Dokumen ini membahas pemeriksaan protein dalam urine, termasuk berbagai jenis proteinuria dan mekanisme serta metode analisis yang digunakan. Mikroalbuminuria diidentifikasi sebagai indikator disfungsi glomerulus, dengan metode kuantifikasi yang meliputi tes imunokimia dan turbidimetri. Penekanan pada pentingnya pemeriksaan ini untuk diagnosis dan penilaian prognosis gangguan ginjal juga diungkapkan.

1. TUTOR KIMIA KLINIK PEMERIKSAAN PROTEIN URINE dr. Sri Kartika Sari/dr. Leonita Anniwati, SpPK(K)

2. PENDAHULUAN Secara umum membran glomerulus dapat dilewati molekul dengan BM kurang dari 50 – 60 kD Secara normal, hanya sebagian kecil protein ada dalam urine. Dalam hal ini, faktor yang berperan adalah : Filtrasi ginjal Reabsorbsi protein oleh tubulus Proteinuria : Adanya protein dalam urine yang lebih dari 150 mg/hari Patofisiologi : Perubahan permeabilitas glomerulus Gangguan reabsorpsi tubulus Peningkatan jumlah low-molecular weight protein dalam serum Sekresi dari uroepitel

3. Mikroalbuminuria BM Albumin : kurang lebih 66 kD, normal sebagian difiltrasi oleh ginjal dan direabsorbsi kembali oleh tubulus Secara normal, walaupun BM albumin cukup kecil untuk melewati membran basalis glomerulus, namun adanya muatan negatif glikoprotein menghalangi transport albumin. Mikroalbuminuria indikator dini disfungsi glomerulus Mikroalbuminuria : UAE : 30-300 mg/24 jam Albumin Creatinine Ratio : 30-300 mg/g

4. Mekanisme albuminuria/proteinuria

5. Klasifikasi proteinuria : Fisiologis Kurang dari 200 mg/hari Postural (ortostatik), latihan fisik berat Patologis : Glomerular proteinuria Tubular proteinuria Overflow proteinuria

6. PEMERIKSAAN PROTEIN URINE Kualitatif Semikuantitatif Kuantitatif Reaksi Heller Protein rebus Esbach Reaksi Robert Sulfosalicylic Acid Test Turbidimetri dengan SSA Bence Jones Protein Carik Celup Biuret Tes Mikroalbumin Folin Lowry Coomassie Blue/Bradford Assay

7. Reaksi Heller dan Reaksi Robert Prinsip : Lapisan endapan akan terbentuk bila protein bereaksi dengan asam nitrat pekat (pada reaksi Robert asam nitrat dan magnesium sulfat), bila ditambahkan secara perlahan.

8. REAKSI HELLER 3-5 ml urine jernih Asam nitrat pekat ditambahkan perlahan melalui dinding tabung Terbentuk lapisan cincin putih diantara kedua larutan

9. REAKSI ROBERT 3-5 ml urine jernih Magnesium sulfat dan asam nitrat pekat dengan perbandingan 5 : 1 ditambahkan perlahan melalui dinding tabung T erbentuk lapisan cincin putih diantara kedua larutan

10. BENCE JONES PROTEIN BM rendah (< 44 kD) Imunoglobulin paraprotein ( kappa/lambda monoclonal light chain type) Keadaan fisiknya dapat diubah oleh perubahan suhu mengendap pada suhu 45⁰– 60⁰ C dan larut pada suhu kamar dan suhu mendekati 100⁰ C Positif pada multipel mieloma, amiloidosis, makroglobulinemia.

11. BENCE JONES PROTEIN 4 ml urine jernih 1,0 buffer acetat Waterbath 56⁰ C 15 mnt kekeruhan Waterbath 100⁰ C 3 mnt Jernih kembali Waterbath 100⁰ C 3 mnt kekeruhan Ulangi lagi langkah 1-3

12. CARIK CELUP Prinsip : Dalam suatu sistem buffer yang mempertahankan pH konstan, indikator warna dapat bereaksi dengan protein (utamanya albumin) sehingga terjadi perubahan warna kuning (pada pH asam) hijau.

13. Hasil Hasil Konsentrasi negatif 1+ 30 mg/dL 2+ 100 mg/dL 3+ 300 mg/dL 4+ 2000 mg/dL False-positive False-negative Urine alkali Dilute protein BJ< 1,015 Mencelupkan dipstik terlalu lama Adanya protein lain selain albumin Gross hematuria Penisilin, sulfonamid Kontaminan antiseptik ( chlorohexidine, benzalkonium

14. Sulfosalicylic Acid Test (SSA) Prinsip : Protein diendapkan oleh asam sulfosalisilat (suatu asam kuat) dan diamati secara visual. Interferences : False-positive False-negative Urine keruh Highly alkaline buffer (pH > 8) X-ray contrast media BJ > 1,035 Tolbutamide dan metabolitnya Antibiotik (penicillin, sulfonamide, cephalosporin )

15. SSA 3 ml reagen SSA 7 % 12 ml aliquot urine disentrifuge 1500 rpm 5 mnt 11 ml dari supernatan Tutup tabung, bolak balik 2 x Biarkan selama 10 menit Bolak balik tabung 2 x lagi Lihat presipitasi yang terjadi

16. SSA

17. CARIK CELUP DAN SSA Carik celup SSA Kemungkinan penyebab positif positif proteinuria negatif negatif bukan proteinuria 1+ negatif Proteinuria, namun tidak patologis negatif positif Mungkin false-positive atau Bence Jones protein. Perlu konfirmasi lebih lanjut

18. PROTEIN REBUS Prinsip : Protein dalam suasana asam lemah, bila dipanaskan akan mengalami denaturasi dan terjadi endapan. Hasil : Hasil Gambaran Konsentrasi Negatif jernih 1+ Kekeruhan minimal, huruf cetak masih terbaca 0,01 – 0,05 g/dL 2+ Kekeruhan nyata terlihat, dengan butir halus, garis tebal masih terlihat 0,05 – 0,2 g/dL 3+ Terlihat gumpalan yg nyata 0,2 – 0,5 g/dL 4+ Terlihat gumpalan besar > 0,5 g/dL

19. PROTEIN REBUS 3 ml urine yg telah disaring/disentrifuse Panaskan sampai mendidih 2-3 tetes asam asetat 6 % Panaskan lagi sampai mendidih Baca hasil

20. TES MIKROALBUMIN Metode Imunokimia : Immunodip test Micral test strips Metode dye-binding CLINITEK microalbumin Multistix PRO

21. Immunodip test Prinsip : Albumin berikatan dengan antibodi yang di coated dengan partikel blue latex. Saturated dan unsaturated albumin-antibody complexes diisolasi dan dipisahkan oleh migrasinya pada strip. Kadar albumin ditentukan oleh perbandingan intensitas dari 2 blue band tersebut. Interpretasi hasil : Stabil sampai 8 jam Result Albumin Level A lower band is darker than the top band Less than 12 mg/L (1,2 mg/dL) Bands of equal intensity 12-18 mg/L (1,2-1,8 mg/dL) A top darker than lower band 20 mg/L (2,0 mg/dL) or greater

22. Micral test strips Prinsip : Albumin berikatan dengan gold labeled antibody enzyme conjugate. Albumin-bound complexes bermigrasi ke detection pad , sehingga ikatan enzim mengubah substrat dalam pad menjadi merah. Intensitas warna meningkat seiring dengan peningkatan kadar albumin. Hasil : Dibandingkan dengan color chart yang ada pada container. Range : 0-100 mg/dL. Detection limit : 15-20 mg/L

23. CLINITEK Microalbumin strips Prinsip : Pada pH konstan, sulfonephthalein dye berubah warna jika berikatan dengan albumin. Hasil : Diinterpretasi dengan instrumen Jika albumin (+) biru. (Range : hijau pucat sampai biru) Detection limit : 20-40 mg/L Terdapat pula reaction pad untuk menentukan kreatinin (semikuantitatif)

24. Multistix PRO strips Prinsip : Sama dengan CLINITEK microalbumin Detection limit : 80-150 mg/L Hasil diinterpretasi dengan instrumen, bisa juga secara visual (membandingkan dengan color chart )

25. ESBACH Tampung urine 24 jam  ukur volume Aduk sampai rata Ambil urine secukupnya  + asam cuka sampai pH  6  saring (Periksa dengan kertas pH ) R U R U Tutup dengan gabus  bolak balik  diamkan 24 jam Hasil dalam gram / L Isi tabung Esbach dengan urine sampai tanda U Tambah reagen Esbach sampai tanda R * Total protein dalam 24 jam = Vol. Urine 24 jam ( L ) X hasil (gram / L) = …… .. gram / 24 jam. R U

26. Metode Turbidimetri dengan Asam Sulfosalisilat Prinsip : Protein diendapkan oleh asam sulfosalisilat (suatu asam kuat) dan kekeruhan yang terjadi sebanding dengan konsentrasi protein. Reagen : Larutan SSA 3 % Larutan HCl 1,25%

27. Cara pemeriksaan Turbidimetri SSA Sentrifuse aliquot dari urine 24 jam, ambil supernatannya SSA 3 % HCl 1,25% Aduk dan biarkan 5 menit Ukur absorbansnya pada 500 nm Baca hasil pada kurva standar. Bila lebih dari 140 mg/dL, maka diulang dengan pengenceran 1:10 (dgn normal saline) Sampel Blanko 2 ml urine 2 ml urine 8 ml larutan SSA 3 % 8 ml larutan HCl 1,25%

28. Metode Biuret Prinsip : Ikatan peptida protein bereaksi dengan ion Cu membentuk kompleks yang berwarna ungu (purple). Reagen Biuret : 60 ml NaOH 10% dalam 100 ml akuades 0,3 g CuSO₄ 1,2 g Rochelle Salt Ditambahkan akuades hingga 200 ml

29. Metode Biuret 2,0 mg reagen biuret urine 500 μ L Diaduk rata Tunggu 60 menit Ukur absorbans pada 540 nm. Baca pada kurva standar

30. Metode Folin Lowry Prinsip : Pada suasana alkali ion Cu 2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida, dimana ion Cu direduksi menjadi monovalen ion. Cu + dan gugus radikal dari tirosin, triptofan dan sistein bereaksi dengan reagen Folin , menghasilkan senyawa tidak stabil yang tereduksi menjadi molybdenum/tungsten blue (biru tungsten).

31. Metode Folin Lowry 2,5 mg reagen Copper alkali urine 500 μ L Diaduk rata Tunggu 10 menit Ukur absorbans pada 750 nm Baca pada kurva standar Reagen fenol Tunggu 60 menit

32. Metode Coomasie Blue/Bradford Assay Prinsip : Dalam suasana asam reagen, protein berikatan dengan coomasie dye , menyebabkan perubahan absorpsi maksimum panjang gelombang, dari spektrum merah/coklat (absorbans maksimum 465 nm) menjadi biru (absorbans maksimum 610 nm). Perbedaan terbesar terjadi pada panjang gelombang 595 nm, sehingga 595 nm merupakan panjang gelombang optimal untuk mengukur warna biru dari kompleks coomasie dye-protein .

33. Dye-Binding

34. Metode Coomasie Blue/Bradford Assay

35. INTERPRETASI HASIL TES DIAGNOSTIK Albumine Excretion Rate = kadar albumin urine 24 j (mg/dL) x volume urine 24 j Dipengaruhi : Exercise, prolonged upright posture , intake protein dan faktor hemodinamik. Albumin Creatinine Ratio = kadar albumin urine (mg/L) kadar kreatinin urine (mmol/L) Albumine Excretion Rate dan Albumin Creatinine Ratio digunakan untuk menilai dan memantau penurunan fungsi ginjal X 10 (mg/mg)

36. PENUTUP Pemeriksaan protein urine penting untuk menegakkan diagnosa dan menilai prognosis gangguan ginjal.

37. TERIMA KASIH TERIMA KASIH

38. Metode Imunokimia untuk mengukur kadar protein spesifik Metode Prinsip Immunonephelometry Mengukur s catter light yang ditimbulkan oleh kompleks Ag-Ab yang diendapkan dalam liquid phase Radial Immunodifussion (RID) Protein berdifusi melalui media yang mengandung antibodi spesifik Radioaktif Immunoassay (RIA) Albumin yang dilabel radioaktif berkompetisi dengan albumin sampel untuk berikatan dengan Antibodi yang jumlahnya terbatas Electroimmunoassay Migrasi protein dalam medan listrik melalui media yang mengandung antibodi spesifik

39. Immunonephelometry 160 μ L buffer 150 μ L standar/urine 1 40 μ L pure antiserum spesifik utk HSA 2 tunggu 45 menit Baca absorbansnya pada 632,8 nm

44. Biuret Before After

45. Metode Biuret 60 mins later

46. Biuret Figure 6. Time course trace of the chromogenic reaction The absorbance became stable approximately after 60 minutes

47. Biuret Figure 7. Spectra of the HSA solution using the Biuret method after 60 minutes Biuret method determines the quantity by using the absorption maximum at 540 nm after reacting with the sample for 60 minutes

48. Kurva standar metode Colorimetric Biuret : BSA (Bovine Serum Albumin) : 0,0.25, 0.5, 1,5,9 mg/mL Lowry : BSA (Bovine Serum Albumin) : 0,2,20,50,100,200 μ g/mL Coomassie Blue : BSA (Bovine Serum Albumin) : 0,1,2,4,6,8,10 μ g/mL

49. Biuret test

50. Metode Lowry 60 mins later

51. Metode Lowry Figure 9. The time course trace of chromogenic reaction

52. Metode Lowry Figure 10. Spectra of HSA aqueous solution by Lowry method

53. Kurva standar turbidimetri SSA Menggunakan Bovine Albumin Standard/Versatol 7% Tambahkan 5 ml pada vial protein standar dan campur . Biarkan 30 menit, kemudian encerkan dengan 0,85% NaCl, hingga kadarnya 140 mg/dL Sediakan 7 tabung dan tambahkan sesuai dengan dibawah ini : No tabung Larutan protein (ml) 0,85 % NaCl (ml) Protein mg/dL 1 4,5 1,5 105 2 3,0 3,0 70 3 2,4 3,6 56 4 1,5 4,5 35 5 0,9 5,1 21 6 0,3 5,7 7 7 0,0 6,0 0

54. Tabel metode kuantifikasi protein Metode Concentration Range Keuntungan Kerugian Biuret 150 – 9000 μ g/mL Mudah. Sensitivitas rendah. Sampel dengan kadar pr otein rendah tdk dapat diukur. Dipengaruhi oleh trisaminomethane , asam amino dan amonium Folin Lowry 5 – 200 μ g/mL Sensitivitas tinggi Digunakan secara luas. Prosedurnya rumit, membutuhkan persiapan Bradford 10 -2000 μ g/mL Sangat mudah Dipengaruhi oleh surfactant

55. Evaluasi proteinuria Dipstik Proteinuria Eskresi protein urin 24 jam Atau ratio protein/kreatinin urin pagi 30-300 mg/hr Atau 30-350 mg/g 300-3500 mg/hr Atau 300-3500 mg/g >3500 mg/hr atau > 3500 mg/g mikroalbuminuria Silinder eritrosit/SDM Bagan hematuria Pertimbangkan : Awal DM HT essential Stagging glomerulonefritis Sbg tambahan kelainan pada mikroalbuminuria Elektroforesis Protein urine Glomerulus Tubulus Tamm Horsfall mikroglobulin Protein abnormal rantai pendek Selektif (terutama albumin) Peny.lesi minimal Non selektif DM, FSGS I njuri tubulus HT GGK Diskrasia sel plasma

57. Metode Bichinionic Acid (BCA)