metode analisis protein terlarut

1. ANALISIS PROTEIN TERLARUT

2. PENDAHULUAN
• Pengukuran protein ini umumnya mengambil
keuntungan adanya reaksi antara reagen
pewarna dan protein, dimana terjadi peningkatan
absorban pada panjang gelombang tertentu
• Semakin tinggi kandungan protein absorbansi
meningkat
• Pengukuran harus linear dan sesuai Beer’s Law!

3. PENDAHULUAN
Kriteria pemilihan metode pengukuran protein berdasarkan :
Kemudahan
Ketersediaan metode pengujian protein
Ada atau tidaknya interfering agents
Harus akurat
Sebagai contoh metode Lowry sangat sensitif, namun memerlukan
prosedur 2 tahap ( minimal 40 menit waktu inkubasi)
Pengujian Bradford lebih sensitive dan dapat diukur dalam 5 menit,
namun protein dengan kandungan arginin rendah
(underestimated)
Penentuan konsentrasi protein murni dapat menjadi tidak
akurat tergantung pada prinsip pengujian walaupun
protein murni yang digunakan sudah standar

4. LANJUT...
• Protein berbeda memiliki komposisi asam amino
berbeda, sensitivitas colorimetric assay masing-masing
protein berbeda
• The most reproducible results are obtained with
standards composed of a mixture of proteins that is as
similar as possible to the unknown.
• Metode Bradford lebih sensitif menggunakan standar
bovine serum albumin (BSA) dibanding immunoglobulin
G (IgG)

5. METODE
PENGUJIAN

6. PENGUKURAN
• Pengukuran protein terdiri dari 2 komponen utama yaitu
kurva standar dan sampel
• Reagen pada metode Bradford dan Lowry menghasilkan
perubahan warna jika terdapat protein
How does this absorbance relate to the actual protein
concentration?
• Untuk menentukan konsentrasi protein diperlukan kurva
standar
• Kurva standar merupakan plot absorbansi dan konsentrasi
protein standar (yang diketahui)

7. LANJUT…
• kurva standar dibuat dengan berbagai konsentrasi
protein yang dikenal sebagai standar.
• Selama volume sampel standar dan sampel yang tidak
diketahui adalah sama, maka konsentrasi sampel
diketahui dari kurva standar
• Perhatikan konversi pengenceran.
• pengujian sampel dalam rangkap dua atau rangkap
tiga dan rata-rata digunakan untuk grafik.

8. LANJUT..
• Tergantung pada metode, protein mempunyai
reaksi yang bervariasi dengan color dye pada
metode pengujian protein yang berbeda
• it is important to denote what the specific control or
reference protein was used to make the standard
curve.
• 2 Protein penting yang digunakan untuk kurva
standar yaitu bovine serum albumin (BSA) and
immunoglobin (IgG).

9. LANJUT..
• 2 protein (BSA dan imunoglobin) memiliki komposisi
asam amino yang berbeda dan menghasilkan kurva
standar yang berbeda dan menyebabkan hasil akhir
konsentrasi sampel yang berbeda
• Pembentukan warna tergantung pada komposisi asam
amino dari protein dan adanya kelompok prostetik
(terutama karbohidrat) juga mempengaruhi uji
protein, perlu dimurnikan protein yang sedang diuji
agar sesuai dengan protein standard

10. METODE BRADFORD
• Salah satu prosedur analisa kandungan protein dalam
larutan adalah menggunakan metode Bradford yang
pertama kali dideskripsikan oleh Bradford (Bradford et al.,
1976).
• Prinsip kerja dari metode Bradford didasarkan pada
pengikatan secara langsung zat warna Coomassie Brilliant
Blue G250 (CBBG) oleh protein yang mengandung residu
asam amino dengan rantai samping aromatik (Tyrosine,
tryptophan, dan phenylalanine) atau bersifat basa
(Arginine, Histidine, dan Leucin).

11. METODE BRADFORD
• Bradford reagent (we use the reagent prepared by
BioRad Protein Assay Solution) uses Coomassie blue G-
250.
• Reagen CBBG bebas berwarna merah-kecoklatan (lmaks 465
nm), sedangkan dalam suasana asam reagen CBBG akan
berada dalam bentuk anion yang akan mengikat protein
membentuk warna biru (lmaks 595 nm).
• Jumlah CCBG yang terikat pada protein proporsional dengan
muatan positif yang ditemukan pada protein (Bradford
1976).
• Bradford dye is easy to use, is fast and sensitive, but
several compounds can interfere with the assay

12. BRADFORD.
• Metode Bradford didasarkan pada pengikatan zat warna
Coomassie Blue G-250 ke protein, dimana zat warna ini
memiliki empat formasi ion berbeda dengan nilai pKa 1.15,
1.82 dan 12.4.
• Bentuk kationik zat warna ini berwarna merah dan hijau
dengan panjang gelombang serapan (absorbansi)
maksimum pada 470 dan 650 nm.
• Sedangkan bentuk anioniknya berwarna biru dengan
absorbansi maksimum 590 nm.
• Pengukuran proteinnya sendiri dilakukan dengan
menentukan jumlah zat warna dalam bentuk anionik (biru),
dan biasanya hal ini dilakukan dengan mengukur
absorbansi larutan pada 595 nm.

13. BRADFORD
• Zat warna Coomassie Blue G-250 bereaksi cepat dengan
residu arginin dan lysin dari protein, sehingga hal ini
menyebabkan adanya variasi hasil pengukuran untuk jenis
protein yang berbeda-beda.
• Protein dengan residu arginin dan lysin yang lebih banyak
tentu akan menghasilkan warna biru yang lebih intens
dibanding protein yang residu arginin dan lysinnya lebih
sedikit meskipun jumlah proteinnya sama.
• secara umum metode Bradford masih merupakan metode
yang paling sesuai dan paling umum digunakan.

14. REAGEN BRADFORD
• Reagen Bradford dibuat dari campuran 100 mg
Coomassie Blue G250 yang dilarutkan dalam 50 mL
etanol 95%.
• Larutan ini kemudian dicampur dengan 100 mL asam
fosfat 85%, diencerkan hingga 1 L dengan akuades.
• Reagen kemudian disaring dengan kertas whatman
No. 1 sebelum disimpan pada suhu kamar.
• Reagen ini stabil untuk beberapa minggu, meskipun
akan terjadi pengendapan (Bradford 1976).

15. BRADFORD
• Standar Protein
Bovine -
γ globulin dengan konsentrasi 1 mg/ml (atau 1000 µg/ml
untuk microassay) digunakan sebagai larutan stok (disimpan
beku pada suhu -20oC).
• Konsentrasi protein larutan standard harus diukur sebelum
digunakan dengan mengukur absorbansinya pada 280 nm.
• Absorbansi larutan Bovine -
γ globulin 1mg/ml pada cuvet 1 cm
adalah 1.35. Jika yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin
(BSA) atau Ovalbumin, maka absorbansinya masing-masing
adalah 0.66 dan 0.75.

16. BRADFORD
Standard Assay
• Untuk kurva standar, buatlah seri larutan standard
100, 200, 400, 600, 800 dan 1000 µg/ml. Lalu pipet
masing-masing 100 µl ke dalam tabung. Siapkan
blanko dengan aquadest 100 µl.
• Pipet 100 µl sample yang mengandung kira-kira 10 –
100 µg protein. Jika perkiraan konsentrasi proteinnya
tidak diketahui, maka bisa dibuat beberapa seri
pengenceran (1, 1:10, 1:100, 1:1000, dst). Siapkan secara
duplo.

17. LANJUTAN…..
• Tambahkan 5 ml pereaksi Bradford ke dalam masing-
masing tabung sample dan standard, campur dengan
membolak-balik tabung atau divortex secara perlahan.
Hindari terbentuknya busa karena akan mengurangi
reproducibility-nya. Inkubasi selama 2 sampai 60 menit.
• Ukur absorbansi sample dan standard pada panjang
gelombang 595 nm.

18. BIURET METHODS

19. BIURET METHODS
• Reaksi biuret dapat digunakan untuk analisis protein
kualitatif dan kuantitatif
• Metode Biuret tergantung adanya ikatan peptida pada protein
• Larutan protein yang ditambah cupric ions (Cu2+
) pada media
alkali, komplek Cu2+
- peptide berwarna ungu terbentuk dan
diukur dengan spektrofotometer pada sinar tampak
• biuret reagent yang digunakan larutan alkali copper sulfate

21. BIURET
• Intensitas warna proporsional dengan jumlah ikatan
peptida yang bereaksi, berkaitan dengan molekul protein
yang terdapat pada sistem reaksi
• Reaksi tidak terjadi dengan asam amino karena tidak
terdapat ikatan peptida, dan juga pada di-peptida karena
hanya terdapat 1 ikatan peptida, namun tidak pada tri-,
oligo-, and poly-peptides.
• Reaksi biuret memerlukan paling sedikit 2 ikatan peptida
-HN-CO- , -HN-CH2- , -HN-CS-

23. BIURET METHOD
Advantages:
- Lebih murah dan lebih cepat dibandingkan Kjeldahl
- Masalah kurang dengan penyimpangan warna vs Lowry, UV
- Tidak mengukur nitrogen non protein (NPN)
Disadvantages:
- tidak sensitif: untuk 2-4 mg
- Pigmen empedu mengganggu
- Garam amonium mengganggu
- Warna tergantung pada protein
- Lipid dan carbon dapat mempengaruhi kejernihan larutan
- PROTEIN MUST BE SOLUBLE

24. METODE BIURET
Pembuatan reagen Biuret :
• Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O) dan
kalium natrium tartrat (KNaC4H4O6. 4H2O) dalam 50 ml
aquades dalam labu takar 100 ml.
• Kemudian tambahkan 30 ml natrium hidroksida 10%
sambil dikocok-kocok, selanjutnya tambahkan aquades
sampai garis tanda.

25. Pembuatan larutan induk bovin serum albumin (BSA):
• Ditimbang 500 mg bovin serum albumin dilarutkan dalam
aquades sampai 10,0 ml sehingga kadar larutan induk 5,0%
(Li).
Penetapan kadar (Metode Biuret) :
• Pembuatan kurva baku :
• Dalam kuvet dimasukkan larutan induk, reagen Biuret
dan aquades misal dengan komposisi sebagai berikut:

26. KURVA STANDAR BIURET
• Setelah tepat 10 menit serapan dibaca pada λ
550 nm terhadap blanko yang terdiri dari 800 μL
reagen Biuret dan 200 μL aquades.

27. LOWRY METHODS

28. PENDAHULUAN
• The “Lowry Assay: Protein by Folin Reaction” (Lowry et al.,
1951) banyak digunakan untuk menentukan jumlah protein
(already in solution or easily soluble in dilute alkali)
‐
• Protein direaksikan dengan ion copper pada larutan alkali
dan asam amino aromatik pada sampel akan mereduksi
asam phospomolibdat phospotungstat yang terdapat dalam
Folin Reagent
• Produk akhir sampel berwarna biru
• Kadar protein pada sampel ditentukan melalui pembacaan
absorbansi dengan spektrofotometer 750 nm
• Kurva standar menggunakan larutan BSA (Bovin Serum
Albumin)

29. LOWRY
• Metode berdasarkan pada reaksi biuret dimana ikatan
peptida pada protein bereaksi dengan Cu2+
pada kondisi alkali
menghasilkan Cu+, yang selanjutnya bereaksi dengan Folin
reagent,
• phosphomolybdatungstate direduksi menjadi
theteropolymolybdenum blue melalui oksidasi yang dikatalis
oleh Cu pada asam amino aromatik.
• Hasil reaksi menghasilkan warna biru tua, ini tergantung
pada kandungan tyrosine dan tryptophan
• The method is sensitive down to about 0.01 mg of protein/mL,
and is best used on solutions with concentrations in the range
0.01–1.0 mg/mL of protein.

30. LOWRY
• protein bereaksi dengan alkaline cupric sulfate dengan
adanya tartrat selama 10-minute diinkubasi pada
suhu ruang.
• Selama inkubasi, a tetradentate copper complex
terbentuk dari 4 peptide bonds dan satu atom copper.
• The tetradentate copper complex is light blue in
color (this is the “biuret reaction”).
• Inkubasi selanjutnya, Folin phenol reagent
ditambahkan
• Pembentukan warna diperkuat oleh adanya transfer
elektron dari tetradentate copper complex terhadap
phosphomolybdic/phosphotungstic acid complex (the
Folin phenol reagent).

32. LOWRY
• phosphomolybdic/phosphotungstic acid complex yang
tereduksi dari reaksi tersebut menghasilkan warna biru
intensif
• Warna biru berlanjut intensif selama 30 menit pada suhu
ruang
• It has been suggested by Lowry, et al. and by Legler, et al. that
during the 30-minute incubation, a rearrangement of the
initial unstable blue complex leads to the stable final blue
colored complex that has higher absorbance.

33. LOWRY
• Adanya asam amino (tyrosine, tryptophan, cysteine, histidine and
asparagine) pada peptida atau protein akan memperkuat warna
karena AA tersebut memperkuat reduksi pada kompleks
phosphomolybdic/ phosphotungstic acid
• With the exception of tyrosine and tryptophan, free amino
acids will not produce a colored product with the Modified
Lowry Reagent; however, most dipeptides can be detected.
• Tidak adanya salah satu dari 5 AA tersebut pada struktur peptida,
protein yang mengandung residu proline memiliki warna dengan
intensitas rendah dengan reagen lowry karena asam amino
mengganggu pembentukan komplek.

34. ADVANTAGE
• Warna biru optimal diukur 750 nm namun bisa antara
650 – 750 nm
• Kehilangan intensitas warna kecil
• Jumlah cahaya yang diabsorbsi pada 750 proporsional
dengan kandungan protein
• Sensitivitas lowry lebih baik dari biuret reagent.
• Rentang pengukuran dari 5 to 2,000 mg/ml.

35. DISADVANTAGE
• Dapat dipresipitasi oleh adanya detergen atau ion potassium
• Surfaktan dapat mempresipitasi reagen pada konsentrasi
sangat rendah
• Chelating agents dapat mengikat Cu dan mencegah
pembentukan kompleks Cu peptida
• Agen pereduksi dan thiols bebas dapat mengganggu dengan
cara mereduksi phosphotungstate-phosphomolybdate
complex, sehingga warnanya lebih pekat.

36. KARAKTERISTIK
• Reagen harus disimpan dalam refrigerator untuk
penggunaan lama
• Reagen yang dipakai dalam 1 bulan dapat di simpan
suhu ruang
• Reagent yang sudah lama akan menghasilkan respon
warna yang rendah
• Reagen yang sudah disimpan dalam refrigerator jika
akan digunakan suhu disesuaikan dulu dengan suhu
ruang. Reagen dingin akan mengakibatkan nilai
absorban rendah

37. KARAKTERISTIK
• Biuret tidak terlalu sensitif, dengan ada reagen
folin dapat mendeteksi Cu tereduksi sehingga
menjadi 100 kali lebih sensitif dari reaksi biuret
sendiri
• Lowry meningkatkan pengukuran pada
konsentrasi protein yang lebih lebar rangenya
(Hartree, 1972)
• perlu mempresipitasi protein untuk
menghilangkan bahan pengganggu (Bensadoun
and Weinstein, 1976).

38. KARAKTERISTIK
• Pengujian lowry relatif sensitif, namun
memerlukan lebih banyak waktu dan
dipengaruhi oleh komponen
• Komponen pengganggu pengujian lowry :
detergents, carbohydrates, glycerol, Tricine, EDTA,
potassium compounds, sulfhydryl compounds,
disulfide compounds, most phenols, uric acid,
guanine, xanthine,magnesium, and calcium.

39. MATERIALS AND
CHEMICALS
1. Clean Glasswares
2. Centrifuge Tubes(10 ml)
3. semi micro cuvettes
‐
4. Spectrophotometer (750 nm)
5. Bovine Serum Albumin (BSA)
6. Folin and Ciocalteu’s Phenol Reagent (2N)
7. Sodium tartrat : Na2Tartrat.2(H2O)
8. Copper sulphate : CuSO4.5(H2O)
9. Other chemicals : NaOH, Na2CO3

40. PREPARING SOLUTION
• The Lowry Solution is a mixture of the above chemicals,
except the Folin Reagent.
The Lowry solution should be prepared fresh, at the day
of measurement.
• Though the individual solutions for the Lowry solution
can be prepared in advance and then mixed at the
day of measurement.

41. METHODS
• Solution A: (alkaline Solution)
(for 100 ml)
• 0.572gm NaOH
• 2.862gm Na2CO3
• Solution B: (for 20 ml)
• 0.285gm CuSO4.5(H2O)
• Solution C: (for 20 ml)
• 0.571gm Na2Tartrat.2(H2O)
• Lowry Solution (Lowry B):
(freshly prepared, 0.7/ml
sample)
• Sol. A + Sol. B +Sol. C with a ratio
(vol:vol) of 100:1:1
• Folin Reagent (instant fresh, 0.1
ml/sample) (Lowry A)
• 5ml of 2N Folin and Ciocalteu’s
Phenol Reagent + 6ml of double
distilled water
• this solution is light sensitive. So
it should be prepared at least
5min of the first sample
incubation and kept in an amber
container.

42. BSA
BSA Standard Protein Solution (fresh)
• Although BSA is a water soluble protein, it takes time to
dissolve it completely.
• So, prepare this stock solution and keep it mixed i.e., for
1 hour before starting the experiment.

43. PROSEDUR KURVA STANDAR
1. Menyiapkan larutan standar BSA konsentrasi 300
g/ml
BSA 0.009 gram dalam 30 ml aquades (3 mg/10 ml =
0.3 mg/ml)
2. Memasukkan larutan standar dalam tabung reaksi
sehingga diperoleh kadar 0, 30, 60,…300 g/ml
3. Ditambahkan ke dalam masing-masing tabung 8 ml
reagen lowry B dan biarkan minimal 10 menit
4. Ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 1 ml
reagen lowry A, kocok dan biarkan minimal 20 menit
5. Diukur absorbansinya pada 750 nm

44. Volume aquades Vol. larutan BSA Konsentrasi akhir
(g/ml)
1 0 0
0.9 0.1 30
0.8 0.2 60
0.7 0.3 90
0.6 0.4 120
0.5 0.5 150
0.4 0.6 180
0.3 0.7 210
0.2 0.8 240
0.1 0.9 270
0 1.0 300
KURVA STANDAR

45. PENYIAPAN SAMPEL
• Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal
albumin, endapkan dahulu dengan penambahan
amonium sulfat kristal
• (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu
sampai mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam
larutan).
• Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000
rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya.
• Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian dilarutkan
kembali dengan dapar asam asetat pH 5 misal sampai 10,0
ml. Ambil volume tertentu dan lakukan penetapan
selanjutnya seperti pada kurva baku mulai dari
penambahan 8 ml reagen Lowry A sampai seterusnya.

46. PERSIAPAN LARUTAN SAMPEL
• Membuat supernatan 5 gr dalam 50 ml
• Stirer 30 menit
• Sentrifuse 15 menit
• Pengendapan/penyaringan
• Filtrat diperoleh
• Ambil filtrat 0.1 ml + 0.9 Aquades
• Masuk prosedur sama dengan larutan standar

47. AKURASI
• PANJANG GELOMBANG YANG DIGUNAKAN
ADALAH PANJANG GELOMBANG MAKSIMUM
• PANJANG GELOMBANG MAKS = PANJANG
GELOMBANG DENGAN ABS MAKS

48. Konsentrasi larutan standar g/ml
absorbansi
Kurva
standar
Abs
sampel
kons
sampel
K Protein = Kons. Sampel x
pengenceran

49. TITRASI FORMOL
• Merupakan titrasi untuk menentukan suatu proses
terjadinya pemecahan protein
• Protein dapat pula ditentukan dengan titrasi formol
• Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu
ditambahkan formalin sehingga terbentuk dimethiol (ini
berarti gugus aminonya terikat)
• Dalam titrasi NaOH akan bereaksi dengan asam
(gugus karboksilnya)
• Indikator yang digunakan Phenolpthalein

50. PROSEDUR
• 10 ml larutan protein + 20 ml aquades dan 0.4 ml
larutan K oksalat jenuh (k oksalat : air = 1 : 3) dan 1 ml
phenolpthalein 1%, diamkan 2 menit
• Titrasi larutan dengan 0.1N NaOH sampai diperoleh
warna standar
• Warna standar :10 ml lar protein + 10 ml aq +0.4 K
oksalat jenuh + 1 tetes indikator rosalinin-klorida
• Setelah warna standar tercapai, + 2 ml larutan
formaldehid 40% dan titrasi kembali dengan NaOH
sampai warna standar diperoleh (catat titrasi kedua
ini)
• Titrasi blanko terdiri 20 ml Aquades + reagen yang
sama

51. PERHITUNGAN
• Titrasi formol merupakan titrasi kedua – titrasi blanko
• % protein = faktor konversi x % N
• % N = titrasi formol x N NaOH x 14
• g bahan X 10

52. Konsentrasi BSA
(µg/ml)
ABS
1
ABS
2
0 0 0
30 0,093 0,099
60 0,165 0,166
90 0,293 0,292
120 0,37 0,372
150 0,47 0,465
180 0,524 0,525
210 0,625 0,622
240 0,679 0,675
270 0,751 0,742
300 0,866 0,854