1. ΠΑΡΟΞΥΣΜΙΚΗ ΝΥΚΤΕΡΙΝΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΥΡΙΑ
(PNH) ΚΑΙ Η ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ
ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ
ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ
ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ
ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ
Πρακτική Άσκηση σε Ερευνητικό Κέντρο Υγείας
Νεοφύτου Χριστίνα
ΑΕΜ: 5683
Επόπτης Καθηγητής: Δροσοπούλου Ελένη, Επίκουρη Καθηγήτρια
Μονάδα Εκτέλεσης: «Θεαγένειο», Αντικαρκινικό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης , Αιματολογικό Εργαστήριο
Εκπαιδευτής Μονάδας: Δρ. Γιαννάκη Ευθαλία, Ειδικός Κυτταρομετρίας
Θεσσαλονίκη, 2015 © Warde Laboratory

2. Φορέας - Αιματολογικό Εργαστήριο Α.Ν.Θ. «Θεαγένειο»
Γενικές εξετάσεις αίματος
Ταχύτητας καθίζησης ερυθρών αιμοσφαιρίων (Τ.Κ.Ε.)
Πηκτικός μηχανισμός αίματος
Δοκιμασία G6PD
Μικροσκοπική παρατήρηση και αναγνώριση μορφολογικά παθολογικών κυττάρων του
αίματος
Κυτταρομετρία Ροής (Ανοσοφαινότυποι, τύποι Β- και Τ- λεμφωμάτων, ΧΛΛ, ΟΛΛ, ΜΔΣ, ΡΝΗ)

3. Θεωρητικό Μέρος - Εισαγωγή
Κυτταρομετρία Ροής (Flow Cytometry – FCM)
ΟΡΙΣΜΟΣ: μεθοδολογία μέτρησης και ανάλυσης σημάτων που παράγονται καθώς
μια μονήρης διάταξη σωματιδίων διέρχεται δια μέσου μιας φωτεινής δέσμης.
ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΡΑΞΗ: αυτοματοποιημένη μέθοδος ανάλυσης των φυσικοχημικών
χαρακτηριστικών κυττάρων και σωματιδίων σε δείγμα υπό τη μορφή
εναιωρήματος, με βάση τη σκέδαση της ακτίνας laser και τον φθορισμό
σημασμένων με φθοριοχρώματα μονοκλωνικών αντισωμάτων ή άλλων μορίων .
(www.bioinformin.net)

4. Εφαρμογές Κυτταρομετρίας Ροής
Ανοσοβιολογία
Λοιμωξιολογία
Ογκολογία
Ουρολογία
Νευρολογία
Μαιευτική και Γυναικολογία
Τομέας Μεταμοσχεύσεων, Αιμοδοσία
Αιματολογία (ανοσοφαινότυπος κ.ά.)
Διαγνωστική Ιατρική (πρόγνωση - πρόληψη αμέτρητων ασθενειών)
Έρευνα φαινοτύπου και λειτουργίας κυττάρων, μικροοργανισμών, οργανιδίων κυττάρων και
άλλων σωματιδίων που βρίσκονται σε εναιώρημα

5. Πλεονεκτήματα Κυτταρομετρίας Ροής
Παράμετροι Μοριακές τεχνικές Κυτταρομετρία Ροής
Ταχύτητα 2-3 μέρες (έως 1 εβδομάδα) 1-2 ώρες
Στόχος
DNA ή RNA (το RNA είναι
ασταθής στόχος)
Πρωτεΐνη ή κύτταρα, DNA,
RNA (τελικό προϊόν)
Εφαρμοσιμότητα Χρωμοσωμικές διαταραχές Ευρεία
Πολυπλοκότητα Απαιτητικές τεχνικές
Σχετικά εύκολη (έως 25 ή
και περισσότεροι έλεγχοι)
Ακρίβεια Ημι- Ποσοτική Ποσοτική
Εστίαση
Όλα τα κύτταρα του
δείγματος, εκτός και αν
προηγηθεί καθαρισμός
Οποιοσδήποτε
υποπληθυσμός
Απαιτήσεις
Ειδικά εργαστήρια (προ-
PCR, PCR, κλπ)
Τυπικό εργαστήριο (με
κυτταρομετρητή ροής)

6. Αρχές Λειτουργίας του Κυτταρομετρητή Ροής

7. Υδροδυναμικό σύστημα ροής (Fluidics)
(τροποποιημένο από Rahman, 2014)
υ=3000-10000 events/secBernoulli + υδροδυναμική εστίαση

8. Οπτικό Σύστημα (Optics)
(www.kyttarometria.gr)

9. Οπτικό Σύστημα (Optics)
(τροποποιημένο από www.laboratorysalud.com)
FS: Μέγεθος
και Σχήμα
SS: Κοκκίωση και Δομική
Πολυπολοκότητα

10. Ηλεκτρονικό Σύστημα Ανάλυσης Δεδομένων
(τροποποιημένο από Rahman, 2014)
Φωτεινά Σήματα ADCs Ψηφιακά Δεδομένα
(Ψαρρά et al., 2006)
Απεικόνιση
Αποτελεσμάτων:
Στικτογράμματα,
νεφελογράμματα,
ιστογράμματα

11. Αρχές Ανάλυσης Στικτογραμμάτων
• Οριοθέτηση
• Ανάλυση τεταρτημορίων
• Λογαριθμικοί άξονες
• Καθορισμός θετικότητας- ισοτυπικό δείγμα
• Compensation
jvi.asm.org/content/86/3/1307/F1.expansion.html
(info.ebioscience.com)
(Ψαρρά et al., 2006)
+/++/-
-/- -/+

12. Παροξυσμική Νυκτερινή Αιμοσφαιρινουρία (ΡΝΗ)
(what-when-how.com/proteomics/gpi-anchors-proteomics)(wellnessadvocate.com/?dgl=16717)
PIG-A
>180 μεταλλάξεις  Τύπου Ι
Τύπου ΙΙ (<10%)
Τύπου ΙΙΙ
(Devalet et al., 2015)

13. Επιπτώσεις της ΡΝΗ στην υγεία των ασθενών
μυϊκή δυστονία
πόνος στην κοιλιακή χώρα
στυτική δυσλειτουργία
αρτηριακή απόφραξη
μειωμένη παροχή αίματος στα νεφρά
αρτηριακή και πνευμονική υπέρταση
πνευμονικός εμβολισμός
ADP
Θρόμβωση (ηπατικές και
περιφερειακές φλέβες)  Ο
πιο συχνός λόγος θανάτου
των ασθενών ΡΝΗ (έως το 1/3)

14. Παρακολούθηση για την αντιμετώπιση των συμπτωμάτων
Ποσοστό του ΡΝΗ κλώνου > 10%  Αιμοκάθαρση, μεταγγίσεις
Οξεία αιμολυτικά επεισόδια  κορτικοστεροειδή και ανδρογόνα
Λήψη συμπληρωμάτων σιδήρου για ερυθροποίηση
Θρομβωτικά επεισόδια  αντιπηκτικά, π.χ. warfarin (>50% GPI-ανώμαλα κοκκιοκύτταρα)
μεταμόσχευση βλαστοκυττάρων και μυελού των οστών  απαλλαγή από τον ΡΝΗ κλώνο
Eculizumab
Θεραπευτική προσέγγιση της ΡΝΗ
(Devalet et al., 2015)

15. Οδηγίες της International Clinical Cytometry Society (ICCS)
Περιφερικό αίμα του ασθενούς (όχι μετάγγιση αίματος για τουλάχιστον έναν μήνα). Δείγμα
μυελού των οστών  ψευδώς θετικά (στάδιο ωρίμανσης και διαφοροποίησης)
Τουλάχιστον δύο κυτταρικοί πληθυσμοί για δείκτες σχετικούς με την ύπαρξη GPI-μορίων,
(ερυθροκύτταρα και ουδετερόφιλα, ΌΧΙ αιμοπετάλια)
Τουλάχιστον δύο αντιγόνα επιφανείας στα ερυθροκύτταρα (κατά προτίμηση CD59 και
CD235a)  ΡΝΗ κλώνος (ΙΙΙ, ΙΙ) > 3% για 2 δείκτες (ή > 30% για έναν)
Διαγνωστική προσέγγιση της ΡΝΗ – Η σημασία της Κυτταρομετρίας Ροής
Κυτταρομετρία
ροής
The Gold Standard

16. Υλικά και Μέθοδοι
Ερυθροκύτταρα (RBCs)
10 μl
+ PBS alb + PBS alb
Δείγμα
προς
διερεύνηση
Ανάλυση κατά προτίμηση αμέσως
Επώαση 10 min με CD235a-FITC και CD59-PE στο σκοτάδι
πλύση

17. Λευκοκύτταρα (WBCs)
Σωληνάριο
Μονοκλωνικά αντισώματα -
Φθοριοχρώματα
Χρησιμότητα
Α
FLAER - Alexa Fluor 488 GPI - AP
CD59-PE GPI - AP
CD33-PC5 Μονοπύρηνα
CD14-PC7 GPI - AP
CD45-APC-Cy750 Λευκοκύτταρα
Β
CD66b-FITC GPI - AP
CD24-PE GPI – AP
CD15-PC5 Ουδετερόφιλα
CD16-PC7 GPI - AP
CD45-APC-Cy750 Λευκοκύτταρα
Απευθείας
επώαση με τα
μονοκλωνικά
αντισώματα
Διάλυμα λύσης
ερυθροκυττάρων Ανάλυση

18. Αποτελέσματα
Ερυθροκύτταρα (RBCs)
89 δείγματα  4 υποψήφια για ΡΝΗ  Όλα αρνητικά (θετικά από UK NEQAS ΡΝΗ scheme)
CD59 PE
SSC
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
Gate 1
0.02 %
Gate 2
0.01 %
CD59 PE
SSC
10
1
10
2
10
3
10
4
10
510
1
10
2
10
3
10
4
10
5
Gate 1
1.87%
Gate 2
3.67%
CD59 PE
CD235aFITC
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5 0.03% 99.97%
0.00% 0.00%
CD59 PE
CD235aFITC 10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
1
10
2
10
3
10
4
0.78 % 98.07%
0.01 % 1.14 %
CD59 PE
Count
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
0
103
206
308
411
M2
M1
0.00%
Μ

19. Λευκοκύτταρα (WBCs)
CD66b FITC
CD24PE
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
0.01% 98.87%
1.07% 0.05%
CD66b FITC
CD16PC7
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
1
10
2
10
3
10
4
0.02% 97.20%
1.05% 1.72%
FLAER
CD14PC7
10
1
10
2
10
3
10
4
10
510
1
10
2
10
3
10
4
0.05% 79.75%
3.39% 16.81%
FLAER FITC
CD59PE
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
1
10
2
10
3
10
4
0.02%0.01%
96.34 %3.62%
FLAER
CD59PE
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
3.87% 91.77%
0.00% 4.36%
Α Β
Γ Δ Ε
FLAER
CD59PE
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
1
10
2
10
3
0.91%0.00%
99.08%0.01 %
FLAER
CD14PC7
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
1
10
2
10
3
10
4
0.01 % 99.83 %
0.00 % 0.16 %
FLAER
CD59PE
10
1
10
2
10
3
10
4
10
510
1
10
2
10
3
1.29 %
0.30%0.00%
97.85%1.85%
POLY
CD66b FITC
CD24PE
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
2
10
3
10
4
0.02%0.00%
99.85%0.13%
CD66b FITC
CD16PC7
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
0.04 % 99.94 %
0.00 % 0.02 %
Α Β
Γ Δ Ε

20. Συζήτηση - Συμπεράσματα
Η Κυτταρομετρία ροής αποτελεί μία μέθοδο συνεχώς εξελισσόμενη, της οποίας οι
δυνατότητες και οι εφαρμογές επεκτείνονται σε διάφορα επιστημονικά πεδία
Η Κυτταρομετρία ροής δίνει τη δυνατότητα ταχείας και άμεσης διάγνωσης της ΡΝΗ,
καθώς επίσης και του διαχωρισμού της από ασθένειες με παρόμοια συμπτώματα, γι’
αυτό και έχει καθιερωθεί ως μέθοδος αναφοράς (gold standard) από την ICCS
Η Κυτταρομετρία ροής παρουσιάζει, σχετικά με τις μοριακές μεθόδους, πολυάριθμα
πλεονεκτήματα
Η Κυτταρομετρία ροής είναι σημαντική προσθήκη στην εργαλειοθήκη του ερευνητή
και του κλινικού ιατρού/βιολόγου
Το μέλλον στη διάγνωση και τον έλεγχο της ΡΝΗ είναι άρρηκτα συνδεδεμένο με την
Κυτταρομετρία ροής (CRISPR-Cas9 σε μακάκους Rhesus, για την δημιουργία ζωικού
μοντέλου knock-out για το PIG-A)

21. Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας