Basic Spectro and chromatography

1. DASAR-DASAR METODE UJI
SPEKTROSKOPI DAN KROMATOGRAFI
Oleh: Drs. Tahid,M.Sc
PT. Intertek Utama Services
Jl. Raya Bogor Km 28 JAKARTA
29-31 Juli 2013

2. Absorpsi
Transmisi
h
SPEKTROFOTOMETER UV/Vis
PRINSIP DASAR dan PERALATAN
SPEKTROMETRI : ILMU YANG MEMPELAJARI
INTERAKSI SINAR DENGAN MATERI
Interaksi sinar - materi
Bias

3. 
A
Waktu/jarak
GELOMBANG
A = amplitudo
 = panj. Gelombang
 = frekuensi
H = cycle/detik
E = h  = h c / 
MATERI
SINAR
SINAR = RADIASI ELEKTROMAGNETIK

4. SPEKTRUM ABSORPSI DAN STRUKTUR MOLEKUL
ABSORPSI TERJADI ELEKTRON TEREKSITASI
CONTOH
CH3
CH3
C O•
••
• n


ANTI BONDING
ANTI BONDING
NON BONDING
BONDING
BONDING
E
Zat yang mengabsorpsi sinar kromofor

5. PEMILIHAN FILTER DALAM FOTOMETER
470
nm
B
I
r
u
Orange

6. ASPEK ABSORPSI
(A)
b
P0 P
(%T)
A = - log T
A = log (1/T)
A = log P0/ P
A = a b c
A =  b c
Hukum Lambert-Beer:
c = dalam mol/L
c = dalam g/L

7. A. ASPEK KUALITATIF
400 440 480 520 560 600 640
1,0
0,5 -
480
Absorban
Panjang gelombang (nm)
Panjang gelombang maks. = 480 nm
SPEKTRUM ABSORPSI
X

8. SPEKTRUM ABSORPSI
A. ASPEK KUALITATIF
400 440 480 520 560 600 640
1,0
0,5 -
480
Absorban
Panjang gelombang (nm)
Panjang gelombang maks. = 480 nm
X
 A
400 nm 0,18
420 nm 0,05
440 nm 0,24
460 nm 0,62
480 nm 0,79
500 nm 0,75
520 nm 0,61
540 nm 0,50
580 nm 0,40
600 nm 0,22
620 nm 0,19

9. B. ASPEK KUANTITATIF
A =  b c
Untuk contoh Ac = c b cc
Untuk standar As = s b cs
Bila kedua zat tsb. sama, maka pengamatan pada  yang sama
konsentrasi contoh dapat ditentukan sbb ;
Ac = c b cc
As = s b cs
Cc = Cs
Ac
As
Cara perhitungan

10. CARA KURVA KALIBRASI STANDAR
NO C (mol/L) A
1 50 0,30
2 100 0,60
3 150 0,90
4 contoh X 0,75
1,0
0,5
50 100 150 200 250 ppm
Cc
A
C
Cc = 125 ppm
Y = bx + c
R2 = ?

11. BATASAN-BATASAN BERLAKUNYA HKM BEER
1. BATASAN SEJATI (REAL LIMITATIONS)
Pada C > 0,01 M, jarak rata-rata antar komponen yang mengabsorpsi
berkurang sehingga setiap partikel muatan terdistribusi ke sekeliling
2. PENYIMPANGAN KIMIA
- Asosiasi
- Disosiasi
- Reaksi kimiA
Dari spesies yang mengabsorpsi dengan pelarutnya
3. PENYIMPANGAN INSTRUMENTAL KARENA SINAR POLIKROMATIS
4. PENYIMPANGAN INSTRUMENTAL OLEH SINAR SESATAN

12. KESALAHAN PADA ANALISIS SPEKTROMETRI
5
10
15
20
25
20 40 60 80 100 %T
 0,8 0,5 0,3 0,2 0,1 0 A
Usahakan Penyediaan
larutan di perkirakan
%T = 80 - 10
A = 0,2 - 0,8
Kesalahan minimal, bila:
Topt = 0,368 atau
A = 0,434

13. PENYIMPANGAN HKM BEER KARENA SINAR POLIKROMATIS
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0
K o n s e n t r a s i
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
A
b
s
o
r
b
a
n
1 = 1000
2 = 1000
1 = 1500
2 = 500
1 = 1750
2 = 250

14. Pita A
Pita B Pita A
Pita B
Panjang gelombang Konsentrasi

15. EFEK SINAR SESATAN
0,0%
0,2%
1%
5%
1,0
2,0
0 2,5 5,0 7,5 10,0
K o n s e n t r a s i

16. PERALATAN SPEKTROFOTOMETER
Sumber
s i n a r
Monokro
mator
Contoh Detektor Pencatat
DIAGRAM BLOK SPEKTROFOTOMETER
SUMBER SINAR
VIS
UV
WOLFRAM/TUNGSTEN 350 - 780 nm
DEUTERIUM 180 - 350 nm
JENIS-JENIS SUMBER SINAR PADA SPEKTROFOTOMETER UV/VIS

17. 1. SUMBER SINAR SPEKTROFOTOMETER
Sumber energi sinar yang baik untuk pengukuran absorbansi
UV/Vis seharusnya :
- memancarkan spektrum yang kontinue
- berintensitas tinggi dan
- merata di daerah panjang gelombang tertentu
ideal
kenyataanl
Intensitas
1
2
!

18. 2. M O N O K R O M A T O R
KEUNTUNGAN SINAR MONOKROMATIS
- PEMISAHAN  YANG BERDEKATAN
- DAPAT DITENTUKAN  MAKS KEPEKAAN TINGGI
- MEMENUHI HUKUM LAMBERT-BEER
SKEMA ALAT MONOKROMATOR
PRISMA
Grating

19. EFEK PENGATURAN
SLIT (CELAH) TERHADAP RESOLUSI
LEBAR PITA
LEBAR PITA
EFEKTIF

20. 3. WADAH SAMPEL (KUVET / SEL)
 Sampel dalam pengukuran ini umumnya berbentuk larutan
 Bahan kuvet harus transparan:
 Gelas : 350 nm - 3,0 m Vis
 Kuarsa : 210 nm - 3,0 m UV/Vis
 Leburan silikat : 165 nm - 200 nm UV jauh
 Posisi kuvet terhadap sinar datang harus tegak lurus
- Sinar tegak lurus terhadap dinding kuvet
 Kuvet untuk blanko dan kuvet untuk sampel harus
“matched”

21. Untuk gas
Sampling
KUVET SPEKTROFOTOMETER UV/Vis
Kuvet untuk
Spectronic 20


22. 200 220 240 260 280 300 320 340
Contoh spektrum batas tembus sinar dari pelarut n-heksana

23. PELARUT / SOLVENT
 Harus dapat melarutkan sampel dengan sempurna
 Harus tidak boleh meyerap (mengabsorpsi) sinar yang dipakai
 Batas tembus larutan harus lebih kecil dari panjang
gelombang maksimum analit yang dianalisis
Tabel: Batas tembus sinar terendah untuk pelarut dalam UV/Vis
No Jenis Pelarut Batas tembus sinar
1 A I r 190 nm
2 Alkohol 210 -,,-
3 n-Heksana 220 -,,-
4 Sikloheksana 210 -,,-
5 Benzena 280 -,,-
6 Ether (Diethylether) 210 -,,-
7 Aseton 330 -,,-
8 Dioksan 220 -,,-

24. 4. D E T E K T O R
Mengubah energi foton (sinar) menjadi energi listrik atau
isyarat listrik.
Syarat-syarat yang harus dipenuhi oleh detektor :
 Mampu menangkap dan memberi respon terhadap energi
sinar pada daerah panjang gelombang yang cukup lebar
 Mempunyai kepekaan tinggi dengan noise rendah
 Mempunyai waktu respon yang cepat
 Mempunyai kestabilan yang cukup lama
 Mempunyai isyarat elektronik yang mudah diperbesar
 Isyarat elektronik harus sebanding dengan intensitas sinar

25. JENIS - JENIS DETEKTOR
DETEKTOR PHOTOTUBE
A m p l i
- +
A n o d a
K a t o d a
h (foton)
Elektron

26. PHOTOMULTIPLIER
h (foton)

27. Kaca Film perak
Selenium
Besi
DETEKTOR PHOTOVOLTAIC
Wadah
plastik
h
Energi radiasi dapat menghasilkan arus listrik setelah mengenai inteface
suatu lapisan semikonduktor dan suatu lapisan logam
Detektor ini digunakan terutama untuk daerah panjang gelombang visibel

28. DASAR KROMATOGRAFI
Oleh : Tahid
Tahun 1906: Ahli botani Rusia Mikhail Tswett berhasil memisahkan berbagai
ekstrak pigmen tumbuhan pada kolom berisi kalsium karbonat
Glass wool
CaCO3
Klorofil
Xantofil
Karoten
Pet ether

29. 



30. Kromatografi: bahasa Greek “chroma” artinya warna
dan “graphein” artinya menulis
Menuliskan dengan warna
Menggambar warna
Perkembangan berikut; timbulnya warna pada proses
pemisahan tidak menjadi syarat mutlak
(karena berbagai zat tak berwarna dapat
dipisahkan termasuk gas)

31. Kromatografi:
 Tidak banyak digunakan sebagai alat analisis
kualitatif (penentuan struktur dari senyawa)
 Tapi banyak dipakai sebagai cara untuk
pembanding dua senyawa atau lebih dalam
memperoleh identitas senyawa dari struktur
O o
Spl Std
Spl (Sampel) Std (Standar)
Kunci analisis tersedianya standar 
E
l
u
s
i

32. Kromatografi lapisan tipis (TLC)
.
.
.
.
.
.
  
St Sp St
St Sp St
Muka samping
Muka depan
Pengembang
Pelat TLC
.
.
.
Paper
Kertas
Deteksi

33. Pemisahan kromatografi :
- Senyawa-senyawa dari sampel terdistribusi antara fasa gerak
dan fasa diam koefisien distribusi
Cs
K =
Cm
Dimana :
CS = lamanya solut berada dalam fasa diam
Cm = lamanya solut berada dalam fasa gerak
Fs diam
Fs gerak
Fs diam
Penampang
kolom
Koefisien distribusi
Koefisien partisi (Fs diam cair)
Koefisien adsorpsi (Fs diam padat)

 


 




34. KROMATOGRAFI
ADSORPSI PARTISI
GSC/GC PC
GLC
TLC
LC/HPLC
FASA GERAK
FASA DIAM
CAIR CAIR
CAIR
PADAT
GAS GAS
KLASIFIKASI KROMATOGRAFI

35. TEKNIK HPLC

Detektor
LC
Pompa
Gambar skema alat HPLC
Kolom
Solven

36. KROMATOGRAFI GAS

(FID/TCD)
Detektor
GC
Oven
Gas
Gambar 1. Skema alat GC
Kolom
Injektor

37. 


  






Lampu UV
Reagent
spray
Uap I2
Deteksi noda/spot
254 nm
254 nm

38. POLARITAS MOLEKUL
Molekul dikatakan polar : bila pusat muatan negatif
tidak sama (coincide) dengan pusat muatan positif
Suatu molekul terdiri dari dua muatan (dipole) yaitu
dua muatan sama dan berlawanan pada jarak tertentu
Suatu molekul memiliki momen dipole, dinyatakan:
 = e x d
Dimana :  = momen dipole dalan Debye
e = besarnya muatan dalam e.s.u
d = jarak dalam Angstrom
+ -
*

39. H F O N
H H H H H
H F O N
H H H H H
+
+
+
+
+ -
-
-
+
Molekul:
Semakin polar, bila perbedaan elektronegatifitas makin besar
Elektronegatifitas : F > O > Cl, N > Br > C, H
Unsur yang paling elektronegatif adalah yang berada pada
kanan atas dari tabel periodik
Elektronegatifitas *

40. H Cl Cl
H F C H C Cl C H
H H Cl Cl H H
 = 1,75 D  = 0 D  = 0 D  = 1,86 D
Hidrogen Metana Karbon Metil klorida
fluorida tetraklorida
Dipole moment, D
H2 0 HF 1,75 CH4 0
O2 0 H2O 1,84 CH3Cl 1,86
N2 0 NH3 1,46 CCl44 0
Cl2 0 NF3 0,24 CO2 0
Br2 0 BF3 0
*

41. N
N
H
O
H
F
F
F
H
H
H H O H
Amoniak Air
Nitrogen
trifluorida
N
H
H
H




O
H H
N
F
F
F




 = 1,46 D  = 1,84 D  = 0,24 D
Air Nitrogen trifluorida
Amoniak
*

42. Tabel 1. Deret eluotropik pelarut-pelarut
No Pelarut Konst. Dielektrik (25 C)
1. Heksana 1,89
2. Sikloheksan 2,02
3. Karbon tetraklorida 2,24
4. Benzena 2,28
5. Toluena 2,38
6. Dietil ether 4,34
7. Kloroform 4,87
8. Etilasetat 6,02
9. Tetrahidrofuran 7,58
10. Diklorometana 9,14
11. Piridina 12,3
12. Butan-1-ol 17,8
13. Propan-1-ol 20,1
14. Aseton 20,7
15. Etanol 24,3
16. Metanol 33,6
17. Air 78,3
*
Non Polar
Polar

43. 
Fasa diam untuk kolom GC/LC umumnya berdasar pada polisiloksan
R R R R R R
- Si – O – Si – O – Si – O – Si – O – Si – O – Si –
n
R R R R R R
OH OH OH OH OH OH
Fasa gerak
Fasa diam
Penyangga silika
Gambar: Mekanisme adsorbsi dalam kolom kromatografi

44. MEKANISME PEMISAHAN KROMATOGRAFI
Adsorpsi Partisi

Fs. Diam
padat
Fs. Diam
cair

45. 
Adsorpsi Partisi
INTERAKSI YANG TERLIBAT DALAM KROMATOGRAFI

46. Contoh hasil pemisahan kromatografi
Kromatogram
0 5 10 15 20 25 menit
A
D
C
B
Gambar Kromatogram GC dari senyawa A, B, C dan D

47. W1/2
W
t’r
tr
ta
A
B
1. Waktu Retensi (tr)
Kurva Kromatogram
t’r = tr - ta
Waktu retensi, tr - waktu antara titik injeksi dan respon detektor maks
Waktu retensi terkoreksi : t’r - waktu tempuh tambahan bagi solut/analit
melewati kolom
Waktu retensi minimum : ta - waktu tempuh fasa gerak melewati kolom

48. tr - t0 t’RB - t’RA
Faktor kapasitas : k’ = =
t0 t’RA
2. Faktor Kapasitas: k’ - faktor retensi (kec migrasi solut)
A
B
t’RB
t’RA
t0
Retensi relatif :  - rasio waktu retensi terkoreksi komponen
t’RB
 = > 1
t’RA
tr
Performance kolom
k’ ideal : 2 - 10

49. W1/2
W
t’RA
tRA
t0
A B
3. Faktor Selektifitas ()
Kurva Kromatogram
tRB - t0 t’RB k’B
 = = =
tRA - t0 t’RA k’A
tRB
t
t’RB
tRA dan tRB = waktu retensi A dan B
t0 = waktu retensi pelarut
t’RA dan t’RB = waktu retensi terkoreksi
A dan B
Solven (Udara)

50. Benzena
251 s
Toluena
333 s
tR
Waktu retensi terkoreksi/disesuaikan :
Benzena t’R = (251 - 42) s = 209 s
Toluena t’R = (333 - 42) s = 209 s
Faktor retensi/faktor kapasitas :
Benzena k’ = (251 - 42) / 42 = 5,0
Toluena k’ = (333 - 42) / 42 = 6,9
Retensi relatif :
 = t’R (toluena) / t’R (benzena) = (333-42)/(251-42) = 1,39
Contoh Perhitungan
Metana
42 s
t’R
t0
tR

51. RESOLUSI/DAYA PISAH
t R(A) - t R(B)
R =
1/2 (W(A) + W(B))
2 t
R =
(W(A) + W(B))
W(A)
W(B)
t R(A) t R(B)
t
R = 0,75
R = 1,00
R = 1,50
Resolusi tergantung:
- Ketajaman puncak
- Jarak maks 2 puncak
A B
W(A)
A B

52. h
½h
 
W1/2=2,35 
W=4
tR
t=0 (injeksi)
Nilai-nilai : W1/2=2,35  dan w = 4  adalah dari pers. Gaussian
Titik infleksi
Titik tajam dari kurva
(x - x0)2
2  2
G(x) = e
EFISIENSI PEMISAHAN

53. h
½h
 
W1/2=2,35 
W=4
tR
t=0 (injeksi)
Kurva Gaussian: area segitiga  96% total area dengan SD =  2
EFISIENSI PEMISAHAN
t0
tR
2
N =
tR
2
N = 5,54
W1/2
tR
2
N = 16
W


54. Selektivitas vs Efisiensi
tRB - t0 t’RB
 = =
tRA - t0 t’RA
2 t
R =
(W(A) - W(B))
tR
2
N = 16
W
tR
tR
A B
A B
Selektivitas tinggi ()
Efisiensi rendah (N)
Selektivitas rendah ()
Efisiensi tinggi (N)

55. Efisiensi Kolom
Efisiensi kolom merupakan fungsi dari parameter-parameter:
 Kecepatan alir fasa gerak (carrier gas)
 ukuran partikel dari bahan pengisi kolom
 Cara mengisi bahan tsb kedalam kolom (packing kolom)
tR
2 tR
2
N = 16 =
W 
L
HETP =
N
Dimana : HETP (H) = height of the theoritical plate
N = jumlah pelat teoritis
L = panjang kolom
“Efisiensi = gambaran sempit tidaknya puncak
yang dihasilkan”

56. TEORI PELAT PADA KROMATOGRAFI
PRINSIP DISTILASI
Pelat
PRINSIP PEMISAHAN
L
H =
N
L
PEMISAHAN KROMATOGRAFI
“The smaller H, the better”

57. W1/2
13 s
A
B
Contoh menghitung jumlah pelat teoritis (N)
407 s
Panjang kolom 12,2 m untuk pemisahan B
Hitunglah jumlah pelat (N) dan tinggi pelat (H) ?
tR
2 16 x 4072 s2
N = 16 = = 1,57 x 104
W 132 s2
L 12,2 m
H = = = 0,75 mm
N 1,57 x 104

58. KURVA VAN DEEMTER
Konsep pelat teori dapat diimajinasikan bahwa kolom kromatografi
terdiri dari sejumlah besar pelat dan tebal dari tiap pelat dinyatakan
sebagai HETP (Height equivalent to theoritical plate).
- Semakin kecil nilai HETP, efisiensi kolom semakin baik.
- Semakin besar N maka HETP semakin kecil
B
HETP = A + + C 

A, B dan C merupakan tiga penyebab terjadinya pelebaran puncak
A = pengaruh difusi pusaran/difusi Eddy
B = Difusi molekul
C = Tahanan terhadap alih massa atau ukuran kekentalan fasa
cair dalam kolom
 = kecepatan aliran fs gerak [panj. kolom/tR udara (cm/detik)]

59. Kurva Van Deemter
A
B
C
 - kecepatan alir
H
opt
Ketahanan terhadap perpindahan massa
Difusi pusaran
Difusi
molekul
H = A + B/ + C 
Untuk kolom packed : A, B, C  0
Untuk kolom open tubular/kapiler : A = 0
Untuk kapiler elektroforesis : A = C = 0
Bila  optimal, maka efisiensi kolom menjadi tinggi

60.  
 
 
Difusi Pusaran/ Difusi Eddy
A = 2  dp
Tabel 1. Pengaruh ukuran partikel pada 
Ukuran mesh 
200 – 400 (dp = 0,07 – 0,04 mm ~ 8
50 – 100 (dp = 0,3 – 0,15 mm ~ 3
20 – 40 (dp = 0,8 – 0,4 mm) ~ 1
dp = diameter partikel rata-rata

61. 10 20 30 40 50 60 cm/s
Kurva Van Deemter
N2 He
H2
1,0
0,75
0,5
0,25
Hydrogen : is the best specially for wide retention time (k)
range analysis
Helium : is acceptable and perhaps the most practical
Nitrogen : is not recommended
*
H