1. ΔΗΜΟΚΡΙΤΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΡΑΚΗΣ
Σχολή Επιστημών Γεωπονίας & Δασολογίας
ΤΜΗΜΑ ΑΓΡΟΤΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ
Πρόγραμμα μεταπτυχιακών σπουδών
“Αειφορικά συστήματα παραγωγής & περιβάλλον στη γεωργία”
Καραθάνου Αλεξάνδρα
Επιβλέπων καθηγητής: Κυμπάρης Αθανάσιος
Αναπληρωτής Καθηγητής
Ορεστιάδα 2016
Τίτλος Μεταπτυχιακής Μελέτης :
Έλεγχος της βιοδραστικότητας εκχυλισμάτων ειδών Σιδερίτη
διαφορετικής γεωγραφικής προέλευσης

2. 2
“Η δε μελέτη φύσεως αγαθά πλείονα δωρείται”
Επίχαρμος,530-440 π.Χ.,
Αρχαίος Έλληνας ποιητής από την Κω

3. 3
Eισαγωγή
Γένος Sideritis (οικ.Lamiaceae)
➔ περιλαμβάνει περισσότερα από 150 είδη
➔Απαντάται σε εύκρατες & τροπικές περιοχές
(κυρίως Μεσόγειο & Κανάρια νησιά)
➔Το όνομα προέρχεται από την ελληνική λέξη σίδηρος εξαιτίας της ικανότητας
του να θεραπεύει πληγές που προκαλούνταν από σιδερένια αντικείμενα
➔η ονομασία του οφείλεται στο σχήμα των δοντιών του κάλυκα, που μοιάζουν με αιχμή λόγχης
➔Χρήσεις & δράση στη λαϊκή ιατρική
υπό μορφή αφεψημάτων ή εγχυμάτων ως"τσάι του βουνού"
αντι-φλεγμονώδη, αντι-ελκογενή και αντιμικροβιακές ιδιότητες

4. 4
Αυτοφυή ελληνικά είδη
Sideritis raeseri Boiss.& Heldr. (τσάι Παρνασσού)
Sideritis clandestine Chaud. & Borry (τσάι Ταΰγέτου)
Sideritis scardica Griseb. (τσάι Ολύμπου)
Sideritis euboa Heldr. (τσάι Ευβοίας)
Sideritis athoa Papan. & Kokkini (τσάι Άθω )
Sideritis syriaca L. ( μαλοτήρα)

5. 5
–Τσάι του βουνού Ιδιότητες
➔
μη διεγερτική δράση και μπορεί άνετα να καταναλώνεται και το
βράδυ πριν τον ύπνο
➔
ευεργετικές επιδράσεις στα κρυολογήματα και τις φλεγμονές του
ανώτερου αναπνευστικού συστήματος
➔
καταπολέμηση της δυσπεψίας και των γαστρεντερικών
διαταραχών, αντισπασμωδικό, αναλγητικό και επουλωτικό

6. 6
Ελεύθερες ρίζες
Σωματίδια που υπάρχουν ανεξάρτητα και περιέχουν ένα ή περισσότερα
ασύζευκτα ηλεκτρόνια
Επηρεάζουν το γήρας & τις εκφυλιστικές ασθένειες του γήρατος
Ο σχηματισμός τους μπορεί να περιοριστεί από ουσίες
με αντιοξειδωτική δράση
Προσβάλλουν τα υγιή κύτταρα απώλεια δομής & λειτουργίας

7. 7
Αντιοξειδωτικά -Τρόπος δράσης
●
μεταφορά ηλεκτρονίου από τη φαινολική ένωση ή από το φαινολικό ανιόν προς την
ελεύθερη ρίζα (μέθοδος αντίδρασης μεταφοράς ηλεκτρονίου-ET)
ArO ArO∙ + DPPH∙ ArO∙+ DPPH-H→ →
Μηχανισμός δράσης του DPPH

8. 8
Αντιοξειδωτικά- Ιδιότητες
➔
Παρεμπόδιση των αντιδράσεων των ελεύθερων ριζών
➔
Καθυστέρηση ή παρεμπόδιση της οξείδωσης του
υποστρώματος (πρωτεΐνες, DNA, κυτταρική μεμβράνη)
➔
Πρόληψη αλλοιώσεων που προκύπτουν από την
υπερπαραγωγή των ενεργών ειδών οξυγόνου και αζώτου
➔
Χρήσιμος «δείκτης» για την βιοδραστικότητα ενός
εκχυλίσματος

9. 9
Φαινολικές ενώσεις
➔
Φυσικά συστατικά
➔
Μόριο : περιέχει τουλάχιστον έναν αρωματικό δακτύλιο με ένα ή
περισσότερα υποκατεστημένα υδροξύλια
➔
Απλές μονοκυκλικές φαινόλες και φαινολικά οξέα
➔
Φαινυλοπροπανοειδή
➔
Φαινολικές κινόνες
➔
Φλαβονοειδή
➔
πολυφαινόλες

10. 10
Βιοδιαθεσιμότητα - Τι είναι ?
✔
το ποσοστό των φαινολικών συστατικών που απορροφάται και αξιοποιείται από
τον οργανισμό, αποθηκευμένο στους διάφορους ιστούς
✔
Απορρόφηση Πολυφαινολών στο λεπτό έντερο ή κόλον και εξαρτάται από :→
• Χημική δομή
• Βαθμό γλυκοζυλίωσης
• Μοριακό βάρος
• ∆ιαλυτότητα
✔
Οι ουσίες με ευεργετική δράση στον άνθρωπο “επιβιώνουν” μετά από το πέρασμα
από τις συνθήκες στομάχου?

11. 11
Σκοπός
Έλεγχος υδατικών εκχυλισμάτων ειδών Σιδερίτη :
– Ολικών φαινολικών συστατικών
– Αντιοξειδωτικής ικανότητας
Έλεγχος υδρολυμένων εκχυλισμάτων (προσομοίωση όξινου
περιβάλλοντος ανθρώπινου στομάχου)-έλεγχος βιοδιαθεσιμότητας
– Ολικών φαινολικών συστατικών
– Αντιοξειδωτικής ικανότητας
Ποιοτικός προσδιορισμός υδατοδιαλυτών συστατικών σε
υδρολυμένα και μη υδρολυμένα εκχυλίσματα

12. 12
Υλικά & Μέθοδοι

13. 13
Φυτικό Υλικό
A/A Κωδικό Όνομα Προέλευση Είδος (taxa)
1 SD1 Αρμανίτσα(Πρέβεζα)
Sideritis raeseri Boiss. &
Heldr. subsp. raeseri
2 SD2 Όλυμπος Sideritis scardica Griseb.
3 SD3 Ιεράπετρα(Κρήτη)
Sideritis syriaca
L.subsp.Syriaca
4 SD4 Δίρφυς(Εύβοια) Sideritis euboea Heldr.
5 SD5 Αλωνίτσα(Αρκαδία)
Sideritis clandestina subsp.
peloponnesiaca

14. 14
μΠειρα ατική Διαδικασία

15. 15
0 20 40 60 80 100 120 140
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
ΚΑΜΠΥΛΗ ΑΝΑΦΟΡΑΣ
Folin-Ciocalteu
Συγκέντρωση (mg καφεϊκού οξέος/ml)
Απορρόφηση
μΠροσδιορισ ός ολικών φαινολικών συστατικών
Πρότυπες Καμπύλες
f(x) = 0,0092527671x + 0,0078229053
R² = 0,9986379353

16. 16
Πρότυπες Καμπύλες
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
DPPH
Συγκέντρωση Trolox (μM)
Παρεμπόδιση%
Μέτρηση αντιοξειδωτικής
ικανότητας με DPPH
Μέτρηση αντιοξειδωτικής
ικανότητας με DPPH
2,2 διφαινυλ-πικρυλ-υδραζίλιο
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0
20
40
60
80
100
120
ABTS
Συγκέντρωση trolox (μΜ)
Παρεμπόδιση%
Μέτρηση αντιοξειδωτικής
ικανότητας με ABTS
Μέτρηση αντιοξειδωτικής
ικανότητας με ABTS
2,2΄- αζινοδι (3-αιθυλβενζοδιαζολινο-
6-σουλφονικό οξύ)
f(x) = 2,2435584416x + 12,1153896104
R² = 0,9818809429
% Παρεμπόδιση = [(Α0
-Α)/Αo
] *100

17. 17
Ποιοτικός Προσδιορισμός Φαινολικών Συστατικών
sd1 sd2 sd3 sd4 sd5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
FOLIN-CIACALTEU
CA(mg/ml)
Ποιοτικός προσδιορισμός φαινολικών συστατικών των μη υδρολυμένων εκχυλισμάτων με την μέθοδο Folin-Ciocalteu
sd1 sd2 sd3 sd4 sd5
0
5
10
15
20
25
30
25.53
24.35 24.71
18.77
23.08
ΥΔΡΟΛΥΣΗ
CA(mg/ml)
Ποιοτικός προσδιορισμός φαινολικών συστατικών των υδρολυμένων εκχυλισμάτων με την μέθοδο Folin-Ciocalteu
62,99
71,76
60,26
50,19
70
SD1-S.raeseri,SD2-S.scardica,SD3- S.syriaca,SD4-S.euboea,SD5-S.clandestina

18. 18
Αποτίμηση Αντιοξειδωτικής Δράσης (DPPH)
sd1 sd2 sd3 sd4 sd5
0
500
1000
1500
2000
2500
DPPH
Λυοφιλιωμένα
Trolox(μΜ)
Αντιοξειδωτική ικανότητα μη υδρολυμένων εκχυλισμάτων με την μέθοδο DPPH σε μΜ Trolox
SD1 SD2 SD3 SD4 SD5
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
DPPH
ΥΔΡΟΛΥΣΗ
Trolox(μΜ)
Αντιοξειδωτική ικανότητα μετά την υδρόλυση εκχυλισμάτων με την μέθοδο DPPH σε μΜ Trolox
2160,91 2094,13
1798,97
1225,25
2019,6
2477,44
2984,53
2069,28
1621,6
2600,8
SD1-S.raeseri,SD2-S.scardica,SD3- S.syriaca,SD4-S.euboea,SD5-S.clandestina

19. 19
Αποτίμηση Αντιοξειδωτικής Δράσης (ABTS)
sd1 sd2 sd3 sd4 sd5
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
ΑΒΤS
Λυοφιλιωμένα
Trolox(μΜ)
SD1 SD2 SD3 SD4 SD5
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
ΑΒΤS
ΥΔΡΟΛΥΣΗ
Trolox(μΜ)
Αντιοξειδωτική ικανότητα μη υδρολυμένων εκχυλισμάτων με την μέθοδο ABTS σε μΜ Trolox
Αντιοξειδωτική ικανότητα μετά την υδρόλυση εκχυλισμάτων με την μέθοδο ABTS σε μΜ Trolox
3762,101
3282,498 3076,102
2468,84
3307,552
3320,71
3036,05 3131,58
2496,02
3043,03
SD1-S.raeseri,SD2-S.scardica,SD3- S.syriaca,SD4-S.euboea,SD5-S.clandestina

20. 20
ΣΥΣΧΕΤΙΣΜΟΣ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ-
ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ
45 50 55 60 65 70 75
0
500
1000
1500
2000
2500
FOLIN-DPPH
mg CA /ml
μMTROLOX
60 65 70 75 80 85 90 95 100
0
1000
2000
3000
4000
5000
FOLIN-ABTS
mg CA /ml
μMTROLOX
Σχέση όλων των μεθόδων: θετική
και γραμμική
Υψηλό φαινολικό περιεχόμενο
υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα
f(x)= 38,54x -570,5
R2
=0,76

21. 21
Ποιοτικός Προσδιορισμός LC /DAD/ESI-MS
Πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης
Η στατική φάση αποτελείται από SUPELCO (DISCOVERY HS C18) με
πορώδες 5μm, μήκος 250 mm, εσωτερική διάμετρο 4,6mm

22. 22
Σύγκριση Υγρού Χρωματογραφήματος (HPLC)Υγρό χρωματογράφημα στα 250,280,300 & 330 nm
(Μη υδρολυμένα δείγμα Σιδερίτη)

23. 23
Σύγκριση Υγρού Χρωματογραφήματος (HPLC)
Σύγκριση Υγρού χρωματογραφήματος Sideritis raeseri,
μη Υδρολυμένο και Υδρολυμένο στα 300nm

24. 24
Σύγκριση Αέριου Χρωματογραφήματος (HPLC)Σύγκριση Υγρού χρωματογραφήματος μη υδρολυμένων δειγμάτων
SD1,SD2,SD3,SD4 &SD5 στα 300nm
lavandulifolioside

25. 25
Σύγκριση Αέριου Χρωματογραφήματος (HPLC)
Σύγκριση Υγρού χρωματογραφήματος υδρολυμένων δειγμάτων
SD1,SD2,SD3,SD4 &SD5 στα 300nm
lavandulifolioside
lavandulifolioside

26. 26
Ταυτοποίηση φαινολικών συστατικών με LC/DAD/ESI-MS
Υγρό χρωματογράφημα Sideritis scardica στα 300 nm
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

27. 27
Χημικές δομές φαινολικών ενώσεων

28. 28
Φάσμα από Sideritis scardica Griseb.

29. 29
Προσδιορισμός των φαινολικών ενώσεων S.scardica
Είδος ένωσης Όνομα ουσίας Χρόνος Έκλουσης Εμβαδόν %
παράγωγα υδροξυκινναμωμικού
οξέως χλωρογενικό οξύ 13,504 6,0250
Φαινυλο αιθανοϊκός γλυκοζίτης λαβαντουλιφολιοσίδιο 23,338 3,2410
Μη ακετυλιωμένη φλαβονοειδή 7-
Ο-αλλοσυλο(1→2)γλυκοζίτες
ισοσκουτελλαρενιο 7-O-
αλλοσυλο(1→2) γλυκοζίτη
28,104 2,8061
3'-Ο-μεθυλ χιπολατενιο7-Ο-
αλλοσυλο (1→2) γλυκοζίτη
29,201 4,8050
Ακετυλιωμένο φλαβονοειδή7-Ο-
αλλοσυλο(1→2)γλυκοζίτες
ισοσκουτελλαρενιο7-O-[6''' -O-
ακετυλο]-αλλοσυλο(1→2)γλυκοζίτη
32,716 8,5927
4'-Ο-μεθυλ χιπολατενιο 7-Ο-[6'''-Ο-
ακετυλ] -αλλοσυλο (1→2) γλυκοζίτη
33,191 12,0175
4'-Ο-μεθυλ ισοσκουτελλαρενιο 7-Ο-
[6'''-Ο-ακετυλ] -αλλοσυλο (1→2)
γλυκοζίτη
41,130 5,2411
Άλλο
Απιγενίνη 7-(4''-π-
κουμαρογλυκοζιδιο)
41,498 2,1744
Ακετυλιωμένο φλαβονοειδή7-Ο-
αλλοσυλο(1→2)γλυκοζίτης
4'-Ο-μεθυλοχιπολατενιο 7-Ο-[6'''-Ο-
ακετυλ]-αλλοσυλο-(1→2)-[6'''-O-
ακετυλο] -γλυκοζίτη
43,524 6,3606
4'-Ο-μεθυλ ισοσκουτελλαρενιο 7-Ο-
[6'''-Ο-ακετυλ] -αλλοσυλο (1→2)
γλυκοζίτη
50,870 1,9399

30. 30
Συμπεράσματα
Φαινολικά συστατικά – αντιοξειδωτική ικανότητα
Μεγάλη περιεκτικότητα σε φαινολικά & ισχυρή Α.Ι στα εκχυλίσματα Sideriti
Η μεταξύ τους σχέση είναι θετική και γραμμική
Προσδιορισμός ολικού φαινολικού περιεχομένου με την μέθοδο Folin-ciocalteu
Μη υδρολυμένα εκχυλίσματα
S.scardica & S.clandestina την μεγαλύτερη περιεκτικότητα φαινολικών
Υδρολυμένα εκχυλίσματα
S.raeseri & S.syriaca την υψηλότερη περιεκτικότητα

31. 31
Συμπεράσματα
Προσδιορισμός αντιοξειδωτικής δράσης
Μη υδρολυμένα εκχυλίσματα
DPPH + ABTS:S.raeseri & S.scardica την υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση
Υδρολυμένα εκχυλίσματα
DPPH : Sideritis scardica
ABTS :S.raeseri & S.syriaca έχουν την υψηλότερη Α.Ι.

32. 32
Συμπεράσματα
Συμπεράσματα
Ποιοτικός προσδιορισμός των φαινολικών συστατικών με Υγρή
Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (LC/DAD/ESI-Ms)
στα 300 nm διακρίνονται όλες οι κορυφές
παρόμοια ποιοτική αποτίμηση σε όλα τα δείγματα υδρολυμένων & μη
αφθονία των κορυφών μειώνεται μετά την υδρόλυση

33. 33
Συμπεράσματα
✔
προσέγγιση μετά την επεξεργασία της υδρόλυσης στα
εκχυλίσματα δεν επηρεάζει την αντιοξειδωτική
ικανότητα (in vitro)
✔
Περαιτέρω έρευνα in vivo

34. 34
ΩΕΥΧΑΡΙΣΤ ΠΟΛΥ
ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΣΟΧΗ
!!!ΣΑΣ