1. Συνθήκες ανάπτυξης του μικροοργανισμού
Οι μικροοργανισμοί αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό μέσο Nutrient Broth (NB)
σε αναερόβιες συνθήκες και περιστροφική κίνηση (130 rpm) και το Cr(VI)
προστέθηκε υπό μορφή K2Cr2O7, όπου ήταν απαραίτητο.
Η ευρεία βιομηχανική χρήση του χρωμίου το έχει κατατάξει ως έναν από τους πλέον σημαντικούς ρυπαντές των φυσικών οικοσυστημάτων. Η χρήση μικροοργανισμών με σκοπό την
απομάκρυνση των ρυπογόνων ουσιών, όπως το χρώμιο, βρίσκει όλο και μεγαλύτερη αποδοχή, καθώς υπάρχουν πολλά πλεονεκτήματα που ενθαρρύνουν την εφαρμογή της ως
μέθοδο βιοαπορρύπανσης. Συγκεκριμένα, έχουν βρεθεί μικροοργανισμοί, ανάμεσά τους και πολλά είδη σιδηροβακτηρίων, οι οποίοι διαθέτουν μηχανισμούς ανοχής ενάντια στο
τοξικό Cr(VI), αλλά και αποτοξικοποίησης του μετάλλου μέσω της αναγωγής του σε Cr(ΙΙΙ). Οι μηχανισμοί με βάση τους οποίους οι μικροοργανισμοί αυτοί είναι ικανοί να ανέχονται,
αλλά και να ανάγουν το Cr(VI) περιλαμβάνουν: α) το ισχυρό κυτταρικό τοίχωμα, το οποίο παρεμποδίζει την είσοδο των ιόντων του μετάλλου στο εσωτερικό των βακτηριακών
κυττάρων, β) την ύπαρξη χημειοσμωτικών αντλιών για την έξοδο των ιόντων του μετάλλου από τα βακτηριακά κύτταρα, γ) την ενζυμική αναγωγή του Cr(VI) σε Cr(III), δ) μηχανισμούς
ομοιόστασης στο σίδηρο καθώς και στο οξειδωτικό stress, που προκαλείται από την παραγωγή ενεργών μορφών οξυγόνου (ROS) κατά την αναγωγή τουCr(VI) και ε) την ύπαρξη
επιδιορθωτικών μηχανισμών βλαβών του DNA, οι οποίες προκαλούνται από την έκθεση σε υψηλές συγκεντρώσεις Cr(VI). Το στέλεχος Β1 (Εικόνα 1., Πίνακας 1.), το οποίο
απομονώθηκε από φυσική υδάτινη πηγή, πλούσια σε σίδηρο, ταυτοποιήθηκε ως Achromobacter xylosoxidans και είναι ικανό να ανέχεται έως και 500 mg/L Cr(VI), ενώ ανάγει έως
και 100 mg/L Cr(VI) σε διάστημα 72 ωρών. Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας του στελέχους Β1, καθώς και οι βέλτιστες
συνθήκες (θερμοκρασία, pH, αρχική βιομάζα μικροοργανισμού) για την αποτελεσματική αναγωγή του Cr(VI) από το μικροοργανισμό. Στο βακτηριακό στέλεχος Β1 διερευνήθηκε
επίσης η παρουσία γονιδίων που σχετίζονται με τους μηχανισμούς ανθεκτικότητας-αποτοξικοποίησης του Cr(VI).
ΟΜΟΙΟΣΤΑΣΗ ΣΤΟ ΣΙΔΗΡΟ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ
ΑΝΑΓΩΓΗΣ ΤΟΥ Cr(VI) ΑΠΟ ΤΟ Achromobacter xylosoxidans (ΣΤΕΛΕΧΟΣ B1)
Νεοφύτου Χ., Μερτζανίδου Μ., Σάκουλα Δ., Κωνσταντινίδης Δ., Σκούρας Ζ. και Γιάγκου Μ.
Εισαγωγή
Υλικά και Μέθοδοι
Εικόνα 1. Η πηγή από την οποία απομονώθηκε το βακτηριακό
στέλεχος Β1 (α), η χρώση κατά Gram για το στέλεχος Β1 (β) και η
δημιουργία συσσωμάτων σε υγρές καλλιέργειες του στελέχους
Β1 σε ΝΒ.
Αποτελέσματα
Συζήτηση
Εκτίμηση της in vitro Ενζυμικής Δραστικότητας
Οι μικροοργανισμοί καλλιεργήθηκαν σε 250 ml NB παρουσία 50 mg/L
Cr(VI) στους 25οC για 72 ώρες. Τα κύταρα του στελέχους Β1
συλλέχθησαν με φυγοκέντρηση και επαναιωρήθηκαν σε Phosphate
Buffer. Προκλήθηκε λύση των βακτηριακών κυττάρων με χρήση
υπερήχων (20 κύκλοι 15 sec 14.000 Hrz) και συλλογή κυτταρικού
εκχυλίσματος (CFE) και κυτταρικών τοιχωμάτων (CWE). Τα δείγματα
αραιώθηκαν έως 1:128, επωάσθηκαν στους 30οC για 30 λεπτά παρουσία
1,8 mg Cr(VI) και υπολογίσθηκε η εναπομείνουσα ποσότητα Cr(VI).
Απομόνωση DNA και ενίσχυση γονιδίων
Για τη διερεύνηση ύπαρξης γονιδίων, τα οποία σχετίζονται με
μηχανισμούς ανθεκτικότητας – αποτοξικοποίησης του Cr(VI),
απομονώθηκε το ολικό γονιδιωματικό DNA του μικροοργανισμού με βάση
το πρωτόκολλο αλκαλικής λύσης και χρησιμοποιήθηκε στην αλυσιδωτή
αντίδραση της πολυμεράσης (PCR). Στην PCR χρησιμοποιήθηκαν ειδικοί
ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές για την ανίχνευση τμημάτων των γονιδίων:
(α) recA, (β) yieF, (γ) chrA, (δ) chrC και (ε) ruvB.
Καμπύλες ανάπτυξης του και αποτοξικοποίησης Cr(VI)
Η ανάπτυξη του στελέχους Β1 στις διάφορες συγκεντρώσεις Cr(VI),
ελέγχθηκε με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των καλλιεργειών στα 630
nm, ενώ η αναγωγή του Cr(VI) σε Cr(III) ελέγχθηκε με τη μέθοδο του 1,5-
διφαινυλκαρβαζιδίου. Επιπρόσθετα, οι βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης και
αναγωγής του Cr(VI) από τον μικροοργανισμό προσδιορίστηκαν μέσω
ανάπτυξης κυττάρων του στελέχους σε καλλιέργεια με υψηλή αρχική
βιομάζα μικροοργανισμού, σε θερμοκρασία 30ΟC και σε τιμές pH 6-12.
Εικόνα 2. Καμπύλη ανάπτυξης του βακτηριακού στελέχους B1
παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων Cr(VI), με υψηλή αρχική
βιομάζα μικροοργανισμού.
0 8 24 48 72 96 120
50
100
200
400
50 mg/L
100 mg/L
200 mg/L
400 mg/L
Cr(VI)mg/L
Χρόνος (ώρες)Χρόνος (ώρες)
0 8 24 48 72 96 120
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5 control
50 mg/L
100 mg/L
200 mg/L
400 mg/L
O.D.630nm
Εικόνα 3. Καμπύλη αναγωγής διαφορετικών συγκεντρώσεων Cr(VI)
από τα κύτταρα του βακτηριακού στελέχους Β1 με υψηλή αρχική
βιομάζα μικροοργανισμού.
Πίνακας 2. Τα γονίδια που σχετίζονται με τους μηχανισμούς
ανοχής – αποτοξικοποίησης Cr(VI) και το αποτέλεσμα της
ενίσχυσής τους στο στέλεχος Β1.
Εικόνα 4. Καμπύλη ανάπτυξης του βακτηριακού στελέχους B1
παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων Cr(VI), σε θερμοκρασία
30οC.
Εικόνα 8. Εκτίμηση της in vitro ενζυμικής δραστικότητας στο
κυτταρικό εκχύλισμα και στο κυτταρικό τοίχωμα των κυττάρων του
στελέχους Β1.
control
50 mg/L
100 mg/L
200 mg/L
400 mg/L
0 8 24 48 72 96 120
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Χρόνος (ώρες)
O.D.630nm
50 mg/L
100 mg/L
200 mg/L
400 mg/L
100
200
400
Cr(VI)mg/L
0 8 24 48 72 96 120
50
Χρόνος (ώρες)
Πίνακας 1. Χαρακτηριστικά του βακτηριακού στελέχους B1.
Χαρακτηριστικά του στελέχους B1
Μορφολογικά Αποικίες
Μέγεθος Μικρές
Χρώμα Αδιαφανείς
Βιοχημικά
Σχήμα Ράβδος
Χρώση κατά Gram -
Παραγωγή οξειδάσης +
Παραγωγή καταλάσης +
Υδρόλυση ζελατίνης -
Παραγωγή πηκτινασών του πλάσματος -
Θερμοκρασία Ανάπτυξης
Ανάπτυξη στους 37οC +
Ανάπτυκη στους 30οC ++
Ανάπτυξη στους 25ο C +
Θρεπτικά Μέσα Ανάπτυξης
Αποστειρωμένο νερό πηγής +
Αποστειρωμένο νερό πηγής και NB ++
Δις - απεσταγμένο νερό και NB +++
Δις - απεσταγμένο νερό και NB +++
Δις - απεσταγμένο νερό και NB ++
Βαθμός Συσσωμάτωσης
+++
Εικόνα 6. Καμπύλη ανάπτυξης του βακτηριακού στελέχους B1 σε
διαφορετικές τιμές της κλίμακας pH.
Αραίωση δείγματος (log2)
Cr(VI)mg/αντίδραση
0 4 8 16 32 64
0,6
1,2
1,8 CFE
CWE
control
Κρίνεται απαραίτητη η περαιτέρω διερεύνηση του
μικροοργανισμού, ως πιθανό μέσο για τη διαχείριση και
βιοαπορρύπανση λυμάτων επιβεβαρυμμένων με Cr(VI).
Η ανάπτυξη του βακτηριακού στελέχους Β1 στους 30οC (Εικόνα 2.)έχει ως
αποτέλεσμα την επιτάχυνη της αναγωγικής ικανότητας Cr(VI) σε
συγκεντρώσεις έως 200 mg/L και την αναγωγή της συγκέντρωσης των
400 mg/L Cr(VI) σε βαθμό 50% (Εικόνα 3.). Το στέλεχος Β1 έχει την
ικανότητα να ανέχεται (Εικόνα 4.) και να αποτοξικοποιεί το Cr(VI) σε
μεγάλο εύρος τιμών της κλίμακας pH (7-10) (Εικόνα 5.), με την βέλτιστη
τιμή να είναι το 7. Δεν παρουσιάστηκε σημαντική μεταβολή στο ρυθμό
αποτοξικοποίησης Cr(VI) από τη μεταβολή στην τιμή της κλίμακας pH
(Εικόνα 5.). Δεν κατέστη δυνατή η ανίχνευση και απομόνωση γονιδίων
που σχετίζονται με τους μηχανισμούς ανοχής – αποτοξικοποίησης Cr(VI)
(Πίνακας 2.). Παρ’ όλα αυτά, ανιχνεύθηκε in vitro δραστικότητα, τόσο στο
κυτταρικό εκχύλισμα, όσο και στο κυτταρικό τοίχωμα των κυττάρων του
στελέχους Β1, ενζύμων ικανών να ανάγουν το Cr(VI) (Εικόνα 8.).
• Έπειτα από βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας του
μικροοργανισμού (χαμηλή αρχική βιομάζα, 30οC, pH 7), η
αποτελεσματικότητα της αναγωγής συγκεντρώσεων έως και 200 mg/L
Cr(VI) διπλασιάστηκε. Στις προαναφερθείσες συνθήκες, το στέλεχος Β1
παρουσιάζει επίσης την ικανότητα να ανάγει κατά 50% 400 mg/L Cr(VI).
• Δεν ήταν δυνατή η ανίχνευση και απομόνωση γονιδίων που σχετίζονται
με τους μηχανισμούς ανοχής – αποτοξικοποίησης Cr(VI) μέσω PCR.
• Η in vitro ενζυμική δραστικότητα έδωσε θετικό αποτέλεσμα για το
κυτταρικό εκχύλισμα αλλά και για τα κυτταρικά τοιχώματα των κυττάρων
του στελέχους Β1, υποδεικνύοντας την πιθανή ύπαρξη της
οξειδορεκτουδάσης του Cr(VI) Kλάσης Ι και της υπεροξειδικής
δισμουτάσης (SOD) στο κυτταρόπλασμα και στο κυτταρικό τοίχωμα των
κυττάρων του στελέχους Β1.
Cr(VI)mg/L
Χρόνος (ώρες)
0 8 24 48 72 96 120
20
30
50
60
70
100
pH=6
pH=7
pH=8
pH=9
pH=10
pH=11
pH=12
Τομέας Γενετικής, Ανάπτυξης & Μοριακής Βιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, ΑΠΘ
Εικόνα 7. Καμπύλη αναγωγής διαφορετικών συγκεντρώσεων Cr(VI)
από τα κύτταρα του βακτηριακού στελέχους Β1 σε διαφορετικές τιμές
pH.
Εικόνα 6. Καμπύλη αναγωγής διαφορετικών συγκεντρώσεων Cr(VI)
από τα κύτταρα του βακτηριακού στελέχους Β1, σε θερμοκρασία
30οC.
α β
γ
O.D.630nm
Χρόνος (ώρες)
0 8 24 48 72 96 120
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
pH=6
pH=7
pH=8
pH=9
pH=10
pH=11
pH=12
Γονίδιο Προϊόν Β1
recA DNA ρεκομπινάση -
yieF Οξειδορεκτουδάση του Cr(VI) Κλάσης Ι -
chrA Αντλία εξωκυτταρικής μεταφοράς ιόντων Cr(VI) -
chrC Υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) -
ruvB Holiday – junction DNA ελικάση -

2. IRON HOMEOSTASIS AND Cr(VI) TOLERANCE AND REDUCTION
MECHANISMS IN THE Achromobacter xylosoxidans (STRAIN B1)
Neofytou Ch., Mertzanidou M., Sakoula D., Konstantinidis D., Skouras Z. & Yiangou M.
Department of Genetics, Development & Molecular Biology, School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki, Greece
Hexavalent chromium Cr(VI) is considered among the most dangerous pollutants of the natural environment, due to its extended industrial use. Cr(VI) is a known mutagenic and
carcinogenic factor, whereas Cr(III) is non-toxic and a necessary trace-element for humans. Disposal of high concentrations of Cr(VI) in the environment raises worldwide concern.
Microorganisms capable of tolerating and reducing Cr(VI) to Cr(III) are mentioned in recent bibliography. Various microorganisms utilize homeostatic mechanisms against sulfur or iron
for the reduction and neutralization of Cr(VI). The use of these strains for remediation of polluted eco-systems offers significant advantages over the traditional physiochemical
methods.
Introduction
Materials and methods
Figure 1. The natural iron-containing spring from which
the bacterial stain B1 was isolated (a), Gram staining of B1
(b) and the autorggregation of B1 bacterial cells in liquid
cultures with NB medium.
Cultural conditions
Bacterial cultures were cultivated in Nutrient Broth (NB) medium in
anaerobic conditions and orbital shaking (130 rpm) and Cr(VI) was added
in the form of K2Cr2O7, where necessary (Figure 3.).
Results
Discussion
Enzyme activity assay
Cells where grown in 250 ml of NB medium containing 50 mg/L Cr(VI) at
25οC with orbital shaking (130 rpm) for 72 hours. Thereafter, cells were
harvested by centrifugation, washed with phosphate buffer and chilled in
an ice bath. Cells were re-suspended in 1,5 ml of the same buffer and
disrupted in an ultrasonic probe (20 times in 15 sec pulses, 14.000 Hz).
Cell Free Extract (CFE), and the sediments were re-suspended in 1,5 ml
of the buffer, as the cell walls (CW). Two-fold dilutions of the CFE and the
CW up to 1:128 in duplicates were incubated in the presence of 1,8 mg
Cr(VI). Samples were then transmitted in a 96-well plate and the residual
Cr(VI) was estimated.
DNA extraction and gene amplification
PCR amplification was performed in order to detect recA, yieF, chrA,
chrC, ruvB. The products of these genes are associated with the
tolerance -detoxification mechanisms of Cr(VI).
Growth and Cr(VI) assay curves
The optical density growth was measured at 630nm. Cr(VI) reduction was
estimated with the 1,5-diphenylcavazide method.
Figure 2. Growth of the bacterial strain B1 in different
concentrations of Cr(VI) with high initial cell density.
0 8 24 48 72 96 120
50
100
200
400
50 mg/L
100 mg/L
200 mg/L
400 mg/L
Cr(VI)mg/L
Time (hours)
control
50 mg/L
100 mg/L
200 mg/L
400 mg/L
Time (hours)
0 8 24 48 72 96 120
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
O.D.630nm
Figure 3. The Cr(VI) reduction performed by the bacterial
strain B1 in different concentrations of Cr(VI) with high cell
density.
Figure 7. Cr(VI) reduction by the bacterial strain B1 in
different pH values, in the presence of 100 mg/L Cr(VI).
Table 2. The genes for the presence of which the bacterial
strain was tested and the results.
Figure 4. Growth of the bacterial strain B1 in different
concentrations of Cr(VI) at 30οC.
Figure 5. Cr(VI) reduction by the bacterial strain B1 in
different concentrations of Cr(VI) at 30οC.
Figure 8. Enzyme activity assay for the Cell Free Extract
(CFE) and the Cell Walls (CW).
Bacterial strain B1 (Table 1.), isolated from a natural iron-containing spring (Figure 1.), was identified as Achromobacter xylosoxidans and is capable of tolerating Cr(VI) in
concentrations up to 500 mg/L, whilst completely reducing 100 mg/L Cr(VI) in 72 hours. In the present study, the optimal cultural, detoxification and reduction conditions (temperature,
pH, initial biomass of the microorganism) were determined. In addition, experiments were performed to examine whether B1 strain exhibits genes involved in tolerance-detoxification
mechanisms of Cr(VI), such as: (a) the formation of a strong cell wall that prevents the intracellular entrance of Cr(VI), (b) the extracellular removal of Cr(VI), (c) the enzyme reduction
of Cr(VI), (d) the recruitment of DNA-damage repair and anti-oxidative stress mechanisms and (e) the activation of sulfur and iron homeostatic mechanisms, was investigated.
Time (hours)
control
50 mg/L
100 mg/L
200 mg/L
400 mg/L
0 8 24 48 72 96 120
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
O.D.630nm
50 mg/L
100 mg/L
200 mg/L
400 mg/L
0 8 24 48 72 96 120
50
100
200
400
Cr(VI)mg/L
Time (hours)
Table 1. Characteristics of the bacterial strain B1.
B1 strain characteristics
Morphological Colonies
Size Small
Color Milky white
Biochemical
Shape Rod
Gram staining -
Oxidase +
Catalase +
Gelatin hydrolysis -
DNase producion -
Tο C
37οC +
30οC ++
25ο C +
Growth mediums
Sterilized natural iron-containing spring water +
Sterilized natural iron-containing spring water and NB ++
ddH2O and NB +++
ddH2O and ½ NB +++
ddH2O and ¼ NB ++
Autoaggregation
+++
Gene Product Β1
recA DNA recombination and repair protein -
yieF Class I chromate oxidorectudase -
chrA Chromate transport protein -
chrC Chromate resistance hyperoxide dismutase -
ruvB Holiday – junction DNA helicase -
0 8 24 48 72 96 120
O.D.630nm
Time (hours)
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
pH=6
pH=7
pH=8
pH=9
pH=10
pH=11
pH=12
Figure 6. Growth of the bacterial strain B1 in different pH
values, in the presence of 100 mg/L Cr(VI).
Sample dilution (log2)
Cr(VI)mg/reaction
0 4 8 16 32 64
0,6
1,2
1,8
CFE
CWE
control
The great promise shown by the B1 strain when cultivated in
the presence of high concentrations of Cr(VI) stresses the
need for further research, to investigate the possible use of
the microorganism in the management and the bioremediation
of wastewater burdened with Cr(VI).
Growth of the bacterial strain B1 at 30οC (Figure 2.) results in acceleration
of Cr(VI) in concentrations up to 200 mg/L and in reduction of 50% of 400
mg/L Cr(VI) (Figure 3.). Bacterial strain Β1 can tolerate (Figure 4.) and
reduce Cr(VI) (Figure 5.) in a wide range of pH values (6-10), with the
optimal being 7. The Cr(VI) reduction rates were not significantly
influenced by the change of pH value (Figure 5.). The detection and
isolation of genes the products of which are associated with the tolerance
– detoxification mechanisms was not possible (Table 2.). Nonetheless, the
enzyme activity assay for the CFE and the CW confirmed the presence of
enzymes capable of reducing Cr(VI) (Figure 8.).
• Bacterial strain B1 is a Gram negative rod, identified as Achromobacter
xylosoxidans, capable of reducing 50% of 200 mg/L Cr(VI) in 72 hours.
• After optimization of the cultivation conditions (low initial biomass, 30οC,
pH 7), its efficiency of Cr(VI) reduction in concentrations up to 200 mg/L
Cr(VI) is doubled. In the above mentioned conditions, the strain also
exhibits the ability to reduce 50% of 400 mg/L Cr(VI).
• Identification and isolation genes associated with the tolerance –
detoxification mechanisms was not possible through PCR amplification.
• Enzyme activity tested positive for both the CFE and the CWE,
indicating that a Class I chromate oxidorectudase and a chromate
resistance hyperoxide dismutase (SOD) are possibly found in the
cytoplasm and the cell walls of B1 cells.
20
30
50
60
70
100
Cr(VI)mg/L
Time (hours)
0 8 24 48 72 96 120
pH=6
pH=7
pH=8
pH=9
pH=10
pH=11
pH=12
a b
c d