Dokumen tersebut membahas tentang pemeriksaan kadar fibrinogen menggunakan metode Clauss, termasuk prinsip, prosedur, dan faktor-faktor yang dapat mempengaruhi hasilnya."

1. Tutor Hematologi
PEMERIKSAAN FIBRINOGEN
METODE CLAUSS
Arief Sukma H/ Arifoel Hajat
04/12/2013
Tutor Hematologi
1

2. PENDAHULUAN
Fibrinogen :
Terdiri dari 3 pasang rantai polipeptida :
- Aα (BM 66.500) → 610 asam amino
- Bβ (BM 52.000) →461 asam amino
- γ (BM 46.500) →411 asam amino
Dihubungkan :
- Ikatan disulfida → molekul yg simetris
→ 2 domain D → berbentuk helik.
Tutor Hematologi
04/12/2013
2

3. Gambar 1. Gambaran molekul fibrinogen secara skematis
04/12/2013
Tutor Hematologi
3

4. Fibrinogen
Suatu glikoprotein yang larut dalam plasma
→ BM 340.000 kilo dalton
Terdapat :
- Plasma dan trombosit
Sintesa :
- Di hati
Konsentrasi :
- 150-450 mg/dl
04/12/2013
Tutor Hematologi
4

5. Bagan proses fibrinolisis
Plasminogen
↓
← aktivator plasminogen
Plasmin + antiplasmin →kompleks
Plasmin +antiplasmin
Fibrinogen
fibrin
↓
↓
fibrinogen
fibrinogen
degradation
degradation
product
product
(FDP)
(FDP)
04/12/2013
Tutor Hematologi
5

6. Fibrinogen
Fungsi :
- proses trombosis
- meningkatkan viskositas darah
→memacu terbentuknya plak ateromatosus dan
trombosis.
Peningkatan konsentrasi fibrinogen :
- hipertensi
- kehamilan
- aterosklerosis
- usia, wanita, pasca menopause, merokok,
keganasan
04/12/2013
Tutor Hematologi
6

7. Fibrinogen
Penurunan konsentrasi fibrinogen :
- perdarahan
- hepatitis virus
- penyakit ginjal akut
- DIC
- penggunaan obat-obatan (mis: tiklopidin)
04/12/2013
Tutor Hematologi
7

8. Pemeriksaan konsentrasi
fibrinogen
Jenis pemeriksaan :
- Konvensional :
- Clauss assay
- PT-Fg
- Protein clottable
- Immunologi assay
04/12/2013
Tutor Hematologi
8

9. Pemeriksaan konsentrasi
fibrinogen
-
Otomatis :
- Blood coagulation analyzer
CS - 2100i
04/12/2013
Tutor Hematologi
9

10. Clauss assay
Prinsip :
- penambahan larutan trombin kuat pada
plasma (yang diencerkan) menghasilkan
bekuan darah (fibrin).
Nilai rujukan :
- 136-384 mg/dl
04/12/2013
Tutor Hematologi
10

11. Reagensia
reagen trombin :
- mengandung lyophilized bovine
thrombin 100 NIH unit
2. Owren veronal buffer (OVB)
3. kalibrator fibrinogen (standar human
plasma)
4. PPP plasma dan kontrol
1.
04/12/2013
Tutor Hematologi
11

12. Metode Pemeriksaan
1.
Pemeriksaan kadar fibrinogen
buat pengenceran PPP pasien 1:10
↓
ambil 0,2 ml
↓
tambahkan 0,1 ml larutan trombin
catat masa pembekuan
04/12/2013
Tutor Hematologi
12

13. Metode Pemeriksaan
2. Pembuatan kurva standar fibrinogen
◦ buat pengenceran plasma kalibrasi dalam OVB
(Owren’sVeronal Buffer) 1:5, 1:10, 1:20, 1:40
◦ dari tiap pengenceran : ambil 0,2 ml untuk
dihangatkan 37⁰ C
◦ tambahkan 0,1 ml larutan trombin
◦ ukur masa pembekuan
◦ buat grafik pada kertas double log :
- sumbu X : konsentrasi fibrinogen (mg/dl )
- sumbu Y : masa pembekuan (detik)
04/12/2013
Tutor Hematologi
13

14. 04/12/2013
Tutor Hematologi
14

15. Metode Pemeriksaan
3. Pemeriksaan plasma pasien
- masukkan 200 µL PPP yang telah diencerkan 1 :
10 ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan
100 µL reagen trombin
(15-25ºC), tekan
stopwatch.
- setelah plasma membeku, stopwatch ditekan
kembali lamanya plasma membeku dicatat.
- dengan menggunakan kurva standar kadar
fibrinogen dapat dibaca.
04/12/2013
Tutor Hematologi
15

16. Clauss assay
PP
P
OV
B
Ambil
0,2 ml
0,1 ml
larutan
trombin
Sentrif.
3000
rpm,
5-10
mnt
Catat
masa
pembekuan
Inkubasi
37˚C
04/12/2013
Tutor Hematologi
16

17. Preanalytical error





pemilihan tabung tidak tepat (seharusnya
tabung bertutup biru
volume darah kurang
perbandingan darah dan sitrat tidak tepat
darah hemolisis, beku, ikterik, lipemik
tabung pengumpulan dan penyimpanan
terkontaminasi (air, debu, deterjen)
04/12/2013
Tutor Hematologi
17

18. Analytical error

Penyiapan larutan trombin tidak tepat :
◦ kontaminasi bufer atau reagen
◦ rekonstitusi dengan volume bufer tidak
tepat
◦ larutan trombin langsung dipakai setelah
kaluar dari freezer
◦ kerusakan reagen trombin komersial
◦ penyimpanan pada suhu ≥ 8⁰ C
04/12/2013
Tutor Hematologi
18

19. Analytical error






lama inkubasi tidak tepat
suhu, pH, dan volume buffer tidak sesuai
prosedur alat tidak diikuti
terdapat paraprotein konsentrasi tinggi
FDP konsentrasi tinggi
heparin konsentrasi tinggi
04/12/2013
Tutor Hematologi
19

20. PT-Fg

Prinsip pemeriksaan :
- mengukur perubahan kerapatan optik
dari berbagai pengenceran plasma dengan
kadar fibrinogen yang diketahui.
- perubahan optik untuk setiap tingkat
fibrinogen yang berbeda diplot sebagai
kurva kalibrasi.
- pemeriksaan ini tidak direkomendasikan
untuk pemeriksaan laboratorium rutin.
04/12/2013
Tutor Hematologi
20

21. Clottable protein
Pemeriksaan ini disebut juga cara Gravimetri,
prinsip kerja :
- fibrinogen akan berubah menjadi bekuan fibrin
dengan penambahan larutan trombin dan calcium
chloride.
- bekuan yang dihasilkan mempunyai berat yang
dapat ditimbang setelah dicuci dan dikeringkan.
Tidak direkomendasikan untuk penggunaan rutin :
- sulit dilakukan secara teknis,
- membutuhkan kemampuan tinggi,
- waktu yang relatif lebih lama.

04/12/2013
Tutor Hematologi
21

22. Immunological assay
Prinsip pemeriksaan :
- sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay (ELISA)
04/12/2013
Tutor Hematologi
22

23. Immunological assay
Sandwich Elisa
04/12/2013
Tutor Hematologi
23

24. Immunological assay
Sandwich Elisa :
1. lempeng dilapisi dengan capture antibody
2. sampel ditambahkan, dan antigen mengikat
capture antibody
3. pengenal antibodi ditambahkan, dan mengikat
antigen
4. enzyme-linked antibodi kedua ditambahkan,
sehingga berikatan untuk mendeteksi antibodi
5. substrat ditambahkan dan diubah oleh enzim ke
bentuk yang dapat dideteksi pada panjang
gelombang 450 nm
04/12/2013
Tutor Hematologi
24

25. Pemeriksaan fibrinogen
dengan CS-2100i
Prinsip kerja :
→ sama dengan teknik Clauss assay
Bekuan fibrin yang terbentuk dideteksi
dengan multi-wavelength detection system
pada λ = 660 nm.
04/12/2013
Tutor Hematologi
25

26. Gambar kurva koagulasi secara skematik
04/12/2013
Tutor Hematologi
26

27. Increase of
Scattered Light
Scattered
Light
Coagulation
Coagulation
Light Detector
Light Source
Decrease of
Transmitted Light
Transmit
ted Light
Light Source
Coagulation
Coagulation
Light Detector
Gambar sistem deteksi secara optikal
04/12/2013
Tutor Hematologi
27

28. Multi-wavelength Filter
340nm
405nm
575nm
660nm
Photo acceptance unit
800nm
Lamp Unit
Multi-Wavelength Filter
Optical Fiber
04/12/2013
Tutor Hematologi
28

29. Prosedur
siapkan PPP dengan sentrifugasi
darah sitrat 3000 rpm selama 5 - 10
menit
 tabung diletakkan pada rak khusus
 tempatkan pada tempat sampler pada
CS-2100i
 lakukan order entry pada komputer

04/12/2013
Tutor Hematologi
29

30. Order Registration Set-up and Analysis
CS-2100i akan menjalankan proses
pengukuran fibrinogen secara otomatis
 hasil dapat dibaca di layar komputer
 clotting: 405, 660, 800 nm

04/12/2013
Tutor Hematologi
30

31. Nilai rujukan CS-2100i
Fibrinogen :
215,8 – 348,4 mg/dl
04/12/2013
Tutor Hematologi
31

32. Sample Quality Check Function
HIL DETECTOR enables
Sample Quality Check
Function using the Multiwavelength Detection
System.
Check the presence of
interfering substances*
H : Hemolytic
I : Icteric
L : Lipemic
Labs is alerted of a sample
quality
User definable setting
Multi-Wavelength Detector
Aliquot
Lamp unit
HIL Detector
04/12/2013
Tutor Hematologi
32

33. Multi-wavelength Filter
Sampel yang :
1. hemolisis → kadar hemoglobin hingga 75
mg/dl tidak berdampak pada kadar
fibrinogen
2. ikterik → kadar bilirubin hingga
1,93
mg/dl tidak berdampak pada kadar
fibrinogen.
3. lipemik → kadar trigliserid hingga 501,0
mg/dl tidak berdampak pada kadar
fibrinogen.
04/12/2013
Tutor Hematologi
33

34. Terima
kasih
04/12/2013
Tutor Hematologi
34

35. Natrium Sitrat
Trisodium citrate = anti koagulan untuk
hampir semua pemeriksaan faal
hemostasis
- Lar.0.109 M(3.2%) atau 0.129 M (3.8%)
-
-
Keuntungan memakai sitrat :
* stabilitas ‘faktor-labil’ V dan VIII
* sensitif thdp efek heparin → dipakai utk
monitoring terapi heparin
* ion Ca lebih cepat dinetralkan
04/12/2013
Tutor Hematologi
35

36. Larutan sitrat 0,109 M → pH > 8,0 bila
dicampur darah → pelepasan CO dan ↑
pH darah → denaturasi FV dan F VIII.
→ dipakai antikoagulan sitrat :
- Campuran na sitrat dan asam sitrat → pH
5,8 → camp terbaik jk pH 7,4
- Antikoagulan sitrat + HEPES ( N-2hydroxyethyi
piperazine
N-2-ethane
sulphoric acid)
04/12/2013
Tutor Hematologi
36

37. OVB
Owren’s Veronal Buffer
 Komposisi : 2.84 x 10² M sodium barbital
dalam 1.25 x 10¯¹ M NaCl
 pH : 7.35 ± 0.1

04/12/2013
Tutor Hematologi
37

38. Oxalat : faktor V dan VIII tak stabil
 Heparin dan EDTA menghambat proses
koagulasi secara langsung dan mengganggu
penentuan endpoint
 Perbandingan sitrat dan darah = 1 : 9

04/12/2013
Tutor Hematologi
38

39. Order Registration Set-up and
Analysis
1.
Masukkan no. rak dan pilih
posisi pada rak untuk order
sampel.
2.
Tekan [Order Entry] untuk
register sampel rutin. Order
Entry dialog box muncul
3.
Pilih [Ordinary sample].
4.
Masukkan [sample ID #]
5.
Pilih parameter yang akan
diperiksa.
6.
Tekan [Ok].
7.
Tekan [Register]. Order akan
masuk ke Joblist screen.
8.
Tekan [Start] untuk start
running sampel.
04/12/2013
Tutor Hematologi
39

40. 
The relationship between rpm and RCF :
RCF = 1.12 x 10⁻⁵ x r x (rpm)²
RCF : relative centrifugal force (g =gravities)
r : radius of centrifuge (cm)
1.12 x 10⁻⁵ is an empirical factor
rpm : revolutions per minute (speed)
(Kaplan LA, Clinical chemistry 5th ed : 21)
04/12/2013
Tutor Hematologi
40

41. A paraprotein is an immunoglobulin or
immunoglobulin light-chain that is produced in excess
by the clonal proliferation of plasma cells. Detection
of paraproteins in the urine or blood is most often
associated with benign MGUS (monoclonal
gammopathy of undetermined significance), where
they remain "silent",[1] and multiple myeloma. An
excess in the blood is known as paraproteinemia.
 Paraproteins are also referred to as "M proteins,"
where the "M" stands for "monoclonal."
http://en.wikipedia.org/wiki/Paraprotein 250213 03:20

04/12/2013
Tutor Hematologi
41

42. M-protein

Also called monoclonal protein, monoclonal
immunoglobulin, myeloma protein, or M- spike.

In myeloma, a single B- lymphocyte in the bone
marrow undergoes a genetic mutation which causes it
to over produce plasma cells in an uncontrolled
manner.

These clone plasma cells will continue to produce the
same immunoglobulin proteins as the original
cancerous cell in large quantities. As a result, an
excessive amount of a single type of immunoglobulin
is created. The accumulation of this single variety of
immunoglobulin is called the M-protein.
04/12/2013
Tutor Hematologi
42

43. Measurement Principle
Sample dispensing
Reagent addition
Reaction curve
Incubation
Primary
tube
Cuvette
Detection
Mixing
Light is shined onto the sample and reagent mixture.
Changes in transmitted light are detected during the process of
•Change in turbidity when fibrinogen is converted into fibrin (clotting assays)
•Color emission by a chromogenic synthetic substrate (chromogenic assays)
•Latex agglutination by antigen-antibody reaction (immunoassays)
04/12/2013
Tutor Hematologi
43

44. THROMBIN TIME (TT) = Masa Trombin
PRINSIP :
Terjadi pembekuan o.k.adanya perubahan
langsung dari Fibrinogen menjadi Fibrin
dengan pemberian langsung Trombin pada
plasma. (trombin 1,5 IU/ml )
04/12/2013
Tutor Hematologi
44

45. TT = TROMBIN TIME :
Memanjang pada :
• Hipofibrinogemia
• Kadar FDP >>
• Adanya inhibitor : Heparin
Memanjang jika kadar fibrinogen <100 mg/dl
04/12/2013
Tutor Hematologi
45

46. Interpretasi hasil pada Clauss assay
Inherited disfibrinogenemia : selalu rendah
 Terjadi interferensi jika :

◦ Heparin > 0,8 u/ml
◦ FDP > 190 µg/ml
Pada dugaan gangguan fibrinogen herediter : clot
weight assay (pada disfibrinogenemia :ada
diskrepansi)
Hipofibrinogenemia : < 80 mg/dl
Afibrinogenemia : < 20 mg/dl (Williams manual
of Hematology : 614)
04/12/2013
Tutor Hematologi
46

47. Dry clot weight

Reagen : PPP
CaCl2 0,025 mol/l
bovine thrombin 50 u/ml
rentang normal : 1,5 -4,0 g/l
04/12/2013
Tutor Hematologi
47

48. Metode dry clot weight
Pipet 1 ml PPP, masukkan tabung 12 x 75
mm dan hangatkan 37° C.
 Masukkan aplikator kayu atau stik swab
dalam tabung
 Tambahkan 0,1 ml CaCl2 dan 0,9 ml
trombin
 Inkubasi 37° C selama 15 menit
 Bekuan fibrin pada stik ditiup lembut, dan
ditekan untuk mengeluarkan serum.

04/12/2013
Tutor Hematologi
48

49. lanjutan
Cuci bekuan dalam tabung berisi 9 g/l
NaCl, lalu tabung berisi air.
 Pindahkan fibrin dari stik ke kertas filter
 Beri aceton,biarkan selama 5-10 menit
 Keringkan dalam oven atau lampu panas
selama 30 menit
 Biarkan dingin, lalu ditimbang
(Dacie 11th ed : 424)

04/12/2013
Tutor Hematologi
49

50. 


















Factor Koagulasi terdiri dari :
I. Fibrinogen
II. Prothrombin
III.Tissue thromboplastin
IV. Calcium
V. Proaccelerin
VI. VII. Proconvertin
VIII. Anti Hemophillic Factor
IX. Chrismast Factor
X. Stuart Factor
XI. Plasma Thromboplastin Antecedent (PTA)
XII. Contact Factor
XIII. Fibrin Stabilizing Factor
Prekalikrein (Fletcher Factor)
High Molecular Weight Kinin (HMWK)
Protein S
Protein C
Protein Z
04/12/2013
Tutor Hematologi
50

51. 








FUNGSI FIBRINOLISIS :
Pembatasan pembentukan fibrin pada daerah
luka.
Penghancuran fibrin dalam sumbat
hemostasis.
KOMPONEN SISTEM FIBRNOLISIS :
Plasmin.
Aktivator Plasminogen.
Inhibitor Plasmin / Anti Plasmin.
04/12/2013
Tutor Hematologi
51

52. 
PROSES FIBRINOLISIS


ENDOTEL / JARINGAN




↓
PLASMINOGEN AKTIVATOR
(GLYCOPROTEIN)







↓
ANTIPLASMIN
(α2 ANTIPLASMIN)
↓
PLASMINOGEN →PLASMIN → PLASMIN IN AKTIF
↓
FIBRIN → BAHAN2 YANG SOLUBLE / FDP
↓

RES



04/12/2013
Tutor Hematologi
52

53. 
PLASMINOGEN yang tidak aktif berubah menjadi PLASMIN karena adanya :

Plasminogen Aktivator

Faktor XII aktif

Thrombin

Kalikrein



PLASMINOGEN
ANTI PLASMIN
AKTIVATOR
(Plasminogen Aktivator

Inhibitor)




PLASMINOGEN →
PLASMIN
INAKTIF
→
PLASMIN
→ RES
↓

FIBRIN
→
FIBRIN ( FDP )FRAGMENTS OR SPLIT PRODUCTS
↓

SMALLER FRAGMENTS


↓

RES


04/12/2013
Tutor Hematologi
53

54. 




Plasmin akan memecah Fibrin, Fibrinogen, Faktor V dan
VIII. Fibrin/Fibrinogen akan dipecah menjadi FDP
(Fibrin/Fibrinogen Degradation Products) atau FSP
(Fibrin/Fibrinogen Split Products).
Selanjutnya FDP/FSP akan :
Menghambat agregasi trombosit
Menghambat kerja thrombin pada fibrinogen
Menghambat polimerisasi fibrin





FDP mempunyai sifat :
Anti thrombin
Menghambat polimerisasi fibrin
Menghambat fungsi trombosit

04/12/2013
Tutor Hematologi
54

55. 




PLASMINOGEN AKTIFATOR :
1. INTRINSIK :
terdapat dalam darah yaitu F.XIIa, Kalikrein
2. EKSTRINSIK :
terdapat pada endotel pembuluh darah &
berbagai jaringan disebut : tissue plasminogen
aktivator (t-PA)




3. EKSOGEN :
* Urokinase (dibentuk ginjal)
* Streptokinase (produk kuman Streptokokus
Beta Hemolitikus).

04/12/2013
Tutor Hematologi
55

56. 





Plasminogen Activator Inhibitor ( PAI)
(International Committee on Thrombosis and
Hemostasis)
1. PAI – 1 : disintesis oleh sel endotel
pembuluh darah, sel otot polos, fibroblas paru, alfa
granula trombosit.
2. PAI – 2
: disintesis oleh plasenta,
granulosit, monosit, makrofag.
3. PAI – 3
: dalam air seni.
4. Protease Nexin – 1 : ditemukan dalam
fibroblas, sel otot jantung & epitel ginjal .

04/12/2013
Tutor Hematologi
56

57. 







III. Produk dari proses Fibrinolisis
1. PLASMIN : memecah Fibrin, Fibrinogen, Faktor
V dan VIII.
2. FDP (fibrin degradation product) : merupakan
competitive inhibitor terhadap Trombin dan Fibrin Polimer
IV. Inhibitor Plasmin/Anti Plasmin
Alfa-2–Plasmin inhibitor/Alfa-2–Anti Plasmin
2.
Alfa-2-Makroglobulin
3.
Alfa-1-Antitripsin
4.
Anti Trombin-3 (AT-III)


04/12/2013
Tutor Hematologi
57

58. 
KERUSAKAN JARINGAN /PEMBULUH DARAH :

Reaksi pembuluh darah


Vasokonstriksi




factor
Rangsangan terhadap :
1. Platelet :
a.Adesi,Agregasi
b. Platelet growth
c. Platelet faktor-3
2. Sistema koagulasi
3.
Sistema





Fibrinolisis
Plasminogen
aktivator dikeluarkan
dari sel endotel


04/12/2013
Tutor Hematologi
58

59. 04/12/2013
Tutor Hematologi
59