XIII Lezione - Arabo G.Rammo @ Libera Accademia Romana
Alla scoperta del materiale genetico: il DNA, la sua duplicazione
1. James Watson (a sinistra) e Francis Crick (a destra), scopritori della
struttura a doppia elica del DNA
Nel 1928 Frederick Griffith scoprì che i caratteri della forma smooth ("liscia") di
Pneumococcus potevano essere trasferiti alla forma rough ("rugosa"), miscelando i resti
di batteri smooth morti con batteri rough vivi. Questo sistema, pur non fornendo
nessuna evidenza su quale fosse la sostanza che determinava il cambiamento, mostrava
che qualcosa potesse trasportare l'informazione genetica dai resti dei batteri morti a
quelli vivi. Si parlò quindi di un principio trasformante in grado di modificare i batteri
vivi. Nel 1943 Oswald Theodore Avery dimostrò, in un celebre esperimento insieme a
Colin MacLeod e Maclyn McCarty, che il DNA è il principio trasformante alla base di
questo fenomeno. Il ruolo del DNA nell'ereditarietà è stato provato, infine, nel
1953 da Alfred Hershey e Martha Chase attraverso un altro classico esperimento, che
dimostrò che il materiale genetico del fago T2 è effettivamente il DNA.
Il DNA fu inizialmente isolato dal biochimico
svizzero Friedrich Miescher, il quale, nel
1869, individuò una sostanza microscopica
contenuta nel pus di bende chirurgiche
utilizzate. Dal momento che tale molecola
aveva la sua localizzazione nel nucleo, egli la
chiamò nucleina
LA RICERCA DEL MATERIALE GENETICO
2. Johan Friedrich Miescher (Basilea, 13 agosto 1844 – Davos, 26
agosto 1895) è stato un biologo svizzero, che isolò per la prima
volta gli acidi nucleici
Friedrich Miescher
Egli evidenziò infatti nel 1869, presso i laboratori di Felix Hoppe-
Seyler a Tubinga, la presenza di vari composti chimici ricchi in
fosfato all'interno dei nuclei dei leucociti. La scoperta di tali
molecole, che egli denominò nucleina, aprì la strada
all'identificazione del DNA come molecola responsabile della
conservazione e della trasmissione dei caratteri ereditari.
Il laboratorio (situato nei sotterranei di un vecchio castello) dove
Miescher isolò per la prima volta la nucleina
3. Nel 1919 Phoebus Levene individuò la struttura del nucleotide,
composta da base azotata, zucchero e fosfato.
Phoebus Levene
Phoebus Aaron Theodore Levene (25 febbraio 1869 – 6 settembre
1940) è stato un biochimico lituano, emigrato nel 1893 negli Stati Uniti a
causa dei pogrom antisemiti che avevano come bersaglio anche la sua
famiglia, di origine ebraica. Levene studiò lungamente il DNA e scoprì
che esso contiene adenina, guanina, timina, citosina, deossiribosio ed un
gruppo fosfato.
Diagramma molecolare di un ipotetico tetranucleotide, come
proposto (scorrettamente) da Levene intorno al 1910
4. Frederick Griffith
Frederick Griffith (1879 – 1941) è stato un
biologo inglese
Nel 1928, attraverso quello che oggi è noto come
esperimento di Griffith, propose la presenza di un principio
trasformante alla base della trasformazione batterica.
L'esperimento aprì la strada alla scoperta del DNA come
molecola contenente l'informazione genetica.
Griffith stava lavorando alla messa a punto di un vaccino contro le frequenti epidemie di polmonite
esplose in Gran Bretagna al termine della Prima guerra mondiale. Griffith stava utilizzando due linee
del batterio Streptococcus pneumoniae: una, definita rugosa (R), non era in grado di indurre la
malattia; l'altra, liscia (in inglese smooth, S), induceva la patologia perché dotata di capsula
polisaccaridica. Essa tuttavia, se inattivata ad alte temperature, non era in grado di indurre patologia
in seguito ad iniezione in topi.
La patologia insorgeva invece in seguito all'iniezione di batteri S inattivati e di R. Griffith isolò i
batteri dal sangue dell'animale e scoprì che gli R avevano acquisito la capsula ed erano in grado di
mantenerla lungo le generazioni. Griffith ipotizzò dunque la presenza di qualche principio
trasformante in grado di trasferirsi dalla linea S inattivata a quella R. Solo alcuni anni più tardi fu
chiaro che quel principio fosse il DNA.
5. Oswald Theodore Avery
Oswald Theodore Avery ( 21 ottobre 1877 – 2 febbraio 1955) è stato un
medico canadese. Spese la maggior parte della sua carriera come
ricercatore nell'ospedale dell'Istituto Rockefeller a New York. Avery è
stato uno dei primi biologi molecolari e fu un pioniere nel campo
dell'immunologia; è comunque maggiormente conosciuto per il suo
esperimento del 1944, con i suoi collaboratori Colin MacLeod e Maclyn
McCarty, che diede una chiara prova del fatto che i geni e i cromosomi
fossero costituiti da DNA.
Il celebre esperimento diede la prima prova certa che la molecola di DNA fosse portatrice
dell'informazione genica. Avery usò come base per il suo esperimento gli studi condotti qualche
decennio prima dallo scienziato Frederick Griffith su due ceppi del batterio Streptococcus
pneumoniae: il ceppo S letale per le cavie e il ceppo R innocuo. Si era dimostrato che
l'informazione genica (compresa l'informazione riguardante la letalità del batterio) poteva essere
trasferita dal batterio S lisato al batterio R (trasformazione batterica), rendendo quest'ultimo
letale. Avery dimostrò che l'informazione veniva trasmessa dal DNA, perché l'attività
trasformante cessava solo quando la miscela veniva trattata con DNasi (enzimi che degradano il
solo DNA).
6. Alfred Hershey
Nobel per la
medicina 1969
Hershey e la sua assistente Martha Chase nel 1952 al Cold Spring
Harbor Laboratory, dimostrarono usando traccianti radioattivi,
che il materiale genetico di alcuni batteriofagi (virus che
infettano i batteri) è Dna ed è responsabile delle capacità
infettive. L'esperimento di Hershey-Chase prova definitivamente
che il materiale genetico è costituito da DNA e non da proteine.
Alfred Day Hershey (4 dicembre 1908 – 22 maggio 1997) è stato
un genetista statunitense, premio Nobel per la medicina nel 1969,
insieme a Salvador Luria e Max Delbrück, per la scoperta della
replicazione dei virus e della loro struttura genica .
Martha Cowles Chase (1927 – 8 agosto 2003) è stata una genetista
statunitense.
Martha Chase
7.
8. Uno aveva 23 anni ed era un biologo
statunitense, l'altro ne aveva 35 ed era un
fisico britannico. I loro nomi sono tra i più
famosi nella storia della Scienza: James
Watson e Francis Crick. Lavoravano
insieme da poco meno di due anni –
dall'ottobre del 1952 – quando, discutendo
nel loro studio presso il Cavendish
Laboratory (il dipartimento di fisica di
Cambridge), il 21 febbraio 1953 si resero
conto di avercela fatta. Di aver svelato un
mistero che da 84 anni (il dna era stato
scoperto nel 1869) occupava la mente e le
notti di decine di scienziati: la struttura
dell'acido desossiribonucleico, conosciuto
meglio come dna, sede del patrimonio
genetico di ogni essere vivente.
18. Nei procarioti, la molecola di DNA è chiusa ad anello. In occasione della replicazione del DNA,
questo anello si apre (le due eliche che lo formano, si aprono) creando due forcelle o forche di
replicazione (o forcella replicativa).
In ciascuna forcella, il distacco delle due eliche, avviene ad opera di un enzima chiamato elicasi.
Ciò garantisce che le due eliche siano, in ambito replicativo, indipendenti, permettendo la
sintesi su ciascuna di esse, di un'elica "figlia" a opera dell'enzima DNA-polimerasi.
19. Una single-strand binding protein (dall'inglese, proteina legante il singolo filamento),
nota anche come SSB o SSBP o proteina destabilizzante l'elica, è una proteina in
grado di legare le regioni di DNA a singolo filamento, al fine di prevenirne il
riappaiamento con un altro singolo filamento. Poiché i singoli filamenti di DNA
tendono spontaneamente ad appaiarsi in una doppia elica, il legame delle SSB aiuta
enzimi come le elicasi a stabilizzare l'elica denaturata, condizione necessaria per
procedere alla replicazione del DNA.
Le SSB sono state individuate in numerosi organismi, tra cui l'uomo.
Struttura della elicasi di E. coli
L'elicasi è un enzima specifico della replicazione del DNA.
Esso agisce rompendo i legami idrogeno instaurati tra le basi
complementari. Inoltre questo enzima agisce in coppia con la
DNA-girasi che separa i due filamenti di DNA.
20. Elicasi è un enzima specifico della replicazione del DNA. Esso agisce rompendo i legami idrogeno
tra le basi.
SSB sono in grado di mantenere aperti i due filamenti del DNA in modo che non si riappaino
DNA polimerasi, enzimi capaci di costruire una nuova catena solo in direzione 5'-3'
DNA girasi facilita lo svolgimento (denaturazione) della doppia elica del DNA, necessario per
l'attuazione di varie reazioni, come l'apertura della doppia elica ad opera dell'elicasi, all'inizio
della replicazione del DNA stesso e della trascrizione.
Primer è un filamento di acido nucleico che serve come punto di innesco per la replicazione del
DNA. I primer sono necessari perché molte DNA-polimerasi (enzimi che catalizzano la
replicazione del DNA) non possono iniziare la sintesi di un nuovo filamento "ex novo", ma
possono solo aggiungere nucleotidi ad un filamento preesistente
Primasi sono una particolare forma di RNA polimerasi le primasi codificano per una breve
molecola di RNA (detta appunto primer o "Innesco") di circa 11 ±1 nucleotidi,
Il primer o innesco viene utilizzato successivamente come punto di partenza per le DNA
polimerasi
Le primasi sono dunque importantissime per la replicazione del DNA, dal momento che non
esistono DNA polimerasi in grado di iniziare la sintesi del DNA senza un primer ad RNA
21. Frammento di Okazaki è un breve frammento di DNA sintetizzato attraverso la catalizzazione
dalle DNA polimerasi (DNA polimerasi III, nei procarioti) durante la replicazione del DNA da
parte del filamento lento, e da un Primer di RNA. Questo frammento è composto da circa
100÷200 nucleotidi nelle cellule eucariote e 1000÷2000 nucleotidi nelle cellule procariote.
Endonucleasi sono enzimi idrolitici identificati negli anni settanta che scindono un
polinucleotide in due (rimuovono i primer)
DNA ligasi enzima in grado di legare due frammenti di DNA che hanno subito una rottura a
doppio filamento (ad esempio nei processi di riparazione del DNA