หลักการ: ใช้หลักการดึงน้ำออกจากเซลล์ภายใต้สภาวะสุญญากาศในขณะที่ตัวอย่างเป็นของเหลว (ระเหย)

1. คู่มือการเก็บรักษาจุลินทรีย์
โดยวิธีการระเหยแห้งในสภาวะสูญญากาศ
(Liquid-drying)
ศูนย์ชีววัสดุประเทศไทย (Thailand Bioresource Research Center)
ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ
สานักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ
Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand

2. การเก็บรักษาจุลินทรีย์โดยวิธีการระเหยแห้งฯ
หลักการ
• อาศัยหลักการดึงน้าออกจากเซลล์ภายใต้สภาวะสูญญากาศใน
ขณะที่ตัวอย่างเป็นของเหลว (ระเหย)
• แตกต่างจากวิธีระเหิดแห้ง (Freeze drying) ซึ่งใช้หลักการดึงน้า
ออกจากเซลล์ในขณะที่น้าอยู่ในสภาวะของแข็ง (ระเหิด) ที่ต้องแช่
แข็งตัวอย่างก่อนท้าแห้ง ท้าให้การเก็บรักษาโดยวิธีการระเหยแห้ง
ใช้เวลาการเก็บรักษาน้อยกว่าวิธีระเหิดแห้ง และสามารถใช้เก็บ
รักษาจุลินทรีย์ที่ไม่สามารถทนสภาวะแช่แข็งได้
ข้อดี
• สามารถเก็บรักษาจุลินทรีย์ได้หลายชนิด เช่น แบคทีเรียและยีสต์
ส่วนใหญ่ รวมถึงราที่สร้างสปอร์หลายกลุ่ม
• สามารถเก็บรักษาจุลินทรีย์ได้นานถึง 10 ปี หรือมากกว่า เมื่อเก็บ
ในที่มืดอุณหภูมิ 4-10C
• สามารถเก็บรักษาที่อุณหภูมิห้องได้ แต่อายุการเก็บรักษาจะสันลง
หากเก็บไว้ที่อุณหภูมิสูงเป็นเวลานาน
Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand
2

3. การเตรียมอุปกรณ์ และสารป้องกันเซลล์
จุลินทรีย์
• เตรียมเซลล์จุลินทรีย์บ่มที่อุณหภูมิเหมาะสม ส้าหรับแบคทีเรียและ
ยีสต์อายุประมาณ 24-48 ชม. หรือจนจุลินทรีย์เจริญอยู่ในช่วง
Late log phase
• ส้าหรับราและแบคทีเรียกลุ่มแอคติโนมัยสีท ให้บ่มที่อุณหภูมิ
เหมาะสมจนสร้างสปอร์ที่เจริญเต็มที่
สารป้องกันเซลล์
• เตรียมสารป้องกันเซลล์ (ตารางที่ 1) 3-4 มล. ใส่ในหลอด นึ่งฆ่า
เชือที่อุณหภูมิ 121C นาน 15 นาที
หลอด ampoule
• ล้างหลอดโดยแช่ในกรดไฮโดรคลอริก (HCl) ความเข้มข้น 2%
ข้ามคืน จากนันล้างด้วยน้าสะอาด 2 ครังและน้ากลั่น 1 ครัง แล้ว
อบให้แห้ง อุดปากหลอดด้วยจุกส้าลี นึ่งฆ่าเชือที่อุณหภูมิ 121C
นาน 15 นาที แล้วอบให้แห้ง
Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand
3

4. สารป้องกันเซลล์
จุลินทรีย์ ส่วนประกอบของสารป้องกันเซลล์
แบคทีเรีย
ทั่วไป
sodium L(+)-glutamate monohydrate 3 g, ribitol 1.5 g,
L-cystein hydorochloride monohydrate 0.05 g, 0.1 M
potassium phosphate buffer (pH 7.0) 100 ml
หมายเหตุ: ส้าหรับแบคทีเรียผลิตกรดแลคติก (lactic acid
bacteria) ให้เติม activated charcoal 1 g ในสารละลาย
ป้องกันเซลล์
ยีสต์ A: polyvinylpyrrolidone (K-90) 6 g, lactose 5 g, distilled
water 75 ml
B: sodium L(+)-glutamate monohydrate 3 g, 1 M
potassium phosphate buffer (pH 7.0) 10 ml, trehalose
5 g, distilled water 15 ml
sterilized separately by autoclaving, then mix A & B
รา sodium L(+)-glutamate monohydrate 3 g,
0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) 100 ml
Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand
Source: NBRC, Japan
ตารางที่ 1 สารป้องกันเซลล์ส้าหรับจุลินทรีย์แต่ละประเภท
4
หมายเหตุ: สารป้องกันเซลล์ที่เหมาะสมสาหรับจุลินทรีย์แต่ละชนิดอาจแตกต่างไปจากที่ระบุ และจุลินทรีย์บางชนิดอาจ
มีอัตราการรอดชีวิตต่า หรือไม่รอดชีวิตเมื่อใช้สารดังกล่าว ควรมีการศึกษาวิจัยเพิ่มเติมเพื่อปรับปรุงสูตรสาร
ป้องกันเซลล์ให้เหมาะสมกับจุลินทรีย์ชนิดที่ต้องการเก็บรักษานั้นๆ

5. วิธีการเก็บรักษา
ใช้พาสเจอร์ปิเปตถ่ายสารป้องกันเซลล์ 3-4 มล. ใส่หลอดจุลินทรีย์
แล้วผสมให้เข้ากัน
จากนันใช้พาสเจอร์ปิเปตแบ่งสารละลายเซลล์ใส่หลอด Ampoule
หลอดละ 0.1-0.2 มล.
ใช้กรรไกรตัดส่วนปลายของส้าลีอุดหลอดออก และใช้แท่งแก้ว
รูปตัวแอล (L) ดันส้าลีให้ลึกจากปลายหลอดประมาณ 3-4 ซม.
คอดหลอดโดยใช้เปลวไฟความร้อนสูง โดยให้รอยคอดอยู่บริเวณเหนือ
จุกส้าลีประมาณ 1 ซม. และให้บริเวณที่คอดมีเส้นผ่านศูนย์กลางของ
หลอดประมาณ 1-2 ม.ม.
Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand
(มีต่อ)
5

6. วิธีการเก็บรักษา (ต่อ)
เสียบหลอดที่คอดแล้วเข้ากับเครื่องท้าแห้ง
ท้าแห้งประมาณ 3-4 ชั่วโมง
ปิดหลอดในสภาวะสูญญากาศ
โดยใช้เปลวไฟความร้อนสูงลนบริเวณรอยคอด
น้าหลอดไปตรวจความเป็นสูญญากาศภายในหลอด
โดยใช้เครื่อง High-frequency spark tester หลอดที่เป็นสูญญากาศ
จะเห็นประกายแสงสีน้าเงิน-ม่วงภายในหลอด
น้าหลอดที่มีสภาวะเป็นสูญญากาศเก็บในที่มืดอุณหภูมิ 4-10C
Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand 6

7. การเพาะจุลินทรีย์ที่เก็บรักษาโดยวิธีระเหยแห้ง
• ใช้อุปกรณ์เปิดหลอด Ampoule กรีดรอบหลอด บริเวณกึ่งกลางจุก
ส้าลี
• ใช้ส้าลีชุบแอลกอฮอล์หมาดเช็ดบริเวณรอบรอยกรีด
• ใช้แผ่นส้าลีหนาหุ้มหลอดแล้วหักหลอดบริเวณรอยกรีด
• ใช้พาสเจอร์ปิเปตเติมสารที่ใช้เพาะจุลินทรีย์ (ตารางที่ 2) ใส่หลอด
จุลินทรีย์ ประมาณ 0.3-0.4 มล.
• ทิงไว้ประมาณ 2-3 นาทีแล้วผสมให้เข้ากัน
• ถ่ายส่วนผสมลงในอาหารเลียงเชือที่เหมาะสม
Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand
7

8. สารที่ใช้เพาะจุลินทรีย์
จุลินทรีย์ ส่วนประกอบสารที่ใช้เพาะจุลินทรีย์
แบคทีเรียทั่วไป polypeptone 10 g, yeast extract 2 g,
MgSO4.7H2O 1 g, distilled water 1 L, pH 7.0
ยีสต์ glucose 10 g, peptone 5 g, yeast extract 3 g,
malt extract 3 g, distilled water 1 L, pH 6.0
รา และแบคทีเรีย
กลุ่มแอคติโนมัยสีท
peptone 5 g, yeast extract 3 g, MgSO4.7H2O 1 g,
distilled water 1 L, pH 7.0
Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand
ตารางที่ 2 สารที่ใช้เพาะจุลินทรีย์แต่ละประเภท
ศูนย์ชีววัสดุประเทศไทย (TBRC)
ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ
อาคารกลุ่มนวัตกรรม 2 อาคาร B ชัน 8 ห้อง 817
143 อุทยานวิทยาศาสตร์ประเทศไทย ถนนพหลโยธิน
ต. คลองหนึ่ง อ. คลองหลวง จ. ปทุมธานี 12120
โทร: +66 (0) 2117 8000-1
อีเมล์: tbrcservice@biotec.or.th
8
สอบถามข้อมูลเพิ่มเติม