
Bảng 3.4: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Tris/Lactic
44
Bảng 3.5: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Tris/Ace . 46
Bảng 3.6: Độ phân giải của các cặp carbapenem ở các nồng độ đệm khác
nhau.................................................................................................48
nhau.................................................................................................50
Bảng 3.8: Độ phân giải của các cặp carbapenem khi thay đổi chiều cao
bơm mẫu .........................................................................................52
Bảng 3.9: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng các thế điện di
khác nhau........................................................................................53
Bảng 3.10: Điều kiện tối ưu xác định bốn kháng sinh nhóm carbapenem 55
Bảng 3.11: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ chất của các
carbapenem.....................................................................................56
X

Bảng 3.12: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phương trình
đường chuẩn doripenem, meropenem, imipenem và ertapenem....58
Bảng 3.13: Giới hạn phát hiện của doripenem, meropenem, imipenem và
ertapenem bằng phương pháp điện di mao quản............................59
Bảng 3.14: Phương trình đường chuẩn, giới hạn phát hiện (LOD) và giới
hạn định lượng (LOQ) của các carbapenem...................................59
Bảng 3.15: Độ lặp lại của phương pháp CE-C4
D trong định lượng
doripenem và meropenem ..............................................................60
Bảng 3.16: Độ lặp lại của phương pháp CE-C4
D trong định lượng
imipenem và ertapenem..................................................................60
Bảng 3.17: Độ thu hồi phương pháp CE-C4
D xác định ba kháng sinh
nhóm carbapenem...........................................................................62
Bảng 3.18: Kết quả phân tích các kháng sinh nhóm carbapenem bằng
phương pháp CE-C4
D.....................................................................63
Bảng 3.19: Kết quả phân tích các kháng sinh nhóm carbapenem bằng
D và phương pháp tiêu chuẩn HPLC-PDA ...65
XI

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản của carbapenem ................................................3
Hình 1.2: Công thức cấu tạo doripenem .....................................................4
Hình 1.3: Công thức cấu tạo meropenem....................................................5
Hình 1.4: Công thức cấu tạo imipenem ......................................................6
Hình 1.5: Công thức cấu tạo ertapenem......................................................7
Hình 1.6: Cấu tạo hệ CE cơ bản................................................................21
Hình 1.7: Mô hình dòng EOF trong phương pháp điện di mao quản.......21
Hình 1.8: Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc. 24
Hình 1.9: A) Sơ đồ biểu diễn cấu trúc của detector C4
D..........................24
Hình 1.10: Biểu diễn mối liên hệ giữa tín hiệu đầu ra và độ lớn (điện thế
và tần số) của nguồn kích thích xoay chiều....................................25
Hình 1.11: Sơ đồ thiết kế của C4
D............................................................26
Hình 1.12: Các kĩ thuật bơm mẫu .............................................................27
Hình 2.1: Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4
D sử dụng trong nghiên cứu.........34
Hình 3.1: Điện di đồ phân tích bốn carbapenem (nồng độ 50ppm) sử dụng
hệ đệm Arg 10mM/Ace ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-
C4
D khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm,
chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm
mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm ................................................40
hệ đệm Arg 10mM/Asc ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-
C4
XII

hệ đệm Arg 10mM/Lactic ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-
C4
hệ đệm Tris 10mM/Lactic ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-
C4
chiều dài mao quản 60cm ( độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm
hệ đệm Tris 10mM/Ace ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-
C4
tại pH=8 của các hệ đệm điện di khác nhau. Các điều kiện CE-C4
D
khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm,
Hình 3.7: Điện di đồ của các carbapenem (nồng độ 50ppm) khi thay đổi
nồng độ đệm. Các điều kiện CE-C4
D khác: thế tách 20kV, mao
quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ
XIII

dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 10s chiều cao bơm mẫu
10cm................................................................................................48
thời gian bơm mẫu. Các điều kiện CE-C4
D khác: thế tách 20kV,
mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm
(độ dài hiệu dụng 50cm), chiều cao bơm mẫu 10cm .....................50
chiều cao bơm mẫu. Các điều kiện CE-C4
D khác: thế tách 20kV,
mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm
(độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 20s..........................52
thế áp 2 đầu mao quản. Các điều kiện CE-C4
D khác: mao quản
silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ dài
hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 20s chiều cao bơm mẫu 20cm
54
Hình 3.11: Điện di đồ phân tách đồng thời bốn kháng sinh ở điều kiện tối
ưu như bảng 3.10 ............................................................................55
Hình 3.12: Đường chuẩn của các carbapenem..........................................57
Hình 3.13: Kết quả phân tích giữa nhãn công bố và CE-C4
D..................64
Hình 3.14: Kết quả phân tích một số mẫu dược phẩm trên thị trường. Điều
kiện CE-C4
D như hình 3.11 ...........................................................64
Hình 3.15: Sự tương quan giữa kết quả phân tích HPLC và CE-C4
D......66
XIV

MỞ ĐẦU
Thuốc kháng sinh được nhà khoa học Scottland, Alexander Fleming [1]
sáng chế vào năm 1928. Kháng sinh là những hợp chất hóa học, có tác động
chuyên biệt trên một giai đoạn chuyển hóa thiết yếu của vi sinh vật. Thuốc
kháng sinh có thể kìm hãm hoặc tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh ngăn cho
chúng phát triển và lây lan. Với những nước đang phát triển như Việt Nam,
đây là một nhóm thuốc quan trọng vì bệnh lý nhiễm khuẩn nằm trong số
những bệnh đứng hàng đầu cả về tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong.
Hiện nay, kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong điều trị vấn đề liên
quan đến nhiễm khuẩn. Trong đó, phải kể đến các kháng sinh thuộc nhóm
carbapenem. Carbapenem là phân nhóm kháng sinh thuộc họ beta-lactam có
phổ rộng, tác dụng trên hầu hết các vi khuẩn Gram dương và Gram âm [2], kể
cả các chủng vi khuẩn tiết betalactamase hoạt phổ rộng thường được sử dụng
để điều trị các bệnh nhiễm trùng nặng do vi khuẩn có nguy cơ tử vong cao.
Doripenem, meropenem, imipenem và ertapenem là các kháng sinh đại diện
của nhóm carbapenem được sử dụng hiệu quả trong bệnh viện và các cơ sở y
tế, cũng là đối tượng được lựa chọn trong nghiên cứu này.
Hiện nay có nhiều phương pháp định tính, định lượng các hoạt chất
trong thuốc như: phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) [3, 4],
phương pháp điện hóa [5], sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC [6, 7, 8, 9, 10,
11],...Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi hệ thiết bị đắt tiền, quá trình xử
lý tốn nhiều thời gian. Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn
không tiếp xúc CE-C4
D có nhiều ưu điểm như thiết bị đơn giản, sử dụng ít
hóa chất, thời gian phân tích phù hợp với điều kiện nghiên cứu ở Việt Nam.
Do vậy, đề tài “Xác định đồng thời một số kháng sinh nhóm carbapenem
1

bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp
xúc (CE-C4
D)” được lựa với các mục tiêu sau:
- Khảo sát tối ưu quy trình phân tích đồng thời bốn kháng sinh nhóm
carbapenem gồm: doripenem, meropenem, imipenem và ertapenem
bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không
tiếp xúc (CE-C4
D)
- Thẩm định và đánh giá phương pháp trên nền mẫu dược phẩm nhằm
hướng áp dụng quy trình phân tích trong kiểm soát chất lượng
nguyên liệu, bán thành phẩm trong các nhà máy sản xuất các sản
phẩm có chứa hoạt chất này, cũng như áp dụng trong phân tích sàng
lọc (áp dụng cho các đội quản lý thị trường với ưu thế thiết bị CE-
C4
D đơn giản, nhỏ gọn, linh động và chi phí thấp) đối với chất
lượng thuốc trên thị trường trước khi gửi mẫu phân tích theo các
phương pháp chuẩn theo dược điển.
2

TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về nhóm carbapenem
1.1.1. Giới thiệu về nhóm carbapenem
Carbapenem thuộc nhóm kháng sinh beta-lactam bán tổng hợp, có cấu
trúc khác các kháng sinh penicillin là sản phẩm được cấu tạo bởi một nguyên
tử carbon thay thế cho nguyên tử lưu huỳnh trong cấu trúc vòng thiazollidin
và có liên kết đôi giữa C-2 và C-3. Thêm vào đó, với việc có nhóm
etylhydroxyl liên kết với vòng beta-lactam làm cấu trúc nó khác với các
cephalosporin và penicillin, đồng thời còn khác các kháng sinh cephalosporin
và penicillin là nhóm acylamino. Dưới đây là công thức phân tử chung của
nhóm carbapenem [12].
Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản của carbapenem
Trong nhóm carbapenem có bốn chất cơ bản được sử dụng phổ biến tại
Việt Nam là doripenem, meropenem, imipenem và ertapenem.
1.1.1.1. Doripenem
- Tên IUPAC: (4R,5S,6S)-6-[(1R)-1.hydroxyethyl]-4.methyl-7-oxo-
3.[(3S,5S)-5-[(sulfamoylamino)methyl]pyrrolidin-3.yl]sulfanyl-
1.azabicyclo [3.2.0] hept-2.ene-2.carboxylic acid [12, 13, 14].
- Công thức phân tử: C15H24N4O6S2
-
Khối lượng phân tử: 420,532 g.mol-1
3

- Hằng số phân ly: pKa= 4,37; pKb= 9,39.
- Meropenem chất bột màu trắng, tan ít trong nước và đimetyl sulfoxide
[15].
Hình 1.2: Công thức cấu tạo doripenem
Doripenem bền vững với tác dụng thủy phân của dehydropeptidase-I
(DHP-1) có ở vi nhung mao của tế bào ống lượn gần của thận hơn so với
imipenem, vì vậy không cần dùng cùng với chất ức chế DHP-1 như cilastatin.
Doripenem ức chế sự tổng hợp vách tế bào vi khuẩn bằng cách gắn với
protein liên kết penicilin (PBP) để làm bất hoạt các protein này, từ đó có tác
dụng diệt khuẩn.
1.1.1.2. Meropenem
- Tên IUPAC: (4R,5S,6S)-3.(((3S,5S)-5-(Dimethylcarbamoyl)pyrrolidin-
3.yl)thio)-6-((R)-1.hydroxyethyl)-4.methyl-7-oxo-
1.azabicyclo[3.2.0]hept-2.ene-2.carboxylic acid [12, 13, 14].
- Công thức phân tử: C17H25N3O5S
-
- Meropenem có dạng bột, tinh thể màu trắng đến vàng nhạt, ít tan trong
nước, hầu như không tan trong etanol, không tan trong ete, axeton [15].
4

Hình 1.3: Công thức cấu tạo meropenem
Meropenem có phổ hoạt tính rộng phần lớn với vi khuẩn Gram dương,
Gram âm, vi khuẩn hiếu khí và kị khí; nằm trong danh sách các loại thuốc
thiết yếu của Tổ chức Y tế Thế Giới
Meropenem không hấp thụ được qua đường tiêu hóa, được chỉ định để
điều trị các nhiễm khuẩn ở người lớn và trẻ em trên 3 tháng tuổi gây ra bởi
một hay nhiều vi khuẩn nhạy cảm với meropenem như viêm phổi và viêm
phổi bệnh viện; nhiễm khuẩn đường niệu; nhiễm khuẩn trong ổ bụng;
nhiễm khuẩn da và cấu trúc da; nhiễm khuẩn huyết; nhiễm khuẩn phụ
khoa; các bệnh lý vùng chậu; đặc biệt meropenem là kháng sinh duy nhất
trong nhóm carbapenem được chấp thuận điều trị viêm màng não. Không
khuyến cáo dùng trong trường hợp nhiễm trùng do các Stapylococcus đề
kháng với meticilin [12, 13, 14].
1.1.1.3. Imipenem
- Tên IUPAC: (5R, 6S) -3. [2. (aminomethylideneamino) ethylsulfanyl] -
6 - [(1R) -1.hydroxyethyl] -7-oxo-1.azabicyclo [3.2.0] hept-2.ene- Axit
2.carboxylic [12, 13, 14].
-
5

- Imipenem có dạng bột, tinh thể màu trắng, hút ẩm. Độ hòa tan của
imipenem: 1g/1000ml H2O hoặc 1g/2000ml metanol, không tan trong
etanol, đimetylformamide và đimetylsulfoxide [15].
Hình 1.4: Công thức cấu tạo imipenem
Imipenem là một loại kháng sinh carbapenem có phổ kháng khuẩn rộng
hơn và lớn hơn hiệu lực hơn các kháng sinh beta-lactam khác. Nó thường
được sử dụng kết hợp với cilastatin - chất ức chế sự phân huỷ của imipenem
bởi emzym dehdropeptidase có trong ống thận. Imipenem/cilastatin thường
được dùng tiêm tĩnh mạch.
Imipenem được chỉ định để điều trị các bệnh nhiễm trùng nặng đặc biệt
với các vi khuẩn kháng cephalosporin. Imipenem được sử dụng riêng hoặc kết
hợp với một aminoglycoside, nó có thể được sử dụng cho nhiễm trùng
nghiêm trọng bao gồm nhiễm trùng phổi, trong ổ bụng và mô mềm [12].
1.1.1.4. Ertapenem
- Tên IUPAC: (4R, 5S, 6S) -3 - [(3S, 5S) - 5 - [(3.carboxyphenyl)
carbamoyl] pyrrolidin-3.yl] sulfanyl-6 - [(1R) -1. hydroxyethyl] -
4.methyl-7-oxo-1.azabicyclo [3.2.0] axit hept-2.ene-2.carboxylic.
-
6

- Ertapenem có dạng bột, tinh thể màu trắng, hút ẩm, tan trong nước,
không tan trong etanol, isopropyl acetate và tetrahydrofuran [15].
Hình 1.5: Công thức cấu tạo ertapenem
Ertapenem là một kháng sinh phổ rộng carbapenem với phổ hoạt động
hẹp hơn so với imipenem. Thuốc này có tác dụng với hầu hết các vi khuẩn
đường ruột và vi khuẩn kị khí nhưng hiệu quả thấp hơn các carbapenem khác
khi điều trị các vi khuẩn Gram(+), đặc biệt là các vi khuẩn ruột và phế cầu
kháng penicilin.
Ertapenem có tác dụng điều trị nhiễn khuẩn ổ bụng, đường tiết niệu và
da, và nhiễm trùng cấu trúc da, cấp tính nhiễm trùng vùng chậu và viêm phổi.
1.1.2. Cơ chế tác dụng và đặc điểm dược động học
1.1.2.1. Cơ chế tác dụng
Với đặc điểm có liên kết ái cao với các protein liên kết penicillin (PBP)
của vi khuẩn Gram âm và Gram dương [2, 16] thì các kháng sinh nhóm
carbapenem có thể làm gián đoạn quá trình sinh tổng hợp vách tế bào dẫn đến
vi khuẩn không có vách tế bào che chở sẽ bị tiêu diệt bởi vì khả năng gây ức
chế giai đoạn cuối của quá trình tổng hợp vách tế bào vi khuẩn [2].
7

Thông thường, kháng sinh nhóm carbapenem có phổ kháng khuẩn rộng
và không bị ảnh hưởng chéo với các thuốc khác trong họ beta-lactam do
carbapenem có khả năng thấm tốt qua màng tế bào và bền vững với nhóm
beta-lactmase [16].
1.1.2.2. Đặc điểm dược động học
Do không có khả năng hấp thụ qua đường uống nên các kháng sinh
carbapenem đều được sử dụng ở dạng truyền tĩnh mạch [16, 17].
Với 2 kháng sinh imipenem và meropenem liều được sử dụng thông
thường là 500mg và 1000mg. Sau khi truyền vào tĩnh mạch thì nồng độ đạt
đỉnh trong huyết tương (Cmax) của imipenem 30-35mg/l và 60-70mg/l với liều
dùng lần lượt là 500mg và 1000mg [15], còn sau 4-6 giờ thì nồng độ còn lại
trong huyết tương lần lượt là 0,5mg/l và 2mg/l. Cùng liều truyền đó với
meropenem có giá trị Cmax lần lượt là 26 mg/l và 50-60mg/l [2].
Nhờ có khả năng liên kết với protein trong huyết tương lên đến 92,95%
của ertapenem cho nên khác với các kháng sinh khác dùng một ngày ít nhất
ba lần như imipenem 20% và meropenem 2% ( khả năng liên kết với protein)
thì ertapenem có thể dùng 1 lần/ ngày [2].
Do khả năng phân bố tốt trong dịch cơ thể nên nồng độ Imipenem trong
các dịch tuyến tiền liệt, cơ quan sinh dục nữ, phổi, nước bọt, vỏ thận, tủy thận
và tủy đều vượt trên nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của hầu hết các vi khuẩn
hiếu khí; còn meropenem thì phân bố chủ yếu ở dịch kẽ [18]. Với meropenem
nồng độ thuốc sau khi truyền từ 1,5-2 giờ với liều truyền 1000mg đo được tại
một số cơ quan: tại phổi là 1,43-8,32mg/kg; tại túi mật là 4,21-5,95mg/kg; tại
da là 4,21-5,95mg/kg và 0,65-4,52 mg/kg tại đại tràng [18]. Ngoài ra, với khả
năng xâm nhập được dịch não tủy ở bệnh nhân viêm não với nồng độ 0,1-
2,8mg/l với liều dùng 20mg/kg và nồng độ 0,3-6,5mg/l với liều dùng
8

40mg/kg thì meropenem là kháng sinh duy nhất được chỉ định điều trị viêm
màng não trong nhóm dược FDA.
Để tránh bị mất hoạt tính và hình thành dẫn chất chuyển hóa gây độc
cho thận do bị thủy phân bởi dehydropeptidase (DHP-I) thì imipenem luôn
được phối hợp với cilastatin theo tỷ lệ khối lượng 1:1 để ức chế DHP-I [19,
20].
Ngược lại với imipenem thì các kháng sinh carbapenem khác như
meropenem, ertapenem và doripenem lại bền vững với DHP-1 do đó không
cần chất gây ức chế DHP-1 khi sử dụng [20]. Khác với meropenem chủ yếu
được bài tiết qua thận dưới dạng chưa chuyển hóa (khoảng 70%) thì
ertapenem được thải trừ qua lọc ở cầu thận và bài tiết tại ống thận. Các nghiên
cứu trước đây đã xác định được khoảng 80% lượng ertapenem được tìm thấy
trong nước tiểu dưới dạng chưa chuyển hóa, còn sản phẩm chuyển hóa chính
của ertapenem tạo thành là do DHP-1 mở vòng beta-lactam [21].
1.2. Các phương pháp xác định carbapenem
1.2.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis
Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử là phương pháp trắc quang
dùng để phân tích định lượng dựa trên mối hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi phân
tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ. Vùng bức xạ thông thường được sử
dụng trong phương pháp này là vùng tử ngoại gần 200÷400nm hay vùng khả
kiến ứng với bước sóng khoảng từ 400÷900nm (tùy thiết bị của mỗi hãng).
Nguyên tắc hoạt động của phương pháp tuân theo định luật Bouger – Lambert
– Beer. Với nguyên tắc đơn giản thì phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
UV-Vis được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực.
Với ưu điểm như thế, Sharma Shalvi, Agrawal Nitasha, Singh Jaskaran
and Shukla S.K sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis xác
định meropenem (bước sóng hấp thụ cực đại 305nm trong chloroform) và
9

imipenem (bước sóng hấp thụ cực đại 295nm trong etanol) trong nước tiểu
với việc sử dụng dung môi chiết chloroform/axeton với meropenem và
chloroform/dietyl ete/ etanol với imipenem. Kết quả thu được với meropenem
là 73,85% và imipenem là 93,81 % với mẫu nước tiểu tự tạo [3].
Trong một nghiên cứu khác, với việc không bị ảnh hưởng bởi phổ hấp
thụ của chất ức chế cilastatin tại bước sóng 318nm như 243nm (hai đỉnh hấp
thụ cực đại của imipenem) thì 318nm được R.J. Forsyth và các cộng sự sử
dụng để xác định để xác định hàm lượng imipenem trong mẫu dược phẩm
bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis. Kết quả thu được
đường chuẩn của Imipenem nằm trong khoảng từ 14 - 42ppm với hệ số tương
quan R2
>0,99 [4]. Các kết quả sau đó được đối chứng với phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao thì thấy độ sai khác giữa hai phương pháp đều nhỏ hơn
10%, chứng tỏ phương pháp có độ chính xác cao.
Tuy là phương pháp dễ thực hiện, chi phí sử dụng thấp nhưng phương
pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử lại bị hạn chế ở một số đối tượng mẫu nhất
định, dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố có trong nền mẫu nên nền mẫu thường
đơn giản ít thành phần, độ chính xác và độ chọn lọc thấp, ngoài ra, khoảng
tuyến tính thông thường hẹp và độ nhạy của phương pháp thấp nên rất khó sử
dụng để định lượng các carbapenem.
1.2.2. Phương pháp điện hóa
Phương pháp vôn-ampe là phương pháp quan trọng của phân tích điện
hóa. Đây là phương pháp phân tích dựa vào việc nghiên cứu đường cong vôn-
ampe, là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ dòng điện vào thế
khi tiến hành điện phân chất phân tích.
Với ưu điểm như thế, Abdelilah Hilali và các cộng sự tiến hành nghiên
cứu xác định imipenem trong nước tiểu sử dụng phương pháp cực phổ xung
vi phân và vôn-ampe vòng với giới hạn lần lượt là 4x10-7
M và 1,05x10-9
M
10

sử dụng đệm photphat với pH=7,0 trên hai tình nguyện viên sử dụng thuốc có
chứa thành phần imipenem. Kết quả này là bước đầu giúp các bác sĩ có thể
đưa ra phác đồ điều trị phù hợp cho từng bệnh nhân [5].
Với độ nhạy cao thì phương pháp điện hóa nên được ứng dụng rộng rãi
nhưng cũng giống như phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử là với các nền
mẫu đơn giản như nền mẫu thuốc hay các nền mẫu tự tạo hoặc trên những tình
nguyện viên có sức khỏe thuốc khi sử dụng thuốc, đôi khi lại không xuất hiện
các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả dẫn đến kết quả thiếu chính xác và có thể
gây nhầm lẫn cho các bác sĩ với liều dùng và phác đồ điều trị cho bệnh nhân.
1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng là quá trình xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và
pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng- rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột
tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được
phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích,
do cấu trúc phân tử và tính chất lý hoá của các chất khác nhau nên khả năng
tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy chúng di
chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. Hiện nay, sắc ký lỏng được
sử dụng để xác định các hoạt chất trong thuốc và có rất nhiều công trình
nghiên cứu của các tác giả khác nhau sử dụng phương pháp này. Trong
phương pháp sắc ký lỏng có rất nhiều detector được sử dụng nhưng phổ biến
nhất với là detector UV, DAD và detector khối phổ MS.
Với đặc điểm có bước sóng hấp thụ cực đại trong vùng Vis nên rất
nhiều tác giả đã sử dụng như công cụ định lượng hàm lượng các carbapenem
và có thể kể đến như L. Hakobyan, J. Pla Tolos, Y. Moliner-Martinez, C.
Molins-Legua, Jesus Ruiz Ramos, M. Gordon, Paula ´ Ramirez-Galleymore,
P. Campins-Falco [6] đã có thể định lượng hàm lượng meropenem trong ống
11

nội khí quản khi kết hợp thêm với kỹ thuật sử dụng vi chiết pha rắn. Kết quả
thu được rất khả quan khi có giới hạn phát hiện được chất ở nồng độ 3 ng/mL
và có độ chính xác cao (RSD<12%) tại bước sóng hấp thụ cực đại 300nm; hay
Kayo Ikeda và các cộng sự [7] đã có thể giúp các bác sĩ theo dõi nồng độ
meropenem có trong huyết tương với việc sử dụng đệm MOPs để ổn định và
tránh quá trình phân hủy của meropenem trong thời gian chưa kip xử lý. Ở
nghiên cứu này, các tác giả cũng sử dụng bước sóng hấp thụ cực đại là 300nm
làm bước sóng nghiên cứu và cũng thu được kết quả rất khả quan như có thể
đạt được giới hạn phát hiện 0,1g/mL; cũng giống như hai nhóm tác giả trên thì
Mehnam Soltani và nhóm nghiên cứu của ông [8] cũng sử dụng bước sóng
hấp thụ cực đại là 300nm để xác định hàm lượng huyết thanh người, tất cả các
hiệu suất thu hồi tại các mức nồng độ khác nhau trong nghiên cứu này đều đạt
trên 76,5% với độ chính xác trong khoảng từ 0,1%-9,6%, kết quả này giúp
bác sĩ có thể đưa ra phác đồ điều trị cho mỗi bệnh nhân sao cho phù hợp nhất;
không giống như các tác giả ở trên, nhóm nghiên cứu gồm Nadine Pinder,
Thorsten Brenner, Stefanie Swoboda, Markus A. Weigand, Torsten Hoppe-
Tichy [22] đã nghiên cứu độ bền của thuốc sau khi pha chế với 4 kháng sinh
ceftazidime (bước sóng hấp thụ cực đại 260 nm), meropenem (bước sóng hấp
thụ cực đại 304 nm), piperacillin and flucloxacillin (cùng ở bước sóng hấp thụ
cực đại 260 nm) với nội chuẩn là ertapenem thì thấy rằng ngoại trừ
piperacillin chỉ bền trong 8 giờ sau khi pha còn các kháng sinh khác đều có độ
bền là 24 giờ sau khi pha; ở một thí nghiệm khác, cũng là xác định định đồng
thời các kháng sinh và piperacillin nhưng Raphael Denooz và Corinne
Charlier đã tìm ra quy trình định lượng 5 kháng sinh cefepim, ceftazidim,
cefuroxim, meropenem trong huyết tương. Kết quả thu được rất tốt khi cùng
quy trình xử lý mẫu nhưng tất cả hiệu suất thu hồi đều đạt trên 70% với mức
nồng độ 5ug/mL cũng với các bước sóng hấp thụ cực đại 256 nm đối với
cefepim và ceftazidim, 270 nm đối với cefuroxim và ceforanide, 300 nm đối
12

với meropenem và 220 nm đối với piperacilline; còn với Yuji Kurihara, Junko
Kizu và Seiji Hori [9] thì có thể xác định đồng thời 5 kháng sinh nhóm
carbapenem là imipenem, biapenem, panipenem, doripenem và meropenem
với giới hạn phát hiện từ 20 đến 40 ng/ml tại bước sóng hấp thụ cực đại tại
300nm; còn nghiên cứu gần đây thì Le Zou và các cộng sự [10] đã xác định
được đồng thời nồng độ imipenem và meropenem tại bước sóng hấp thụ cực
đại là 300nm có trong huyết tương người kể từ lúc tiêm đến lúc 12 tiếng sau
truyền để giúp bác sĩ đưa ra phác đồ điều trị cho các bác sĩ với các bệnh nhân.
Ở nghiên cứu này các hệ số CV đều nhỏ hơn 8% và tất các hiệu suất thu hồi
của phương pháp đều lớn hơn 91,5%.
Ngoài detector UV, DAD thì gần đây detector phổ khối MS có giới hạn
phát hiện tốt và độ chọn lọc cao được sử dụng nhiều trong định lượng các
carbapenem, điển hình như Therese Koal và các cộng sự [11] đã tìm ra quy
trình định lượng ertapenem trong mẫu huyết thanh bằng detector phố khối MS
với mảnh phổ đặc trưng của ertapenem là m/z 491,9, các kết quả thu được rất
tốt với giới hạn phát hiện LOD 0,1 ug/mL với hệ số tương quan R2
=0,9999,
hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu tại các mức nồng độ đều đạt trên
90%, hệ số RSD đều nhỏ hơn 7,4% và độ chính xác đều trên 90%; và trong
nghiên cứu khác nhóm tác giả M. Paal, M. Zoller, C. Schuster, M. Vogeser,
G. Schützea [23] đưa ra được quy trình phân tích 6 kháng sinh cefepime,
meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid và piperacillin trong huyết
thanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector khối
phổ 2 lần MS/MS với khoảng tuyến tính từ 0,05 mg/l đến 400 mg/l cùng các
mảnh ion m/z lần lượt là 481,0; 384,1; 332,0; 402,0; 338,0 và 518,0.
Với đặc điểm độ nhạy cao, độ chọn lọc tốt và quy trình xử lý mẫu đơn
giản thì phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao rất được hay sử dụng trong
định lượng nhóm kháng sinh carbapenem; tuy nhiên, chi phí đầu tư cho thiết
13

bị còn lớn, cần thêm các phụ kiện phụ trợ và hóa chất đắt tiền thì khó có thể
sử dụng rộng rãi và phổ biến tại Việt Nam.
Kết quả các nghiên cứu xác định carbapenem bằng bằng phương pháp
quang phổ, điện hóa và sắc ký được tổng hợp trong bảng 1.1 dưới đây.
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu tách và xác định các carbapenem bằng phương
pháp quang phổ, điện hóa và sắc ký
Tác giả
Mục đích
Điều kiện
Phương
Kết quả
nghiên cứu pháp
Dung dịch đệm:
UV-Vis ở Hiệu suất
Sharma Xác định 305nm với thu hồi
meropenem
và các meropenem và meropenem trong
trong chlorform
cộng sự imipenem trong và 295nm khoảng từ
và imipenem
[3] nước tiểu với 73,85%-
trong etanol
imipenem 93,81%
R.J.
Xác định hàm
Forsyth Khoảng
lượng imipenem Dung dịch đệm UV-Vis ở
và các tuyến tính
trong mẫu dược MOPS pH=7,0 318 nm
cộng sự 14-42ppm
phẩm
[4]
Xác định hàm
Vonampe Có giới hạn
Abdelila lượng imipenem
vòng và phát hiện:
h và các trong mẫu huyết Dung dịch đệm:
cực phổ 1,05 x 10-9
cộng sự tương ở hai bệnh phốtphát pH=7,0
xung vi M và 4 x
[5] nhân tình
phân 10-7
nguyện
Khoảng
Pha động: Đệm tuyến tính:
phosphate 0,05 đến
(pH=7,4) và 100 g / mL.
Kayo Xác định acetonitril
HPLC -
RSD<
Ikeda và Meropenem (90:10, v/v), tốc 7,17% và
UV ở 300
các cộng trong huyết độ dòng hiệu suất
nm
sự. [7] tương người 1ml/minCột: thu hồi
Bondasphere trong
C18 5µm(3.9 khoảng

mm × 150 mm) 97,7% -
106,3%.
14

LOD =
0,01 g/ml
Pha động: (A)
acetonitril, (B)
phosphate
Xác định 5 chất (pH=7,4). Chế Khoảng
nhóm β-lactam độ gradient 5 tuyến tính
Raphael (cefepim, phút đầu (A:B
HPLC -
2,5-60 g /
Denooz, ceftazidim, 5:95, v/v); 20 mL với mỗi
UV trong
Corinne cefuroxim, phút (A:B 50:50, loại kháng
khoảng
Charlier meropenem và v/v), 5 phút
200-400nm
sinh. Độ
[10] piperacillin) (A:B 5:95, v/v). chính xác
trong huyết Tốc độ dòng từ 93,2 đến
tương người 1ml/min Cột: 107,1%
Symmetry® C8
(250 mm × 4,6
mm i.d.)
Pha động: Nước,
methanol và
Mehnam
Xác định
orthophosphoric Khoảng
Soltani acid (64:35:1, HPLC - tuyến tính
ertapenem trong
và các v/v/v), tốc độ UV tại 1-100 mg/l,
huyết thanh
cộng sự dòng 1ml/min 300nm độ thu hồi
người
[8] Cột Hypersil (5 84%
µm, 100 mm ×
4,6 mm)

15

Pha động: (A)
0.2% phosphoric
acid (pH 2.2),
(B) acetonitrile.
chế độ gradient: Khoảng
Xác định 1 phút (A:B 95:
HPLC -
tuyến tính
Piperacillin, 5, v/v); 5 phút thu được
Nadine UV tại
meropenem, (A:B 80:20, cho
Pinder và 210nm;
ceftazidime v/v); 5 phút meropenem
các cộng
flucloxacillin (A:B 30:70,
230nm;
2-200ppm,
sự [22] 260nm;
trong huyết v/v); 4 phút R2
>0,999,
306nm
thanh người (A:B 95: 5, v/v). độ thu hồi
Tốc độ dòng 108,8%
1ml/min Cột
Gemini C18,
150 × 4,6 mm, 5
μm
Pha động: (A)
10 mM
ammonium
formiate:formic
Xác định
acid (99,9:0,1,
M. Paal, v/v); (B) Khoảng
cefepime,
M. methanol. Chế tuyến tính
meropenem,
Zoller, độ gradient: 0,1 thu được
ciprofloxacin,
C.Schust, phút (A:B 93:7, HPLC – với
moxifloxacin,
M.Voges linezolid và v/v); 0,5 phút MS/MS meropenem
er, (A:B 35:65, là 0,25-
piperacillin
G.Schütz v/v); 1,5 phút 120mg/l,
trong huyết
e [23] (A:B 5:95, v/v); R2
>0,997
thanh người
2 phút (A:B
93:7, v/v) Cột
Fortis C8 3µm
(100 mm x 2,1
mm)

16

Xác định
Pha động: 0,1M
phosphat
Yuji Imipenem,
(ph=7,8): Khoảng
Kurihara, panipenem,
methanol 92:8, tuyến tính
Junko meropenem,
v/v, tốc độ dòng HPLC –MS 0,04-
Kizu, biapenem,
1ml/min Cột: 25mg/l, R2
Seiji doripenem trong
Luna 5µm >0,999
Hori [9] huyết thanh
C18(2) 100 A
chuột
(250 x 4,6 mm)
Pha động: (A) 2
mM NH4Oac,
LOD
0,1% acetic
Therese 0,1µg/ml,
acid, pH= 3,8).
Koal, LOQ
(B) methanol
Michael 1µg/ml,
Xác định (A) 5 phút (A:B
Deters, khoảng
ertapenem trong 10:90 v/v), 3
Klaus LC-MS tuyến tính
huyết tương phút (A:B 100:0
Resch, 0,1-50
người v/v) tốc độ dòng
Volkhard µg/ml, độ
0,5ml/min Cột:
Kaever thu hồi
Synergi 4µ A
[11] >90%,
Polar-RP 80A
RSD<10%
Mercury (10 x
2,0 mm)
Pha động: (A)
Acetonitril: (B)
H2O. Chế độ
gardient: 10
L.
Xác định
phút (A:B 10:90,
Hakobya v/v), 3 phút LOD= 3
meropenem LC – DAD
n và các (A:B 15:85, µg/ml,
trong ống nội tại 300nm
cộng sự v/v), 2 phút RSD< 10%
khí quản
[6] (A:B 10:90, v/v)
Cột: Zorbax SB-
C18 (150 mm x
0,5 mm i.d, 5
μm)

17

Pha động: (A)
Le Zou, H2O, (B) Khoảng
Fanqi acetonitril. Chế tuyến tính
Meng,
meropenem,
độ gradient: 10 0,1-
Lin Hu, phút (A:B 98:2, RP-HPLC - 100µg/ml,
imipenem, trong
Qi v/v), 12 phút UV tại R2
>0,999,
huyết tương
Huang, (A:B 65:35, v/v) 298nm LOD
người
Min Liu, Cột: <0,1µg/ml,
Tao Yin Diamonsil® độ thu hồi
[5] C18 (250 * 4,6 > 91%
mm, 5µm)
Pha động: (A)
metanol, (B)
natri phosphat
(pH=7). Chế độ
Xác định gradient: từ thời
E. Dailly
doripenem, điểm 0 phút
Khoảng
ertapenem, (A:B 0:100, HPLC -
và các tuyến tính
imipenem, v/v), 5 phút UV tại
cộng sự 6-100mg/l,
meropenem (A:B 30:70, 295nm
[19] R2
>0,995
trong huyết v/v), 2 phút
tương người (A:B 0:100,
v/v). Cột: 2,6µm
PentaFluoroPhe
nyl (100 mm ×
4,6 mm ID)
Pha động:
acetonitril,
metanol và đệm
USP 40 Xác định
tetrabutylammo Khoảng
nium pH=7,5 HPLC-UV được chấp
[24] meropenem
(w/w tại 300nm nhận 90-
trong thuốc tiêm
150:100:750). 120%
Cột C18, kích
thước 4,6mm x
25cm x 5µm

18

Pha động: natri
Xác định
1-hexansulfonat Khoảng
USP 40 pH=6,8, kích HPLC-UV được chấp
imipenem trong
[25] thước cột: tại 254nm nhận 90-
thuốc tiêm
4,6mm x 30 cm 115%
cột C18
1.3. Phương pháp điện di mao quản
1.3.1. Nguyên tắc phân tách các chất trong điện di mao quản
Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) là một phương pháp
tách và phân tích các chất dựa trên cơ sở sựu di chuyển khác nhau của các ion
mang điện tích trong dung dịch chất điện ly dưới tác dụng của điện trường
sinh ra từ nguồn thế cao áp vào hai đầu mao quản. Thời gian di chuyển các
ion được dung để định tính, định lượng sẽ dựa vào diện tích pic thu được sau
quá trình phân tích.
Phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả
tách cao, thời gian phân tích ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Hiện nay, phương
pháp ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: y dược, sinh học,....
1.3.2. Phân loại
Điện di mao quản gồm nhiều các kỹ thuật tách khác nhau, mỗi kỹ thuật có
một cơ chế riêng [26, 27]:
- Điện di mao quản vùng (CZE)
- Sắc ký mao quản Gel (CGE)
- Sắc ký mao quản điện động học mixen (MECC)
- Điện di mao quản điểm đẳng điện (IEF)
- Điện di mao quản đẳng tốc độ (ITP)
- Sắc kí điện di mao quản (CEC)
19

Trong đó kỹ thuật điện di mao quản vùng (CZE) được sửu dụng nhiều bởi
đặc tính đơn giản và hiệu quả
1.3.3. Cơ sở lý thuyết
Độ điện di (µ) là hằng số đặc trưng cho hạt tích điện trong một điều kiện
điện di xác định:
µ = q/(6...r.)
Từ công thức trên có thể thấy [26, 27]:, độ điện di tỷ lệ thuận với điện
tích của hạt mang điện (q) và tỷ lệ nghịch với độ nhớt của dung dịch đệm điện
di (), bán kính hyddrat của hạt mang điện (r). Nghĩa là, trong một điện
trường E nhất định, chất nào có điện tích lớn và kích thước nhỏ sẽ di chuyển
nhanh; với các chất mang điện có cùng điện tích, chất nào có kích thước nhỏ
sẽ di chuyển nhanh hơn; với các chất mang điện có cùng bán kính, chất nào có
điện tích lớn sẽ di chuyển nhanh hơn.
1.3.4. Cấu tạo hệ CE cơ bản
Sau đây là cấu tạo của hệ điện di cơ bản:
- Dung dịch đệm điện ly: dùng để tạo môi trường cho quá trình điện di
khi áp thế cao vào đầu hai mao quản. Trong quá trình điện di, hai đầu
mao quản được đặt trong hai bình chứ dung dịch đệm.
- Nguồn thế cao: thường dao động từ 5-30kV, dùng để áp vào đầu hai
mao quản nhằm sinh ra điện trường lớn cho quá trình điện di xảy ra.
- Detector: bộ phận phát hiện và ghi nhận tín hiệu của chất phân tích sau
quá trình tách điện di. Các loại detector thông dụng: hấp thụ phân tử
(UV-VIS), huỳnh quang phân tử, phát xạ hoặc hấp thụ nguyên tử, khối
phổ, đo dòng, đo thế, đo độ dẫn.
- Bộ phận điều khiển: thường là máy tính sử dụng phần mềm chuyên
dụng phù hợp, để ghi nhận, hiển thị và xử lý kết quả.
20

Hình 1.6: Cấu tạo hệ CE cơ bản
1.3.5. Dòng điện di thẩm thấu EOF
Dòng điện di thẩm thấu (ElectroOsmotic Flow - EOF) là một đặc trưng
riêng có của phương pháp điện di mao quản sử dụng mao quản silica. Đây là
dòng chuyển động của khối dung dịch di chuyển trong mao quản từ cực
dương sang âm (với mao quản silica có bề mặt trong tích điện âm SiO-) xuất
hiện khi áp một điện thế cao vào hai đầu mao quản chứa đầy dung dịch đệm.
Tốc độ của dòng EOF bằng đúng tốc độ của các ion không mang điện trong
quá trình điện di.
Hình 1.7: Mô hình dòng EOF trong phương pháp điện di mao quản
21

Trong quá trình di chuyển của mình, EOF sẽ cuốn theo các ion có mặt
trong mao quản. Với cột mao quản silica, cations dịch chuyển cùng chiều
EOF, còn anions dịch chuyển ngược chiều EOF.
1.3.6. Các detector thông dụng
Trong phương pháp điện di mao quản, sự phát hiện các chất trong quá
trình có thể được thực hiện trực tiếp hoặc gián tiếp tùy vào bản chất các chất
phân tích. Còn việc định lượng dựa trên mối quan hệ giữa tín hiệu đo và nồng
độ các chất phân tích. Việc phát hiện và đo định lượng được thực hiện nhờ
các detector. Các detector được đặt ở gần cuối của mao quản. Tùy thuộc vào
mục đích phát hiện cũng như định lượng và đặc tính của các chất mà sử dụng
các detector tương ứng như: detector quang học, detector khối phổ, detector
điện hoa, detector độ dẫn [26].,....
1.3.6.1. Detector quang học
Detector quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS) hoặc huỳnh quang được
sử dụng trong hầu hết các thiết bị CE thương phẩm. Detector quang phổ hấp
thụ phân tử (UV-VIS) là detector phổ biến nhất, đáp ứng được những chất
phân tích có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-VIS. Đối với các chất
không hấp thụ ánh sáng UV-VIS như ion vô cơ, các amino acid... cần có thêm
thuốc thử để tạo các hợp chất màu trung gian.
Detector huỳnh quang dùng để phát hiện và định lượng các chất và dẫn
xuất có khả năng phát ra ánh sáng huỳnh quang. Chất phân tích hấp thụ ánh
sáng ở một bước sóng nhất định ngay sau đó suy biến và phát ra huỳnh quang
ở bước sóng dài hơn. Detector huỳnh quang có độ nhạy cao nhất, với LOD
gấp 3 lần detector UV-VIS. Tuy nhiên detector này có gái thành cao, cần
được kích hoạt băng bức xa laser và có thể gây ra hiện tượng giảm tín hiệu đo
do cường độ ánh sáng kích thích lớn [26, 27].
22

1.3.6.2. Detector khối phổ
Detector khối phổ là detector vạn năng cho phân tích và định lượng, có
độ nhạy cao vì thế ưu việt hơn detector quang học, điện hóa. Trong phương
pháp khối phổ, các phân tử bị ion hóa được tăng tốc trong một trường điện từ
và tách theo khối lượng của nó. Quá tình ion hóa thường cung cấp đủ năng
lượng để phân tử bị phá võ thành các mảnh khác nhau. Ngoài định tính và
định lượng, detector khối phổ còn cho biết cấu trúc của các chất phân tích, do
đó nó trở thành công cụ quan trọng để phân tích đặc tính của các phân tử sinh
học như peptit, protein, [27].....
1.3.6.3. Detector điện hóa
Detector đo thế là một detector đơn giản và tiện lợi nhất trong các
detector điện hóa. Trong detector đo thế, nồng độ chất phân tích được xác
định dựa vào sự thay đổi của thế điện cực của điện cực làm việc khi nhúng
trong dung dịch phân tích cùng điện cực so sánh. Detector chỉ đáp ứng chọn
lọc với một số ion nhất định nên là detector có độ chọn lọc cao nhất trong các
detector điện hóa [26, 27].
Detector đo dòng là một hệ 3 điện cực gồm: điện cực làm việc, điện cực
so sánh và điện cực phụ trợ, lập thành một mạch điện đặc biệt. Dòng điện sinh
ra do quá trình oxi hóa hoặc khử các chất phân tích hay chính là do sự chuyển
electron giữa điện cực làm việc và điện cực phụ trợ, dòng điện này tỉ lệ với
chất phân tích. Tuy nhiên detector này chỉ phù hợp với các chất phân tích có
tính oxi hóa hoặc khử như amin thơm, phenol,...
Detector đo độ dẫn là detector phù hợp với tất các chất phân tích mang
điện. Chất phân tích được phát hiện bởi detector trong một nền dung dịch điện
ly. Detector đo độ dẫn trực tiếp đo độ dẫn của dung dịch phân tích được đặt
giữa hai điện cực. Detector đo độ dẫn có thể đo theo kiểu tiếp xúc hoặc không
tiếp xúc, vị trí đặt detector có thể tiếp xúc hoặc không tiếp xúc với điện cực và
dung dịch điện ly tương ứng.
23

Một nhược điểm chung của detector điện hóa khi dùng để định lượng
trực tiếp là độ chọn lọc kém. Giải pháp để hạn chế nhược điểm này là kết hợp
giữa định lượng bằng detector điện hóa với kỹ thuật tách, trong đó tách bằng
điện di được coi là kỹ thuật đơn giản và phù hợp nhất.
1.3.6.4. Detector đo độ dẫn không tiếp xúc
Nguyên lí hoạt động
Hình 1.8: Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc.
Hình 1.9: A) Sơ đồ biểu diễn cấu trúc của detector C4
D
B)Mạch điện tương đương
Hai điện cực hình ống được đặt nôi tiếp đồng trục bên ngoài mao quản
có chứa dung dịch cần đo. Hai điện cực hình ống tạo với dung dịch bên trong
24

mao quản thành hai tụ điện C. Khoảng dung dịch nằm giữa hai điện cực đóng
vai trò như điện trở R. Việc xác định điện trở này sẽ cho ta thông tin về độ
dẫn của các ion trong dung dịch đó [27].
Nguồn điện xoay chiều (V) với tần số (f) được áp vào điện cực thứ
nhất. Tại điện cực thứ hai, tín hiệu đo được ở dạng cường độ dòng điện (I).
Theo đó, dòng điện thu được tại điện cực thứ 2 sẽ phụ thuộc vào độ lớn của
điện thế V và tần số f Nguồn kích thích V có giá trị càng cao thì tín hiệu I đo
được cũng càng lớn.
Hình 1.10: Biểu diễn mối liên hệ giữa tín hiệu đầu ra và độ lớn (điện thế và
tần số) của nguồn kích thích xoay chiều
Tần số hoạt động f của nguồn kích thích phải cao (tối thiểu vài trăm
kHz), để triệt tiêu giá trị dung kháng Z=(1/2πC)2
. Ở tần số cao, V=I/R với R
là điện trở của dung dịch cần đo.
Tín hiệu đầu ra thu được ở dạng cường độ dòng điện (xoay chiều), sau
đó sẽ được chuyển đổi và khuếch đại thành tín hiệu dạng vôn thế (xoay
chiều), thông qua việc sử dụng một điện trở khuếch đại. Vôn thế xoay chiều
sau đó được chuyển đổi thành vôn thế 1 chiều, lọc nhiễu và khuếch đại, sau
25

cùng chuyển đổi thành tín hiệu số hóa (xem hình 4) trước khi được hiển thị và
lưu trữ trên máy tính [27].
Hình 1.11: Sơ đồ thiết kế của C4
D
Để tăng độ nhạy cần sử dụng giải pháp nâng cao nguồn điện thế kích
thích xoay chiều thay vì dùng điện trở khuếch đại quá lớn. Lý do là khi dùng
điện trở khuếch đại lớn thì cả tín hiệu cần đo và nhiễu nền cùng được khuếch
đại gây cản trở cho định tính và định lượng [27]. Thông thường điện trở
khuếch đại có giá trị 330kΩ đến 1,5MΩ.
1.3.7. Các kỹ thuật bơm mẫu
Quá trình bơm mẫu vào cột tách của phương pháp có thể thực hiện theo
hai phương pháp như hình 1.12:
26

Hình 1.12: Các kĩ thuật bơm mẫu trong phương pháp CE
- Kĩ thuật bơm mẫu kiểu thủy động học: trong kĩ thuật này, mẫu được
bơm vào mao quản nhờ áp lực (hình a,b,d). Khi đó, lượng mẫu bơm
vào phụ thuộc vào áp lực sử dụng (áp suất, lực hút chân không hoặc
chiều cao bơm mẫu và thời gian bơm mẫu).
- Kĩ thuật bơm mẫu kiểu điện động học: kĩ thuật sử dụng lực điện khi áp
thế cao (5-10kV trong vài giây) để bơm mẫu vào mao quản. Phương
pháp này cho kết quả các pic phân tách có độ sắc nét cao. Tuy nhiên,
diện tích pic dùng để định lượng có độ lặp lại thấp với các nền mẫu
khac nhau, do đó thường dùng để định tính [27].
Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) là một phương pháp
tách và phân tích các chất dựa trên cơ sở sựu di chuyển khác nhau của các ion
mang điện tích trong dung dịch chất điện ly dưới tác dụng của điện trường
sinh ra từ nguồn thế cao áp vào hai đầu mao quản. Thời gian di chuyển các
ion được dung để định tính, định lượng sẽ dựa vào diện tích pic thu được sau
quá trình phân tích [27].
Phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả
tách cao, thời gian phân tích ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Hiện nay, phương
pháp ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: y dược, sinh học [28, 29, 30, 31],....
27

Gần đây, phương pháp điện di mao quản cho thấy được tiềm năng phát
triển do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu
tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng dụng để xác định kháng sinh trong
nhiều đối tượng mẫu khác nhau.
Dựa vào các đặc điểm đó có rất nhiều nghiên cứu đã sử dụng và đã thu
được một kết quả nhất định như Shoko Taniguchi và các cộng sự [32] theo
dõi quá trình phân hủy của kháng sinh meropenem, biapenem và imipenem
trong một vài điều kiện khác nhau với điều kiện điện di dung dịch đệm điện di
100mM photphat, pH=8,0, cột 25 µm và thế tách 30kV, nhận thấy rằng các
carbapenem đều phân hủy khoảng 30% sau 24 tiếng khi có thêm các tác nhân
gây ức chế như fosmicin; ở nghiên cứu khác nhóm tác giả Toshihiro Kitahashi
[33] và Yahya Mrestani [34] đều sử dụng detector UV để định lượng hàm
lượng meropenem trong một số mẫu như huyết tương, huyết thanh và nước
tiểu thì thời gian di chuyển của meropenem đều nằm trong khoảng từ 5-7 phút
và có độ nhạy rất tốt với giới hạn phát hiện LOD nhỏ hơn 2 mg/l cùng với độ
lặp tốt (RSD < 10%) và hiệu suất thu hồi cao (H>90%) qua đó chứng tỏ
phương pháp có thể áp dụng cho việc phân tích thực tế.
Ngoài điện di mao quản vùng thì điện di điện động học micelle cũng
được ứng dụng trong định lượng các carbapenem, điển hình như hai nhóm
nghiên cứu Michalska với 2 công trình đã công bố [35, 36] và Yu-Wei Chou
[37] với 1 công trình đã công bố. Với nhóm nghiên cứu Katarzyna Michalska
cả 2 công trình đều sử dụng natri dodecyl sulfat để tạo môi trường micelle, tất
cả các kết quả của hai công trình đều được đối chứng với phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao nhận thấy rằng sai khác đều nhỏ hơn 10%, chứng tỏ
phương pháp có độ đúng cao. Còn đối với nhóm nghiên cứu Yu-Wei Chou thì
họ đã thành công trong việc xác định hàm lượng meropenem trong huyết
tương của các bệnh nhân viêm màng não và qua nghiên cứu các tác giả thấy
28

rằng nồng độ meropenem sẽ giảm từ 45,04mg/l xuống còn 1,2mg/l từ 1 tiếng
sau truyền đến 8 tiếng sau truyền.
Kết quả các nghiên cứu xác định carbapenem bằng phương pháp điện
di mao quản được tổng hợp trong bảng 1.2 dưới đây.
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu tách và xác định các carbapenem
bằng điện di mao quản
Tác giả
Đối tượng Kiểu
Detector
Điều kiện
Kết quả
nghiên cứu điện di điện di
Dung dịch
đệm:
100mM
Shoko
UV-Vis
photphat,
Taniguchi pH=8
meropenem CZE tại LOD=0,128ppm
và các cộng Cột: 25 µm
210nm
sự [32] I.Dx34,7
cm.
Thế tách
30kV
Dung dịch
đệm:
Toshihiro
25mM
khoảng tuyến
meropenem UV-Vis Natri
Kitahashi tính 0-200mg/l;
trong huyết MEKC tại tetraborat/
và Itaru LOD 2mg/l,
thanh 210nm natri
Furuta [33] RSD<8.87%
hydroxit
(pH=10),
SDS
29

90mM.
Cột: 50cm,
75µmI.D.
Thế tách
25kV
Dung dịch
Yahya
đệm:
10mM
Mrestani, meropenem PDA từ Khoảng tuyến
phosphat
Reinhard trong huyết 200nm tính 0,5 -
CZE (pH=7,2).
Neubert, tương, nước đến 200ppm,
Sử dụng Z-
Frank tiểu 500nm LOD=0,5ppm
cell.
Nagel [34]
Thế tách
30kV
Dung dịch
đệm:
22,5mM
HCOOH(p
H=4,3) và
Katarzyna 150mM
Michalska biapenem
MEKC
UV tại natri
LOD = 0,5ppm
và các cộng trong thuốc 200nm dodecyl
sự [35] sulfat
Cột:
60/50cm;
50µm I.D.
Thế tách
22kV
30

Dung dịch
đệm:
60mM
Katarzyna
NaH2PO4,
ertapenem 20mM
Michalska UV tại
trong dược MEKC H3BO3 LOD = 0,3ppm
và các cộng 214nm
phẩm (pH=6),
sự [36]
Cột: 60/52;
75 µm I.D.
Thế tách
18kV
Dung dịch
đệm: Tris
Yu-Wei meropenem
40mM,
pH=8, SDS Khoảng tuyến
Chou và trong huyết UV tại
MEKC Cột: tính 0,5-50ppm.
các cộng sự tương và 300nm
40,2/30cm, LOD = 0,2ppm
[37] dịch não tủy
50 µm I.D.
Thế tách
15kV
Như vậy có thể thấy, các nghiên cứu sử dụng phương pháp điện di ở
trên chủ yếu sử dụng detector UV. Qua đây cho thấy được tiềm năng lớn của
phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc
CE-C4
D trong việc kiểm nghiệm, xác định bốn kháng sinh nhóm carbapenem.
Dưới đây sẽ chỉ ra thực nghiệm của quá trình xác định đồng thời doripenem,
meropenem, imipenem và ertapenem trong mẫu thuốc sử dụng phương pháp
điện di mao quản với detector độ dẫn không tiếp xúc.
31

32

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu nghiên cứu, các nội dung chính cần thực hiện là:
* Nghiên cứu khảo sát các điều kiện tối ưu cho việc xác định đồng thời
Doripenem, Meropenem, Imipenem và Ertapenem:
- Điều kiện phân tích trên thiết bị điện di: Cố định một số điều kiện như
chiều dài cột, đường kính cột và chiều cao bơm mẫu.
- Khảo sát hệ đệm, nồng độ đệm và pH của dung dịch đệm.
- Khảo sát thời gian bơm mẫu.
- Khảo sát điện thế đặt vào hai đầu mao quản.
* Thẩm định phương pháp phân tích
- Xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn.
- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
- Đánh giá độ chụm của phương pháp phân tích.
- Đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích.
* Áp dụng phân tích một số mẫu thuốc trên thị trường.
* Thực hiện phân tích đối chứng với phương pháp tiêu chuẩn sắc ký
lỏng hiệu năng cao sử dụng detector PDA.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân tích CE-C4
D
Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp
xúc (CE-C4
D) được phát triển mạnh mẽ những năm gần đây. Phương pháp
33

được ứng dụng rộng rãi để phân tích để phân tích các đối tượng mẫu khác
nhau đặc biệt hiệu quả trong tách và phân tích các loại mẫu sinh học, dược
phẩm. Đây là một trong số ít các phương pháp phân tích vừa có thể triển khai
hiệu quả trong phòng thí nghiệm, vừa có thể triển khai hiệu quả tại hiện
trường, thậm chí tự động hóa quá trình phân tích khi cần thiết. Do đó, phương
pháp điện di mao quản là sự lựa chọn phù hợp cho nghiên cứu phát triển và
ứng dụng xác định hàm lượng ba kháng sinh nhóm Carbapenem trong dược
phẩm, từ đó góp đảm bảo chất lượng dược phẩm, củng cố niềm tin của người
tiêu dùng.
2.3.1.Thiết bị và hóa chất
2.3.1.1. Thiết bị CE-C4
D
Thiết bị CE-C4
D sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp bởi Công ty
3Sanalysis (http://www.3sanalysis.vn/). Thiết bị có nguồn thế cao lên đến 25
kV, sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (C4
D). Hình ảnh thiết bị CE-
C4
D sử dụng trong nghiên cứu được thể hiện trong hình 2.1.
Hình 2.1: Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4
D sử dụng trong nghiên cứu
(1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển cao thế, 3: Cảm biến độ dẫn không tiếp
xúc, 4: Ống dẫn dung dịch đệm, 5: Núm điều chỉnh, 6: Bộ phận điều khiển, 7:
Bình khí nén)
34

2.3.1.2. Các thiết bị khác và dụng cụ
- Máy ly tâm của hãng LCEN -200.
- Máy rung siêu âm có gia nhiệt BRANSON 521.
- Máy đo pH của hãng HANNA.
- Tủ lạnh Sanaky VH-2899W.
- Máy lọc nước Direct Q3-UV hãng Merck Millipore
- Cân phân tích với độ chính xác 0,1mg.
- Dụng cụ thủy tinh: bình định mức 10,00ml, 25,00ml và 50,00ml; cốc,
ống nghiệm, phễu.
- Micropipet các loại: 200 µl và 1000 µl.
- Một số dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm.
2.3.1.3. Hóa chất
+ Chất chuẩn: Bốn kháng sinh nhóm carbapenem: doripenem 95% số lô
2-HBS-109-1, meropenem sodium salt 98% số lô 6-ALN-168-1, imipenem
monohydrate 98% số lô 3-XJZ-149-1, ertapenem disodium 90 % số lô 5-
HBN-41-1 (Hãng Toronto Research Chemicals, Canada)
+ Hóa chất dung môi:
- Tris (Sigma, Singapore, hàm lượng ≥99%)
- Arigin (Sigma, Singapore, hàm lượng ≥99%)
- Axit L-ascorbic (Sigma, Singapore, hàm lượng ≥99%)
- Axit lacitc (Merck, Đức, hàm lượng ≥99%)
- Axit axetic (Merck, Đức, hàm lượng ≥99%)
35

- Nước deion (theo tiêu chuẩn Mỹ, châu Âu) dùng cho phân tích điện
di, sắc ký được lấy từ máy lọc nước Direct Q3-UV có sử dụng lọc cuối LC-
pack (cỡ lọc 0,45 µm).
+ Chuẩn bị các dung dịch hóa chất:
- Dung dịch chuẩn gốc bốn kháng sinh doripenem, meropenem,
imipenem và ertapenem 1000ppm được pha từ chất chuẩn như sau: cân chính
xác 0,0106g doripenem 0,0116g meropenem, 0,0108g imipenem, 0,0116g
ertapenem, chuyển vào từng bình định mức 10,00ml, lắc đều. Sau đó định
mức đến vạch bằng nước deion. Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh từ -
4o
C-2 o
C, tránh ánh sáng và có thể sử dụng trong vòng 3 tháng.
- Dung dịch đệm điện di được pha như sau: cân chính xác 0,0303g Tris,
chuyển vào bình định mức 25,00ml, lắc đều. Sau đó định mức đến vạch bằng
nước deion. Dung dịch được chuẩn lại pH=8 bằng axit axetic trước khi đẩy
vào mao quản. Dung dịch đệm được pha mới hàng ngày.
2.4. Phương pháp xử lý mẫu
2.4.1. Mẫu dược phẩm
Các mẫu dược phẩm sử dụng trong nghiên cứu được mua tại các nhà
thuốc tư nhân và cơ sở y tế đã liệt kê ở PL3.
2.4.2. Xử lý mẫu dược phẩm
- Mẫu kháng sinh nhóm carbapenem dạng bột
Cân chính xác trên cân phân tích một lượng 0,0100g mẫu đã trộn đều,
sau đó, cho vào bình định mức 10,00ml hòa tan bằng nước deion và định mức
tới vạch bằng nước deion, rung siêu âm và lọc qua màng 0,45µm. Pha loãng
20 lần bằng nước deion trước khi tiến hành bơm vào thiết bị CE.
36

2.5. Phương pháp đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích
Độ tin cậy của phương pháp CE-C4
D trong phân tích được đánh giá qua
các thông số: giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại, hiệu suất thu
hồi.
2.5.1. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (LOD) [38, 39, 40] được xem là nồng độ thấp nhất
của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có
nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Đối với quá trình điện di,
LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 3.
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà
hệ thống phân tích định lượng với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định
lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Thông thường với quá trình
sắc kí, LOQ là nồng độ nhỏ nhất mà cho tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10.
2.5.2. Độ chụm (độ lặp lại của phương pháp)
Độ lặp lại, một cách tương đối, là độ sai lệch của các giá trị riêng lẻ xi
và giá trị trung bình trên các mẫu thử giống hệt nhau trong những điều kiện
thí nghiệm giống nhau (cùng người phân tích, cùng trang thiết bị, phòng thí
nghiệm) trong những khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại có thể xác định qua độ
lệch chuẩn hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD%). Khi độ lệch chuẩn càng
lớn thì sai số của phép đo hay phương pháp càng lớn [38, 39, 40].
Công thức tính độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối là:
RSD(%) = SD/Stb x
100%
Trong đó:
- Si là diện tích pic thứ i
37

- Stb là diện tích trung bình của n lần chạy
- N là số lần chạy lặp lại
2.5.3. Độ đúng, độ thu hồi của phương pháp
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các
kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận. Do đó, thước đo
độ đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hay cách xác định độ thu hồi
[37, 38, 39].
Hiệu suất thu hồi (H): H = Ctt/Clt
x100% Trong đó
- H là hiệu suất thu hồi (%)
- Ctt là nồng độ thực tế của chất phân tích thu được
- Clt là nồng độ lý thuyết được tính toán từ lượng chuẩn thêm vào.
Nếu chất chuẩn thêm vào mẫu trước khi xử lý mẫu ta có độ đúng của
phương pháp, còn nếu chất chuẩn được thêm vào trước khi bơm vào thiết bị
CE ta có độ đúng của thiết bị.
2.5.4. Độ phân giải
Định nghĩa: Độ phân giải được mô tả khả năng tách giữa hai pic. Nếu R
là lớn hơn hoặc bằng 1,5 thì khả năng tách của 2 pic là 99%. Công thức tính
độ phân giải [38, 39, 40]:
tb − ta
R = 2x Wa + Wb
Wa, Wb: độ rộng giữa 2 pic
ta, tb : thời gian di chuyển của 2 pic tính theo đỉnh pic đó.
38

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát điều kiện tối ưu trong việc tách và xác định bốn kháng sinh
nhóm carbapenem bằng phương pháp CE-C4
D
3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm
pH, thành phần và nồng độ của dung dịch đệm điện di là những yếu tố
ảnh hưởng rất lớn trong phương pháp điện di mao quản, nó gây ảnh hưởng
đến quá trình di chuyển của các chất trong mao quản và dòng điện di thẩm
thấu (EOF). Vì vậy, các yếu tố được lựa chọn khảo sát trước tiên là pH, thành
phần và nồng độ đệm của hệ đệm điện di, bên cạnh các yếu tố khác như thời
giam bơm mẫu, thế tách và các yếu tố ảnh hưởng khác.
3.1.1.1. Khảo sát đồng thời các loại đệm và pH của đệm
Do các chất phân tích có cấu tạo phân tử cồng kềnh, điện tích ít, do đó
việc sử dụng phân cực thuận (sử dụng phân cực cùng dấu tại đầu bơm mẫu: áp
thế dương với các chất phân tích là cation, áp thế âm với các chất phân tích là
anion) sẽ khó cho kết quả tốt. Trên thực tế, việc phân tích theo phân cực thuận
đã được thực hiện và kết quả không cho tín hiệu các chất phân tích. Vì vậy, kỹ
thuật phân cực ngược (sử dụng thế dương khi phân tích các anion) trong đó
lợi dụng dòng EOF kéo các chất phân tích với độ linh động thấp đã được sử
dụng. Kết quả đã cho tín hiệu các chất phân tích rõ ràng và phân tách tốt.
Để thực hiện phân cực ngược sử dụng dòng EOF, cần phải lựa chọn pH
thích hợp: pH cao để tạo dòng EOF đủ lớn nhưng nếu pH cao quá sẽ cho độ
lặp kém hơn và nhiễu đường nền tăng cao. Thêm vào đó, do sử dụng detector
độ dẫn thì các đệm sử dụng trong phương pháp CE-C4
D phải đảm bảo độ điện
ly nhưng độ dẫn không được quá cao sẽ làm giảm độ nhạy của phương pháp.
Vì vậy, các loại đệm được lựa chọn khảo sát đồng thời thành phần và pH đệm
39

nhằm lựa chọn được hệ đệm phù hợp nhất gồm: arginin 10mM/ axit axetic,
arginin 10mM/ axit ascobic, arginin 10mM/ axit lactic, Tris (hydroxymetyl)
aminometan 10mM/ axit lactic và Tris (hydroxymetyl) aminometan 10mM/
axit axetic với các pH 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 và 9,0.
Đầu tiên, hệ đệm Arg/Ace với các pH 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 và 9,0 với nồng
độ đệm 10mM, thế tách 20kV, chiều cao bơm mẫu 10cm và thời gian bơm
mẫu 20s được chọn để khảo sát. Các kết quả thu được trong hình 3.1 và bảng
3.1.
10 mV
pH=7,0
pH=7,5
pH=8,0
Dori
Mero Imi Erta
pH=8,5
pH=9,0
200 300 400 500 600 700 800
Thêi gian di chuyÓn (s)
Hình 3.1: Điện di đồ phân tích bốn carbapenem (nồng độ 50ppm) sử dụng hệ
đệm Arg 10mM/Ace ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-C4
D khác: thế
tách 20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản
60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 10s chiều cao bơm mẫu
10cm
40

Bảng 3.1: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Arg/Ace
Độ phân giải Dori-Mero Mero-Imi Imi-Erta
pH=7,0 - 9,56 5,27
pH=7,5 3,10 7,75 8,36
pH=8,0 4,00 5,05 10,52
pH=8,5 1,67 5,17 10,48
pH=9,0 1,33 4,18 10,18
Từ hình 3.1 và bảng 3.1 có thể thấy rằng, bốn carbapenem tách nhau
tương đối tốt. Các pic sắc nét, đường nền ổn định và đặc biệt tại pH=8,0 thì có
đường nền và các pic có diện tích lớn nhất.
Tiếp theo, hệ đệm Arg/Asc được khảo sát ở các pH 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 và
9,0, với các điều kiện khác tương tự hình 3.1. Các kết quả thu được trong hình
3.2 và bảng 3.2.
Bảng 3.2: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Arg/Asc
pH=7,0 1,09 - -
pH=7,5 - 4,53 6,63
pH=8,0 3,63 5,75 -
pH=8,5 2,63 6,14 -
pH=9,0 2,04 8,57 -
41

10mV pH=7,5
pH=8,0
Dori Mero Imi
pH=8,5
pH=9,0
pH=7,0
200 300 400 500 600
đệm Arg 10mM/Asc ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-C4
D khác: thế
10cm
Ngược lại với hệ đệm Arg/ Ace thì ở hệ đệm Arg/ Asc, tín hiệu của các
carbapenem tương đối nhỏ, không có sự xuất hiện của ertapenem và đường
nền bị nhiễu. Tuy không có sự xuất hiện của ertapenem nhưng tại pH=8,0 cho
tín hiệu của doripenem, meropenem và imipenem là tốt nhất so với các pH
còn lại.
Sau khi khảo sát hệ đệm Arg/ Ace thì hệ đệm được khảo sát ở các pH
7,0; 7,5; 8,0; 8,5 và 9,0, với các điều kiện khác tương tự hình 3.1. Các kết quả
thu được trong hình 3.3 và bảng 3.3.
42

pH=7,0
10mV
pH=7,5
pH=8,0
Dori
Mero
Imi
Erta
pH=8,5
pH=9,0
200 300 400 500 600 700
đệm Arg 10mM/Lactic ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-C4
D khác: thế
10cm
Bảng 3.3: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Arg/Lactic
pH=7,0 - - 4,83
pH=7,5 3,20 8,00 7,84
pH=8,0 5,14 6,17 8,42
pH=8,5 4,29 4,75 9,88
pH=9,0 1,14 10,31 6,09
Với hệ đệm Arg/ Lactíc, thì có thế thấy rõ, tại pH=8,5 tín hiệu cả bốn
carbapenem là tốt nhất với đường nền ổn định và chất phân tích cho tín hiện
tốt nhất.
43

Với đặc điểm là axit amin có độ dẫn điện kém thì Tris cũng thường
được sử dụng làm cấu tử đệm trong phương pháp điện di mao quản CE-C4
D,
hệ đệm Tris/Ace ở các pH 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 và 9,0 với các điều kiện khác
tương tự hình 3.1. Các kết quả thu được trong hình 3.4 và bảng 3.4.
10mV pH=7,5
Dori
Mero Imi Erta
pH=8,0
pH=8,5
pH=9,0
pH=7,0
200 300 400 500 600
Th¬i gian di chuyÓn (s)
đệm Tris 10mM/Lactic ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-C4
D khác: thế
60cm ( độ dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 10s chiều cao bơm mẫu
10cm
Bảng 3.4: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Tris/Lactic
pH=7,0 3,64 11,03 8,34
pH=7,5 5,62 5,32 9,32
pH=8,0 5,04 3,95 4,07
pH=8,5 2,45 3,88 7,56
pH=9,0 - - -
44

Với hệ đệm Tris/Latic, các pH đều có thể tách hoàn toàn cả bốn
carbapenem ngoại trừ pH=9,0. Nhưng trong đó, pH=8,0 cho tín hiệu chất
phân tích tốt nhất và đường nền ổn định nhất.
Cuối cùng hệ đệm được chọn là Tris/ Ace ở các pH 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 và
9,0, với các điều kiện khác tương tự hình 3.1. Các kết quả thu được trong hình
3.5 và bảng 3.5.
pH=9,0
20 mV
pH=8,5
pH=8,0
Dori
Mero Imi Erta
pH=7,5
pH=7,0
0 200 400 600 800 1000 1200
đệm Tris 10mM/Ace ở các pH khác nhau. Các điều kiện CE-C4
D khác: thế
10cm
45

Bảng 3.5: Độ phân giải của các cặp carbapenem sử dụng đệm Tris/Ace
pH=7,0 12,97 5,12 -
pH=7,5 4,82 5,07 9,71
pH=8,0 3,54 3,85 9,15
pH=8,5 - 3,06 8,14
pH=9,0 2,38 2,80 7,38
Từ hình 3.5 và bảng 3.5 có thể nhận thấy, với hệ đệm Tris/ Ace ở tất cả
pH cả bốn carbapenem đều tách được tốt và tín hiệu chất phân tích tốt nhất so
với các hệ đệm trước. Đặc biệt tại pH=8,0 thì tín hiệu chất phân tích là tốt
nhất với đường nền ổn định. Do đó, để có thể so sánh tốt hơn kết quả khảo sát
phân tích đồng thời bốn carbapenem, điện di đồ ở pH=8,0 của tất cả các hệ
đệm được thể hiện trong hình 3.6.
Tris/ Lactic
20mV Arg/ Acs
Arg/ Lactic
Arg/ Ace
Tris/ Ace
Dori Mero Erta
Imi
200 400 600 800 1000
Hình 3.6: Điện di đồ phân tích bốn carbapenem (nồng độ 50ppm) sử dụng tại
pH=8 của các hệ đệm điện di khác nhau. Các điều kiện CE-C4
D khác: thế tách
20kV, mao quản silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ
dài hiệu dụng 50cm), thời gian bơm mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm
46

Từ hình 3.6, có thể thấy rằng so với các hệ đệm còn lại thì hệ đệm Tris/
Ace cho tín hiệu chất phân tích là lớn nhất nhưng đường nền vẫn đảm bảo ổn
định. Do đó, đệm Tris/Ace pH=8,0 được lựa chọn là hệ đệm tối ưu nhất cho
các khảo sát tiếp theo.
3.1.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm
Sau khi chọn được pH và thành phần của dung dịch đệm, nồng độ của
dung dịch đệm điện di cũng cần được khảo sát tối ưu. Trong phương pháp
điện di mao quản, nồng độ đệm phải đủ lớn để tạo nên môi trường điện ly cho
các ion di chuyểnvà không tạo ra các vùng dẫn điện khác nhau trong mao
quản làm ảnh hưởng đến quá trình di chuyển này. Qua tham khảo tài liệu [25,
27], nồng độ của các cấu tử trong dung dịch đệm điện di sử dụng trong
D thường lớn hơn 5 mM. Do đó, việc khảo sát được tiến
hành với các nồng độ từ 5mM trở lên, cụ thể là hệ đệm Tris/ Ace pH = 8,0 có
các nồng độ 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM và 50 mM. Các điều kiện khác
bao gồm:
- Hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ của doripenem 50,0 ppm;
meropenem 50,0 ppm; imipenem 50,0 ppm và ertapenem 50,0 ppm.
- Thế điện di 20kV, thời gian bơm mẫu 20s, chiều cao bơm mẫu 10cm
Các kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm điện di
được thể hiện trong hình 3.7 và bảng 3.6.
47

nhau
Nồng độ đệm 5mM 2,27 2,50 7,20
Nồng độ đệm 10mM 3,54 3,85 9,15
Nồng độ đệm 15mM 4,50 4,70 10,91
Nồng độ đệm 20mM 4,09 4,52 10,00
Nồng độ đệm 30mM 4,08 3,85 9,56
Nồng độ đệm 50mM - - -
5mM
20mV
10mM
20mM
Erta
MeroImi
Dori
30mM
50mM
0 200 400 600 800
Thêi gian di chuyÓn (s) .
Hình 3.7: Điện di đồ của các carbapenem (nồng độ 50ppm) khi thay đổi nồng
độ đệm. Các điều kiện CE-C4
D khác: thế tách 20kV, mao quản silica đường
kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm), thời
gian bơm mẫu 10s chiều cao bơm mẫu 10cm
48

Kết quả ở hình 3.7 cho thấy, khi càng tăng nồng độ đệm thì chất phân
tích sẽ di chuyển chậm hơn do nồng độ ion trong cột mao quản tăng. Với
nồng độ 5mM và 50mM thì pic rất bé hoặc không xuất hiện, nhưng trong
khoảng nồng độ đệm từ 10mM đến 30mM thỏa mãn được tín hiệu của tỷ lệ
tín hiệu/ đường nền tốt hơn so với ở nồng độ thấp. Với đường nền ổn định
cũng như thời gian di chuyển nhỏ hơn thì nồng độ đệm được chọn cho các
khảo sát tiếp theo là 10mM.
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu
Trong quá trình nạp mẫu vào mao quản, lượng mẫu hay vùng mẫu nạp
phải đủ lớn để đảm bảo đạt được độ nhạy tốt nhưng nếu vùng mẫu nạp vào
quá lớn thì sự phân tán (mở rộng vùng mẫu) sẽ xuất hiện mạnh do hiện tượng
khuếch tán làm giảm hiệu suất tách. Do đó, thời gian bơm mẫu hợp lý cũng
cần được khảo sát để đảm bảo thu được tín hiệu lớn nhất mà pic không bị giãn
rộng. Việc khảo sát thời gian bơm mẫu được thực hiện theo phương pháp thủy
động lực học kiểu xiphông ở độ cao 10cm với 4 giá trị thời gian bơm mẫu
khác nhau là 10s, 20s và 30s. Các điều kiện khảo sát khác như sau:
- Thế điện di 20kV, chiều cao bơm mẫu 10cm
49

10s
20mV
20s
Dori Imi Erta
Mero
30s
0 200 400 600 800 1000 1200
Hình 3.8: Điện di đồ của các carbapenem (nồng độ 50ppm) khi thay đổi thời
gian bơm mẫu. Các điều kiện CE-C4
D khác: thế tách 20kV, mao quản silica
đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng 50cm),
chiều cao bơm mẫu 10cm
nhau
Thời gian bơm mẫu 10s 4,05 4,15 12,08
Từ các kết quả khảo sát ở hình 3.8 có thể nhận thấy, khi tăng thời gian
bơm mẫu, thời gian di chuyển của các chất hầu như không thay đổi hoặc thay
50

đổi rất ít nhưng diện tích pic tăng tương ứng khi tăng thời gian bơm mẫu từ
10s đến 30s. Điều này hoàn toàn phù hợp vì khi tăng thời gian bơm mẫu sẽ
làm tăng lượng mẫu được bơm vào mao quản, tạo tín hiệu lớn hơn. Tuy nhiên,
khi thời gian bơm mẫu dài độ phân giải giữa các pic sẽ giảm và bên cạnh đó
với việc đối tượng mẫu là kháng sinh với hàm lượng hoạt chất lớn cùng với
đó là pic tạp cũng nhỏ cho nên thời gian bơm mẫu 20 s là phù hợp cho các
khảo sát tiếp theo.
3.1.4. Khảo sát chiều cao bơm mẫu
Để tránh hiện tượng khuếch tán vùng mẫu và làm doãn chân pic của
chất phân tích khi thời gian bơm mẫu tăng mà vẫn đưa lượng mẫu vào mao
quản được nhiều thì tăng chiều cao bơm mẫu là sự lựa chọn tốt nhất. Các
chiều cao bơm mẫu được lựa chọn để khảo sát là 5cm, 10cm, 15cm và 20cm.
- Thời gian bơm mẫu 20s, chiều cao bơm mẫu 10cm
51

5cm
20mV
10cm
15cm
20cm
Dori Imi
Erta
Mero
0 200 400 600 800 1000
chiều cao bơm mẫu. Các điều kiện CE-C4
D khác: thế tách 20kV, mao quản
silica đường kính trong 50µm, chiều dài mao quản 60cm (độ dài hiệu dụng
50cm), thời gian bơm mẫu 20s
Bảng 3.8: Độ phân giải của các cặp carbapenem khi thay đổi chiều cao bơm
mẫu
5 cm 4,24 4,39 12,76
10 cm 3,54 3,85 9,15
15 cm 3,31 3,52 8,67
20 cm 3,06 2,78 6,74
Khi tăng chiều cao bơm mẫu thì lượng mẫu vào mao quản càng lớn, do
đó có thể làm tăng độ nhạy chất phân tích của thiết bị. Thêm vào đó, với mục
52

Xác Định Đồng Thời Một Số Kháng Sinh Nhóm Carbapenem Bằng Phương Pháp Điện Di Mao Quản Sử Dụng Detector Đo Độ Dẫn Không Tiếp Xúc (Ce-C4d).doc

Xác Định Đồng Thời Một Số Kháng Sinh Nhóm Carbapenem Bằng Phương Pháp Điện Di Mao Quản Sử Dụng Detector Đo Độ Dẫn Không Tiếp Xúc (Ce-C4d).doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Xác Định Đồng Thời Một Số Kháng Sinh Nhóm Carbapenem Bằng Phương Pháp Điện Di Mao Quản Sử Dụng Detector Đo Độ Dẫn Không Tiếp Xúc (Ce-C4d).doc

Similar to Xác Định Đồng Thời Một Số Kháng Sinh Nhóm Carbapenem Bằng Phương Pháp Điện Di Mao Quản Sử Dụng Detector Đo Độ Dẫn Không Tiếp Xúc (Ce-C4d).doc (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (10)

Xác Định Đồng Thời Một Số Kháng Sinh Nhóm Carbapenem Bằng Phương Pháp Điện Di Mao Quản Sử Dụng Detector Đo Độ Dẫn Không Tiếp Xúc (Ce-C4d).doc