Download luận văn thạc sĩ ngành hóa phân tích với đề tài: Xác định đồng thời paracetamol và cafein trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ đạo hàm và phương pháp chemometrics 50000465

1. i
M,
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
--------
CHÂU VIẾT THẠCH
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI PARACETAMOL VÀ
CAFEIN TRONG DƢỢC PHẨM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ ĐẠO HÀM VÀ
PHƢƠNG PHÁP CHEMOMETRICS
CHUYÊN NGÀNH : HÓA PHÂN TÍCH
MÃ SỐ : 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. TRẦN THÚC BÌNH
Thừa Thiên Huế, năm 2016

2. ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và
kết quả nghiên cứu ghi trong luận văn là trung thực, đƣợc các đồng tác giả cho phép
sử dụng và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ một công trình nào khác.
Tác giả luận văn
Châu Viết Thạch

3. iii
LỜI CẢM ƠN
Trong những dòng đầu tiên của luận văn, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn
sâu sắc đến PGS. TS. Trần Thúc Bình – Thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian thực hiện luận văn, đồng thời Thầy đã bổ sung cho tôi nhiều
kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học.
Tôi chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Hóa học, Phòng Đào tạo sau Đại
học, Trường Đại học Sư phạm Huế đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành
tốt luận văn.
Xin cảm ơn quý thầy cô và cán bộ phòng thí nghiệm Hóa phân tích, Trường
Đại học Khoa Học nơi tôi tiến hành luận văn đã hổ trợ, giúp đỡ tôi hoàn thành tốt
luận văn
Chân thành cảm ơn sự quan tâm, động viên của gia đình, bạn bè và đồng
nghiệp trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này.
Huế, tháng 9 năm 2016
Tác giả
Châu Viết Thạch

4. 1
MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa .............................................................................................................. i
Lời cam đoan.............................................................................................................. ii
Lời cảm ơn ................................................................................................................ iii
MỤC LỤC..................................................................................................................1
Danh mục các từ viết tắt..............................................................................................5
Danh mục các bảng .....................................................................................................6
Danh mục các hình......................................................................................................8
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................9
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................11
1.1. CÁC ĐỊNH LUẬT CƠ SỞ CỦA SỰ HẤP THỤ ÁNH SÁNG .....................11
1.1.1. Định luật Bouguer – Lambert – Beer........................................................11
1.1.2 Tính chất cộng tính độ hấp thụ ..................................................................11
1.2. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH QUANG PHỔ UV-VIS XÁC
ĐỊNH CÁC CẤU TỬ CÓ PHỔ HẤP THỤ XEN PHỦ NHAU............................12
1.2.1. Phƣơng pháp quang phổ đạo hàm [2],[4] .................................................12
1.2.2. Phƣơng pháp phổ toàn phần (phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu hệ đa
biến) [1],[2],[4] ...................................................................................................14
1.2.3. Phƣơng pháp lọc Kalman [2],[4] ..............................................................16
1.2.4. Phƣơng pháp Vierordt [2],[4] ...................................................................17
1.2.5. Phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu [1],[2],[4].........................................18
1.2.6. Phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu từng phần (PLS) [2][4]....................19
1.2.7. Phƣơng pháp hồi quy cấu tử chính (PCR) [2],[4].....................................19

5. 2
1.3. TỔNG QUAN VỀ PARACETAMOL [6],[7] ................................................20
1.3.1. Giới thiệu chung........................................................................................20
1.3.2. Một số phƣơng pháp xác định riêng lẽ PAR.............................................23
1.4. TỔNG QUAN VỀ CAFFEIN [6],[7]..............................................................24
1.4.1. Giới thiệu chung........................................................................................24
1.4.2. Một số phƣơng pháp xác định riêng lẽ CAF.............................................28
1.5. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI PAR VÀ CAF ........29
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................32
2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU...........................................................................32
2.1.1. Khảo sát lựa chọn các điều kiện thí nghiệm thích hợp để xác định PAR và
CAF bằng phƣơng pháp chemometrics ..............................................................32
2.1.2. Khảo sát lựa chọn các điều kiện thí nghiệm thích hợp để xác định PAR và
CAF bằng phƣơng pháp quang phổ đạo hàm .....................................................32
2.1.3. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp.......................................................32
2.1.4. Đề xuất quy trình xác định PAR và CAF trong dƣợc phẩm.....................32
2.1.5. Áp dụng quy trình để xác định PAR và CAF trong dƣợc phẩm...............32
2.1.6. So sánh kết quả của hai phƣơng pháp nghiên cứu....................................33
2.1.7. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích .............................................33
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................33
2.2.1. Phƣơng pháp trắc quang - chemometrics..................................................33
2.2.2. Phƣơng pháp quang phổ đạo hàm.............................................................33
2.2.3. Phƣơng pháp khảo sát đơn biến................................................................33
2.3. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................39
2.3.1. Thuốc Panadol Extra.................................................................................39
2.3.2. Thuốc Colocol Extra.................................................................................39

6. 3
2.4. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ............................................................................39
2.4.1. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................39
2.4.2. Hóa chất ....................................................................................................40
2.4.3. Dung môi...................................................................................................40
2.4.4. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn ..................................................................40
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................41
3.1. KHẢO SÁT LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM CHO PHƢƠNG
PHÁP CHEMOMETRICS.....................................................................................41
3.1.1. Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của PAR và CAF ......................................41
3.1.2. Khảo sát tính cộng tính phổ hấp thụ phân tử của PAR và CAF ...............42
3.1.3. Khảo sát sự ổn định của phổ hấp thụ phân tử của PAR, CAF và hỗn hợp
hai chất theo thời gian.........................................................................................43
3.2. KHẢO SÁT LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM CHO PHƢƠNG
PHÁP QUANG PHỔ ĐẠO HÀM.........................................................................44
3.2.1. Khảo sát phổ đạo hàm của PAR và CAF..................................................44
3.2.2. Khảo sát phổ đạo hàm của PAR ở các nồng độ khác nhau.......................45
3.2.3. Khảo sát sự ảnh hƣởng của PAR tới CAF trong dung dịch hỗn hợp........45
3.2.4. Khảo sát phổ đạo hàm của CAF ở các nồng độ khác nhau.......................46
3.2.5. Khảo sát tính cộng tính của phổ đạo hàm.................................................47
3.2.6. Khảo sát tính cộng tính của phổ đạo hàm tại bƣớc sóng 260 nm .............48
3.2.7. Khảo sát khoảng tuyến tính của PAR tại bƣớc sóng 260 nm ...................49
3.2.8. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của PAR....................................50
3.2.9. Khảo sát khoảng tuyến tính của CAF tại bƣớc sóng 216,4 nm ................51
3.2.10. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của CAF..................................52
3.2.11 Khảo sát tìm giá trị hệ số độ hấp thụ phổ đạo hàm của CAF tại bƣớc sóng

7. 4
260 nm (ε’260 nm của CAF) ..............................................................................52
3.3. ĐÁNH GIÁ ĐỒNG THỜI ĐỘ TIN CẬY CỦA HAI PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU.......................................................................................................53
3.3.1. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp trên mẫu chuẩn tự pha..................53
3.3.2. Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp trên mẫu chuẩn tự pha ở các tỉ lệ
nồng độ khác nhau ..............................................................................................55
3.3.3. Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp trên mẫu chuẩn tự pha ở tỉ lệ nồng độ
PAR:CAF = 100 : 13...........................................................................................56
3.4. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI PAR VÀ CAF
TRONG DƢỢC PHẨM BẰNG HAI PHƢƠNG PHÁP .......................................59
3.5. ÁP DỤNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI PAR VÀ CAF TRONG
DƢỢC PHẨM TRÊN THỊ TRƢỜNG...................................................................60
3.5.1. Áp dụng quy trình xác định đồng thời PAR và CAF trong thuốc viên nén
Panadol Extra ......................................................................................................60
3.5.2 Áp dụng quy trình xác định đồng thời PAR và CAF trong thuốc viên nén
Colocol Extra ......................................................................................................62
3.6. SO SÁNH KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CỦA HAI PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU .......................................................................................................................64
3.7. ĐÁNH GIÁ ĐỘ TIN CẬY CỦA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ......................65
3.7.1. Độ thu hồi..................................................................................................65
3.7.2. So sánh kết quả của phƣơng pháp nghiên cứu với phƣơng pháp HPLC ..69
KẾT LUẬN..............................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................74
PHỤ LỤC................................................................................................................ P1

8. 5
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
STT Viết tắt Tiếng Việt Tiếng Anh
1 A Độ hấp thụ Absorbance
2 CAF Cafein Caffeine
3 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High performance liquid
chromatography
4 LOD Giới hạn phát hiện Limit of detection
5 LOQ Giới hạn định lƣợng Limit of quantitation
6 PAR Paracetamol Paracetamol
7 RE Sai số tƣơng đối Relative error
8 Rev Độ thu hồi Recovery
9 SD hoặc S Độ lệch chuẩn Standard deviation

9. 6
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Các dung dịch hỗn hợp với nồng độ PAR khác nhau...............................46
Bảng 3.2. Giá trị phổ đạo hàm tại bƣớc sóng 260 nm của PAR, CAF và hỗn hợp ..49
Bảng 3.3. Giá trị phổ đạo hàm của PAR tại bƣớc sóng 260 nm ở các nồng độ khác
nhau...........................................................................................................................50
Bảng 3.4. LOQ, LOD của PAR tại λ = 260 nm theo phổ đạo hàm...........................51
Bảng 3.5. Giá trị phổ đạo hàm của CAF tại bƣớc sóng 216,4 nm ở các nồng độ khác
nhau...........................................................................................................................51
Bảng 3.6. LOD, LOQ của CAF tại λ = 216,4 nm theo phổ đạo hàm .......................52
Bảng 3.7. Giá trị ε’260 nm của CAF ở các nồng độ khác nhau ....................................53
Bảng 3.8. Kết quả xác định độ đúng và độ lặp lại của phƣơng pháp chemometrics 54
Bảng 3.9. Kết quả xác định độ đúng và độ lặp lại của phƣơng pháp quang phổ đạo
hàm............................................................................................................................54
Bảng 3.10. Các dung dịch hỗn hợp với tỉ lệ nồng độ khác nhau ..............................55
Bảng 3.11. Kết quả xác định PAR và CAF ở các tỉ lệ khác nhau theo phƣơng pháp
chemometrics ............................................................................................................55
Bảng 3.12. Kết quả xác định PAR và CAF ở các tỉ lệ khác nhau theo phƣơng pháp
quang phổ đạo hàm ...................................................................................................56
Bảng 3.13. Nồng độ các dung dịch hỗn hợp PAR và CAF ở tỉ lệ 100:13 ................57
Bảng 3.14. Kết quả xác định PAR và CAF ở tỉ lệ 100:13 theo phƣơng pháp
chemometrics ............................................................................................................58
Bảng 3.15. Kết quả xác định PAR và CAF ở tỉ lệ 100:13 theo phƣơng pháp quang
phổ đạo hàm ..............................................................................................................58
Bảng 3.16. Kết quả xác định PAR và CAF trong dung dịch mẫu, hàm lƣợng tƣơng
ứng trong thuốc Panadol Extra theo phƣơng pháp chemometrics ............................61
Bảng 3.17. Kết quả xác định PAR và CAF trong dung dịch mẫu, hàm lƣợng tƣơng

10. 7
ứng trong thuốc Panadol Extra theo phƣơng pháp quang phổ đạo hàm ...................62
Bảng 3.18. Kết quả xác định PAR và CAF trong dung dịch mẫu, hàm lƣợng tƣơng
ứng trong thuốc Colocol Extra theo phƣơng pháp chemometrics ............................63
Bảng 3.19. Kết quả xác định PAR và CAF trong dung dịch mẫu, hàm lƣợng tƣơng
ứng trong thuốc Colocol Extra theo phƣơng pháp quang phổ đạo hàm ...................63
Bảng 3.20. So sánh kết quả của hai phƣơng pháp nghiên cứu trên mẫu thuốc
Panadol Extra ............................................................................................................64
Bảng 3.21. So sánh kết quả của hai phƣơng pháp nghiên cứu trên mẫu thuốc
Colocol Extra ............................................................................................................65
Bảng 3.22. Kết quả xác định độ thu hồi của thuốc Panadol Extra theo phƣơng pháp
chemometrics ............................................................................................................67
Bảng 3.23. Kết quả xác định độ thu hồi của thuốc Panadol Extra theo phƣơng pháp
quang phổ đạo hàm ...................................................................................................67
Bảng 3.24. Kết quả xác định độ thu hồi của thuốc Colocol Extra theo phƣơng pháp
chemometrics ............................................................................................................68
Bảng 3.25. Kết quả xác định độ thu hồi của thuốc Colocol Extra theo phƣơng pháp
quang phổ đạo hàm ...................................................................................................69
Bảng 3.26. Kết quả so sánh hàm lƣợng PAR và CAF trong thuốc Panadol Extra của
phƣơng pháp chemometrics với phƣơng pháp HPLC...............................................70
Bảng 3.27. Kết quả so sánh hàm lƣợng PAR và CAF trong thuốc Panadol Extra của
phƣơng pháp quang phổ đạo hàm với phƣơng pháp HPLC......................................71

11. 8
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1. Phổ hấp thụ phân tử của dung dịch PAR 5 µg/mL và CAF µg/mL trong
dung môi nƣớc cất.....................................................................................................41
Hình 3.2. Phổ hấp thụ phân tử của dung dịch chuẩn PAR 5 µg/mL, CAF 5 µg/mL
và hỗn hợp PAR 5 µg/mL và CAF 5 µg/mL.............................................................42
Hình 3.3. Phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn PAR 5 µg/mL trong thời gian 7 giờ....43
Hình 3.4. Phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn CAF 5 µg/mL trong thời gian 7 giờ....43
Hình 3.5. Phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn hỗn hợp PAR 5 µg/mL và CAF 5
µg/mL trong thời gian 7 giờ......................................................................................43
Hình 3.6. Phổ đạo hàm bậc 1 của dung dịch chuẩn PAR 5 µg/mL và CAF 5 µg/mL
...................................................................................................................................44
Hình 3.7. Phổ đạo hàm của dung dịch chuẩn PAR ở các nồng độ khác nhau ..........45
Hình 3.8. Phổ đạo hàm dung dịch hỗn hợp với nồng độ PAR khác nhau ................46
Hình 3.9. Phổ đạo hàm của dung dịch chuẩn CAF ở các nồng độ khác nhau..........47
Hình 3.10. Phổ đạo hàm của dung dịch chuẩn PAR 2,5 µg/mL, CAF 2,5 µg/mL và
hỗn hợp PAR 2,5 µg/mL và CAF 2,5 µg/mL ...........................................................48
Hình 3.11. Phƣơng trình hồi quy tuyến tính của PAR tại bƣớc sóng 260 nm ..........50
Hình 3.12. Phƣơng trình hồi quy tuyến tính của CAF tại bƣớc sóng216,4 nm ........52
Hình 3.13. Sơ đồ quy trình xác định đồng thời PAR và CAF ..................................59
Hình 3.14. Phổ hấp thụ các dung dịch trong quá trình tính độ thu hồi thuốc Panadol
Extra ..........................................................................................................................66
Hình 3.15. Phổ hấp thụ các dung dịch trong quá trình tính độ thu hồi thuốc Colocol
Extra ..........................................................................................................................68

12. 9
MỞ ĐẦU
Trong Y dƣợc, thƣờng kết hợp hai thành phần paracetamol (PAR) và cafein
(CAF) để tăng hiệu quả điều trị các cơn đau nhức, hạ sốt. Trong đó PAR là chất có
tác dụng hạ sốt, giảm đau, CAF là chất kích thích, có tác dụng làm hƣng phấn, kéo
dài thời gian tỉnh táo. Các dữ liệu lâm sàng cho thấy sự kết hợp PAR - CAF làm cho
tác dụng giảm đau tốt hơn nhiều so với paracetamol thông thƣờng. Tuy nhiên việc
sử dụng quá liều PAR có thể gây suy gan, quá liều CAF có thể gây đau thƣợng vị,
nôn, tăng bài niệu, nhịp tim nhanh, kích thích thần kinh trung ƣơng (mất ngủ, thao
thức, kích động, bối rối, hoảng sợ, run, co giật). Do đó, việc phân tích xác định hai
thành phần này trong dƣợc phẩm kết hợp là nhiệm vụ bức thiết.
Để phân tích xác định hai thành phần PAR và CAF trong dƣợc phẩm,
phƣơng pháp đang đƣợc phát triển sử dụng là phƣơng pháp HPLC [14], [25], [32],
[33], [39], [41]. Phƣơng pháp HPLC có độ lặp lại và độ chính xác cao, thể tích mẫu
nhỏ, định lƣợng dễ dàng nhƣng có nhƣợc điểm là đòi hỏi hóa chất và dung môi có
độ tinh khiết cao, trang thiết bị phức tạp, đắt tiền. Trong khi đó, trên thế giới hiện
nay đã có nhiều công trình nghiên cứu và công bố các phƣơng pháp để xác định
đồng thời các chất có phổ hấp thụ xen phủ nhau nhƣ: phƣơng pháp quang phổ đạo
hàm, phƣơng pháp Vierordt, phƣơng pháp sai phân, phƣơng pháp bình phƣơng tối
thiểu, phƣơng pháp lọc Kalman, các phƣơng pháp phân tích hồi qui đa biến tuyến
tính... Các phƣơng pháp trắc quang này cho độ nhạy, độ tin cậy cao, không cần tách
chiết, tốn ít thời gian với giá thành rẻ [18], [19], [29], [42].
Ở Việt Nam, nghiên cứu và áp dụng phƣơng pháp quang phổ đạo hàm,
phƣơng pháp chemometrics để xác định các chất hữu cơ và vô cơ trong dƣợc phẩm
cho nhiều kết quả rất tích cực, chất lƣợng khiến cho hai kỹ thuật này có thể trở
thành công cụ phân tích mạnh mẽ và thuận tiện thay thế cho HPLC [9], [10], [15]
[16], [17].
Với mong muốn đề xuất phƣơng pháp định lƣợng đồng thời hỗn hợp hai
thành phần có khả năng ứng dụng trong công tác kiểm nghiệm thuốc, chúng tôi tiến
hành đề tài: “Xác định đồng thời paracetamol và cafein trong dược phẩm bằng

13. 10
phương pháp quang phổ đạo hàm và phương pháp chemometrics”.

14. 11
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÁC ĐỊNH LUẬT CƠ SỞ CỦA SỰ HẤP THỤ ÁNH SÁNG
1.1.1. Định luật Bouguer – Lambert – Beer
Định luật Bougeur – Lambert – Beer mô tả mối quan hệ tuyến tính giữa độ
hấp thụ quang (gọi tắt là độ hấp thụ) của dung dịch với nồng độ của các cấu tử hấp
thụ ánh sáng trong dung dịch. Định luật Bougeur – Lambert – Beer (viết tắt là định
luật Beer) đƣợc biểu diễn bằng phƣơng trình sau:Aλ = λ.l.C (1.1)
Trong đó: Aλ : độ hấp thụ quang của chất tại bƣớc sóng λ
λ : hệ số hấp thụ của chất tại bƣớc sóng λ
l: chiều dày cuvet đựng mẫu (cm)
C: nồng độ của cấu tử (mol/l)
Điều kiện sử dụng định luật:
+ Chùm tia sáng đơn sắc
+ Dung dịch phải trong suốt, nằm trong khoảng nồng độ thích hợp
+ Chất phân tích phải bền dƣới tác dụng của tia UV-VIS
1.1.2 Tính chất cộng tính độ hấp thụ
Để xác định các cấu tử trong hỗn hợp mà phổ hấp thụ của chúng xen phủ
nhau bằng phƣơng pháp trắc quang thì độ hấp thụ của các cấu tử trong hỗn hợp đó
phải tuân theo định luật Beer và có tính chất cộng tính.
Tính chất cộng tính độ hấp thụ: độ hấp thụ của dung dịch hỗn hợp tại một
bƣớc sóng bất kỳ bằng tổng độ hấp thụ của mỗi cấu tử trong hỗn hợp tại bƣớc sóng
đó. Phƣơng trình biểu diễn tính chất cộng tính độ hấp thụ:
n n
i, i, i
i 1 i 1
A A .b.C  
 
    (1.2)

15. 12
Trong đó: Ci: nồng độ cấu tử thứ i trong dung dịch
A : độ hấp thụ của dung dịch chứa n cấu tử tại bƣớc sóng 
i,A  : độ hấp thụ của cấu tử thứ i tại bƣớc sóng 
i, : hệ số hấp thụ phân tử của cấu tử thứ i tại bƣớc sóng 
n: số cấu tử hấp thụ ánh sáng có trong dung dịch
1.2. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH QUANG PHỔ UV-VIS XÁC
ĐỊNH CÁC CẤU TỬ CÓ PHỔ HẤP THỤ XEN PHỦ NHAU
Phƣơng pháp đƣờng chuẩn, phƣơng pháp thêm chuẩn, phƣơng pháp vi sai là
những phƣơng pháp đƣợc áp dụng để xác định các cấu tử trong dung dịch có phổ
hấp thụ không xen phủ nhau và tuân theo định luật Beer. Tuy nhiên, đối với dung
dịch hỗn hợp mà các cấu tử có phổ hấp thụ xen phủ nhau thì việc tính toán rất phức
tạp. Vì vậy, dựa trên cơ sở định luật Beer nhiều phƣơng pháp phân tích đã ra đời
cho phép xác định các cấu tử trong hỗn hợp có phổ hấp thụ xen phủ nhau mà không
cần che, tách.Sau đây là một số phƣơng pháp trắc quang xác định các chất có phổ
hấp thụ xen phủ nhau.
1.2.1. Phƣơng pháp quang phổ đạo hàm [2],[4]
Phổ hấp thụ quang của các cấu tử là hàm của độ dài bƣớc sóng ánh sáng tới
(A = f()). Phổ đạo hàm của độ hấp thụ quang theo bƣớc sóng  đƣợc biểu diễn
bằng phƣơng trình:
Đạo hàm bậc 0 : A0(λ) = A = f(λ)
Đạo hàm bậc 1 của A : A1(λ) = dA/dλ = f '
(λ)
Đạo hàm bậc 2 của A : A2(λ) = d2
A/dλ2
= f "
(λ)
....
Đạo hàm bậc n của A : An(λ) = dn
A/dλn
= fn
(λ) (1.5)
Theo định luật hấp thụ quang của Bougeur – Lambert – Beer ta có:

16. 13
A0(λ) = A = ε.b.C
A1(λ) = dA/dλ = (dε/dλ).b.C
A2(λ) = d2
A/dλ2
= (d2
ε/dλ2
).b.C
....
An(λ) = dn
A/dλn
= (dn
ε/dλn
).b.C (1.6)
Vì độ hấp thụ của dung dịch có tính cộng tính nên:
An(λ)total = An(λ)1 + An(λ)2 +...+ An(λ)m (1.7)
Trong đó An(λ)1, An(λ)2, ... , An(λ)m: giá trị đạo hàm bậc n độ hấp thụ của hệ
chứa riêng từng cấu tử 1, 2, …, m tại bƣớc sóng λ; An(λ)total : giá trị đạo hàm bậc n
độ hấp thụ của hệ tại bƣớc sóng λ.
Nhƣ vậy, phổ đạo hàm bậc n của một dung dịch hỗn hợp bằng tổng phổ đạo
hàm bậc n của dung dịch chứa từng cấu tử trong hỗn hợp.
Bậc đạo hàm càng cao thì cƣờng độ hấp thụ quang suy giảm rất nhanh (theo
hàm số mũ). Do đó, trong thực tế chỉ nên chọn bậc đạo hàm nào mà đỉnh hấp thụ
của hai chất vừa tách khỏi nhau và không còn vùng chen lấn phổ, không nhất thiết
phải chọn bậc đạo hàm cao cho tất cả. Nghĩa là ta phải chọn bƣớc sóng định lƣợng
của mỗi chất với bậc đạo hàm thích hợp đã chọn, sao cho tại bƣớc sóng định lƣợng
đó giá trị phổ đạo hàm của chất cần phân tích cực đại hoặc khác 0, còn giá trị phổ
đạo hàm của các chất khác bằng 0 và đó là điểm cắt zero của phổ đạo hàm.
Vì vậy, để định lƣợng một chất theo phƣơng pháp quang phổ đạo hàm cần
tiến hành:
- Quét phổ đạo hàm, tìm bƣớc sóng định lƣợng cho mỗi chất trong hỗn hợp
với bậc đạo hàm thích hợp đã chọn.
- Xác định nồng độ các chất trong mẫu theo phƣơng pháp đƣờng chuẩn hay
phƣơng pháp đƣờng chuẩn thêm chuẩn tùy theo yêu cầu của công việc phân tích.
- Trong phép đo phổ đạo hàm, để bù lại sự giảm về cƣờng độ giá trị phổ đạo
hàm ngƣời ta phải tăng độ khuyếch đại tín hiệu đo lên nhiều lần.

17. 14
Ƣu điểm của phƣơng pháp: Xác định các chất có phổ hấp thụ xen phủ nhau
hoặc rất sát nhau. Tăng độ tƣơng phản giữa các phổ có độ bán rộng khác nhau.
Nhƣợc điểm của phƣơng pháp: Khi bậc đạo hàm càng cao thì độ nhạy phép
đo càng giảm. Đối với những chất có phổ tƣơng tự nhau hay hỗn hợp phức tạp có
nhiều cấu tử có phổ hấp thụ xen phủ nhau thì khó áp dụng phổ đạo hàm.
1.2.2. Phƣơng pháp phổ toàn phần (phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu hệ đa
biến) [1],[2],[4]
Hạn chế của phƣơng pháp Vierordt là sử dụng dữ liệu ít, trong khi đó mỗi giá
trị đo bao giờ cũng kèm thêm sai số đo của thiết bị, điều đó dẫn đến kết quả tính
toán không đƣợc chính xác. Phƣơng pháp phổ toàn phần sử dụng toàn bộ dữ liệu
phổ đo đƣợc để tính toán. Do bản chất của phƣơng pháp nên gọi đây là phƣơng
pháp bình phƣơng tối thiểu hệ đa biến.
Áp dụng định luật Beer cho hệ gồm n cấu tử tại m bƣớc sóng (m > n) và độ
hấp thụ của hệ có tính chất cộng tính tại một bƣớc sóng.
Đặt i ie .b  , Y A và i ix C
Với: i : độ hấp thụ phân tử của các cấu tử thứ i.
Ci: nồng độ của cấu tử thứ i trong hỗn hợp.
Ta đƣợc hệ phƣơng trình tuyến tính gồm m phƣơng trình, n ẩn số:
Y1= e11x1 + e12x2 + ... + e1ixi + ... + e1nxn
Y2= e21x1 + e22x2 + ... + e2ixi + ... + e2nxn
Yj= ej1x1 + ej2x2 + ... + ejixi + ... + ejnxn (1.8)
...
Ym= em1x1 + em2x2 + ... + emixi + ... + emnxn
Khi đo phổ hấp thụ quang của dung dịch ở bƣớc sóng thứ j ta đƣợc giá trị yj.
Giá trị này thƣờng mắc phải sai số đo nên yj sẽ khác với giá trị thực Yj một đại
lƣợng sj. Trong đó sj là sai số đo và sj = yj - Yj. (1.9)

18. 15
Hàm biểu diễn sai số bình phƣơng toàn phần:
 
2m m
2
j j j j1 1 j2 2 ji i jn n
j 1 j 1
S (y Y ) y e x e x ... e x ... e x
 
           
(1.10)
Để S đạt cực tiểu thì đạo hàm của S theo các biến xi phải bằng 0. Nếu ta lấy
đạo hàm S theo biến x1 và cho đạo hàm bằng 0 sẽ nhận đƣợc phƣơng trình sau:
 
m
j j1 1 j2 2 ji i jn n j1 j j1
j 11
dS
2 y e x e x ... e x ... e x e y .( e ) 0
dx 
           

m m m m m
2
j1 1 j1 j2 2 j1 ji i j1 jn n j1 j
j 1 j 1 j 1 j 1 j 1
e x e e x ... e e x ... e e x e y 0
    
          
(1.11)
Tƣơng tự, cũng lấy đạo hàm S theo các biến xi còn lại và cho các đạo hàm
này bằng 0, kết hợp với phƣơng trình (1.11) ở trên ta đƣợc hệ phƣơng trình sau:
m m m m m
2
1 j1 2 j1 j2 i j1 ji n j1 jn j1 j
j 1 j 1 j 1 j 1 j 1
x e x e e ... x e e ... x e e e y 0
    
          
m m m m m
2
1 j1 j2 2 j2 i j2 ji n j2 jn j2 j
j 1 j 1 j 1 j 1 j 1
x e e x e ... x e e ... x e e e y 0
    
         
... (1.12)
m m m m m
2
1 j1 ji 2 j2 ji i ji n ji jn ji j
j 1 j 1 j 1 j 1 j 1
x e e x e e ... x e ... x e e e y 0
    
          
.
m m m m m
2
1 j1 jn 2 j2 jn i ji jn n jn jn j
j 1 j 1 j 1 j 1 j 1
x e e x e e ... x e e ... x e e y 0
    
          
Đặt
m
ki ji jk
j 1
a e e

  ,
m
k jk j
j 1
b e y

  ; Với i 1,n và k 1,n
Ta đƣợc hệ phƣơng trình viết gọn lại nhƣ sau:
a11.x1 + a12.x2 + … + a1ixi + … + a1n.xn = b1
a21.x1 + a22.x2 + … + a2ixi + … + a2n.xn = b2

19. 16
… (1.13)
ak1.x1 + ak2.x2 + … + akixi + … + akn.xn = bk
…
an1.x1 + an2.x2 + … + anixi + … + ann.xn = bn
Các giá trị aki, bk trong hệ (1.13) đƣợc tính từ các giá trị đo ban đầu eji thông
qua phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu. Hệ phƣơng trình (1.13) là một hệ phƣơng
trình tuyến tính gồm n phƣơng trình, n ẩn số, giải hệ này để xác định nồng độ của
các cấu tử xi trong hệ bằng phƣơng pháp khử Gauss. Phần mềm để giải theo phƣơng
pháp phổ toàn phần là phần mềm “Simulan1.exe”.
Ƣu điểm của phƣơng pháp: Có thể sử dụng toàn bộ số liệu phổ để lập ra hệ
phƣơng trình tuyến tính có số phƣơng trình nhiều hơn số ẩn số. Quá trình biến đổi
ma trận dựa trên nguyên tắc của phép bình phƣơng tối thiểu sẽ mắc sai số nhỏ nhất,
do đó nâng cao độ chính xác của phép xác định. Nồng độ đƣợc tính toán tƣơng đối
nhanh và có thể dùng cho các hỗn hợp phức tạp.
Nhƣợc điểm của phƣơng pháp: Cần phải biết thành phần định tính của mẫu.
Khi các cấu tử có tƣơng tác với nhau tạo ra hiệu ứng quang học làm thay đổi hệ số
hấp thụ của từng cấu tử nên kết quả phân tích cũng không chính xác.
1.2.3. Phƣơng pháp lọc Kalman [2],[4]
Ngƣời ta sử dụng thuật toán lọc Kalman để tính nồng độ của các cấu tử trong
dung dịch hỗn hợp. Thuật toán này yêu cầu độ hấp thụ theo bƣớc sóng phải thỏa
mãn tính cộng tính và sử dụng các tập tin dữ liệu về phổ của dung dịch hỗn hợp và
dung dịch chuẩn. Thuật toán hoạt động trên các file dữ liệu phổ đã ghi đƣợc và xác
định sự đóng góp về phổ của mỗi cấu tử tại các điểm số liệu. Hoạt động của thuật
toán Kalman cụ thể nhƣ sau:
- Lấy điểm số liệu đầu tiên trong tệp dữ liệu phổ và xác định sự đóng góp của
mỗi cấu tử tại điểm số liệu đó.
- Lấy điểm số liệu thứ hai (đƣợc xác định bởi giá trị khoảng Kalman) và xác
định sự đóng góp của mỗi cấu tử tại điểm số liệu đó. Chƣơng trình lọc đƣợc lặp lại

20. 17
cho đến khi đủ số giá trị nồng độ (đã đƣợc đặt trƣớc) cho mỗi cấu tử để bắt đầu lấy
giá trị trung bình cho nồng độ mỗi cấu tử. Đối với mỗi cấu tử phần lọc sẽ:
+ Lấy giá trị trung bình của nồng độ mỗi cấu tử, xác định độ lệch chuẩn
tƣơng đối RSD.
+ So sánh RSD với độ lệch chuẩn tối đa cho phép E (đã đƣợc đặt trƣớc). Nếu
RSD < E thì kết quả tính toán sẽ đƣợc thông báo dƣới dạng nồng độ trung bình. Nếu
RSD > E thì thuật toán sẽ loại bỏ giá trị tính đƣợc từ điểm số liệu ban đầu; Tính giá
trị nồng độ tại điểm số liệu tiếp theo và bổ sung giá trị này vào các giá trị nồng độ
còn lại. Sau đó tính giá trị nồng độ trung bình và RSD của những giá trị nồng độ
này và tiếp tục so sánh với sai số cho phép E.
Việc tính toán sẽ đƣợc thực hiện trên toàn bộ khoảng lọc Kalman (đã đƣợc
chọn). Nếu kết thúc quá trình tính, RSD của các số liệu tính đƣợc lớn hơn giá trị sai
số cho trƣớc thì nồng độ của cấu tử đó sẽ là 0. Khi đó cần phải giảm số giá trị nồng
độ mặc định ở trong tập dữ liệu (ghi nhận các nồng độ của các cấu tử đang tính)
hoặc tăng giá trị sai số mặc định.
1.2.4. Phƣơng pháp Vierordt [2],[4]
Dựa vào định luật Beer và tính chất cộng tính của độ hấp thụ quang, đo độ
hấp thụ quang của dung dịch mẫu ở các bƣớc sóng khác nhau để thiết lập hệ phƣơng
trình bậc nhất có số ẩn bằng số cấu tử cần xác định. Giải hệ phƣơng trình và tính
nồng độ các cấu tử. Đối với hệ hai cấu tử, ta có hệ phƣơng trình:
1( ) 11 1 12 2A .b.C .b.C    
2( ) 21 1 22 2A .b.C .b.C    
Trong đó: 1( )A 
, 2( )A 
: độ hấp thụ quang của hai cấu tử ở bƣớc sóng λ1, λ2
ε11, ε12: hệ số hấp thụ phân tử của cấu tử 1 và cấu tử 2 ở bƣớc sóng λ1
ε21, ε22: hệ số hấp thụ phân tử của cấu tử 1 và cấu tử 2 ở bƣớc sóng λ2
C1, C2: nồng độ của cấu tử 1 và cấu tử 2 có mặt trong hệ
Với hệ gồm n cấu tử cần xác định, ta phải lập hệ n phƣơng trình. Ta có hệ
(1.14)

21. 18
phƣơng trình Vierordt viết gọn là:
i i,j j i, j jA .b.C k .C   
với i 1,n và j 1, n (1.15)
Trong đó: Cj: nồng độ của cấu tử thứ j trong dung dịch
Ai: tổng độ hấp thụ của dung dịch (n cấu tử) tại bƣớc sóng thứ i (λi)
εi,j: hệ số hấp thụ phân tử của cấu tử j tại bƣớc sóng thứ i
Ƣu điểm của phƣơng pháp: khi hỗn hợp có ít cấu tử, phổ xen lẫn nhau không
nhiều và thiết bị đo tốt thì phƣơng pháp cho kết quả khá chính xác.
Nhƣợc điểm của phƣơng pháp: với hệ nhiều cấu tử, đặc biệt khi phổ của các
cấu tử xen phủ nhau nhiều hoặc thiết bị đo không tốt thì phƣơng pháp có độ chính
xác rất kém.
1.2.5. Phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu [1],[2],[4]
Phƣơng pháp này còn gọi là ma trận K (K-matrix). Trong hệ gồm n cấu tử
thỏa mãn định luật Beer và tính chất cộng tính độ hấp thụ:
1 2 n j
n
1 2 n j
j 1
A k C k C ... k C k C    

     
Sau khi quét phổ, nếu lấy số bƣớc sóng m bằng số cấu tử thì ta sẽ lập đƣợc hệ
phƣơng trình tuyến tính với số ẩn bằng số phƣơng trình (m = n). Nếu lấy m > n thì
sẽ đƣợc hệ phƣơng trình có số phƣơng trình nhiều hơn ẩn số.
Phƣơng trình có thể viết dƣới dạng ma trận: A = KC (1.17)
Với A: vectơ độ hấp thụ có m hàng, 1 cột.
K: ma trận m hàng, n cột của hệ số hấp thụ phân tử
C: vectơ nồng độ của cấu tử có n hàng, 1 cột
Để xác định đƣợc C, phải xác định đƣợc hệ số hấp thụ phân tử dựa vào phổ
của các cấu tử tinh khiết. Ma trận hệ số hấp thụ K đƣợc tính:
K = AC-1
= AC' (CC')-1
(1.18)
(1.16)

22. 19
Dựa vào các giá trị độ hấp thụ A0 và các hệ số hấp thụ phân tử K, nồng độ
của các chất phân tích C0 trong các mẫu đƣợc tính theo phƣơng trình:
C0 = A0K-1
= A0K' (KK')-1
(1.19)
Trong đó: A, K, C: là các ma trận nhƣ trên
C': là ma trận chuyển vị của ma trận C
C-1
, K-1
: là ma trận nghịch đảo của ma trận C và ma trận K
C0: là vectơ của nồng độ mẫu
Ƣu điểm của phƣơng pháp: Sử dụng toàn bộ số liệu phổ để lập ra hệ phƣơng
trình tuyến tính có số phƣơng trình nhiều hơn số ẩn. Quá trình biến đổi ma trận theo
nguyên tắc của phép bình phƣơng tối thiểu sẽ mắc sai số nhỏ nhất, nâng cao độ
chính xác của phép xác định.
Nhƣợc điểm của phƣơng pháp: Cần phải biết đƣợc thành phần định tính của
mẫu và trong trƣờng hợp các cấu tử có tƣơng tác với nhau tạo ra hiệu ứng quang
học làm thay đổi hệ số hấp thụ của từng cấu tử sẽ cho kết quả không chính xác.
1.2.6. Phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu từng phần (PLS) [2][4]
PLS là một phƣơng pháp dùng để xây dựng mối quan hệ hồi quy giữa hai
biến số với biến số ẩn trong ma trận X và ma trận Y, trong đó X là biến độc lập và
biến phụ thuộc là Y.
Mục đích của PLS là giảm số biến và tạo ra các phần tử không liên quan sau
đó biểu diễn phƣơng trình bình phƣơng tối thiểu với những phần tử này. PLS mô
hình hoá đồng thời cả 2 biến X và Y để tìm ra những biến ẩn trong X, từ đó có thể
đoán đƣợc biến ẩn trong Y.
Ƣu điểm của phƣơng pháp: Dùng đƣợc cho các hỗn hợp phức tạp.
Nhƣợc điểm của phƣơng pháp: Tính toán chậm hơn phƣơng pháp bình
phƣơng tối thiểu hệ đa biến. Việc chọn các mẫu chuẩn là tƣơng đối khó, cần phải
tránh các nồng độ của các cấu tử gây nên sự đồng tuyến tính, phải dùng nhiều mẫu.
1.2.7. Phƣơng pháp hồi quy cấu tử chính (PCR) [2],[4]

23. 20
PCR là phƣơng pháp mở rộng về phƣơng trình hồi quy sử dụng phân tích đa
biến áp dụng cho tập số liệu có rất nhiều biến nhƣ PLS. Phƣơng pháp này sử dụng
phƣơng trình hồi quy để chuyển đổi những trị số cấu tử chính (PCscores) thành
nồng độ, quy trình này còn đƣợc gọi là phân tích thành phần. PCR là một trong
những công cụ phân tích hữu hiệu cho phép giảm số biến trong tập số liệu nhằm đạt
đƣợc biểu diễn hai chiều từ tập số liệu đa chiều bằng cách tìm ra giá trị phƣơng sai
lớn nhất với số cấu tử chính ít nhất.
1.3. TỔNG QUAN VỀ PARACETAMOL [6],[7]
1.3.1. Giới thiệu chung
Paracetamol hay acetaminophen (tên đƣợc chấp nhận tại Hoa Kỳ) là thuốc có
tác dụng hạ sốt và giảm đau, tuy nhiên không nhƣ aspirin nó không hoặc ít có tác
dụng chống viêm. So với các thuốc chống viêm không steroit (nonsteroidal
antiinflammatory drugs - NSAIDs), paracetamol có rất ít tác dụng phụ với liều điều
trị nên đƣợc cung cấp không cần kê đơn ở hầu hết các nƣớc.
- Tên IUPAC hệ thống: N-(4-hydroxyphenyl) acetamide
- Công thức phân tử: C8H9NO2
- Khối lƣợng phân tử: 151,17 g/mol
- Công thức cấu tạo:
* Tính chất vật lý
- Paracetamol là chất bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị đắng nhẹ.
- Khối lƣợng riêng: 1,263 g/cm . 3
- Nhiệt độ nóng chảy: 1690
C
- Độ tan trong nƣớc: 0,1 ÷ 0,5g/100mL nƣớc tại 22 C. Ngoài ra còn có khả

24. 21
năng tan trong etanol, dung dịch kiềm, dung dịch axit...
- Chế phẩm tan ít trong nƣớc, tan nhiều hơn trong nƣớc sôi, khó tan trong
clorofom, ete, etanol và các dung dịch kiềm... dung dịch bão hòa trong nƣớc có pH
khoảng 5,3÷5,6; pKa=9,51
* Tính chất hóa học
Tính chất hóa học của PAR do nhóm -OH, nhóm chức acetamit và tính chất
của nhân thơm quyết định. Sự có mặt của 2 nhóm hydroxyl và acetamit làm cho
nhân benzen đƣợc hoạt hóa có thể phản ứng đƣợc với các hợp chất thơm có ái lực
electron. Sự liên kết giữa nhóm acetamit, hydroxyl với vòng benzen làm giảm tính
bazơ của nhóm amit và làm tăng tính axit của nhóm hydroxyl. Nhóm - OH là m cho
chế phẩm có tính axit và khi tác dụng với dung dịch muối sắt (III) cho màu tím.
Đun nóng với dung dịch HCl thì bị thủy phân , thêm nƣớc thì không có kết tủa vì p-
aminophenol tạo thành tan trong axit. Thêm thuốc thử kali dicromat thì có kết tủa
màu tím (khác với phenacetin là không chuyển sang đỏ) . Quá trình xảy ra chủ yếu
là:
Đun nóng dung dịch trên với axit sunfuric có mùi axit axetic có thể dùng
phản ứng này để định tính và định lƣợng PAR.
* Tổng hợp
Tổng hợp PAR từ nguyên liệu đầu là phenol, đƣợc tổng hợp theo 4 bƣớc:
- Phenol đƣợc nitro hóa bởi axit sunfuric và natri nitrit tạo ra hỗn hợp đồng
phân o,p – nitro phenol.

25. 22
- Đồng phân para đƣợc tách ra khỏi đồng phân ortho bằng phản ứng thủy
phân.
- Khử para-nitro phenol bằng NaBH4 trong môi trƣờng kiềm cho ra para-
aminophenol.
- Para-aminophenol phản ứng với anhidrit axetic cho ra PAR
Ngoài ra một tổng hợp công nghiệp thay thế đƣợc phát triển bởi Hoechst-
Celanese liên quan đến axit hóa trực tiếp của phenol với anhidric axit đƣợc xúc tác
bởi HF
* Công dụng
PAR là thuốc giảm đau hạ sốt hữu hiệu có thể thay thế aspirin, tuy vậy khác
với aspirin, PAR không có hiệu quả điều trị viêm. Với liều ngang nhau tính theo
gam, PAR có tác dụng giảm đau và hạ sốt tƣơng tự nhƣ aspirin. PAR làm giảm thân
nhiệt ở ngƣời bệnh sốt, nhƣng hiếm khi làm giảm thân nhiệt ở ngƣời bình thƣờng.
* Quá liều
Nhiễm độc PAR có thể do dùng một liều độc duy nhất hoặc do uống lặp lại
liều lớn hơn PAR hoặc do uống thuốc dài ngày. Hoại tử gan phụ thuộc liều là tác
dụng độc cấp tính nghiêm trọng nhất do quá liều và có thể gây tử vong.

26. 23
Khi bị ngộ độc nặng, ban đầu có thể kích thích hệ thần kinh trung ƣơng, kích
động và mê sảng. Tiếp theo có thể là ức chế hệ thần kinh trung ƣơng, sững sờ, hạ
thân nhiệt, mệt lả, thở nhanh, nông, mạch nhanh, yếu, không đều, huyết áp thấp và
suy tuần hoàn. Cơn co giật ngẹt thở gây tử vong có thể xảy ra. Thƣờng hôn mê xảy
ra trƣớc khi chết đột ngột hoặc sau vài ngày hôn mê.
Khi nhiễm độc nặng cần rửa dạ dày trong mọi trƣờng hợp, tốt nhất trong
vòng 4 giờ sau khi uống. Liệu pháp giải độc chính là dùng những hợp chất
sulfhydryl, có lẽ tác động một phần do bổ sung dự trữ glutathion ở gan. N -
acetylcystein có tác dụng khi uống hoặc tiêm tĩnh mạch. Ngoài ra có thể dùng thuốc
tẩy muối hoặc nƣớc chè đặc để làm giảm hấp thu PAR.
1.3.2. Một số phƣơng pháp xác định riêng lẽ PAR
Phương pháp trắc quang
J Pharm Biomed vào năm 1998 đƣa ra phƣơng pháp trắc quang để xác định
PAR. Phƣơng pháp này phụ thuộc vào phản ứng của PAR với amonium molypdate
trong môi trƣờng kiềm mạnh dƣới dạng phức màu xanh. Độ hấp thụ cực đại tại
bƣớc sóng 670 nm [27].
Phƣơng pháp quang phổ để xác định PAR trong dƣợc phẩm đƣợc Carado A
cùng các cộng sự thực hiện năm 2000 dựa trên việc phân hủy dung dịch PAR trong
lò vi sóng với môi trƣờng NaOH 3,5 M cùng với o-cresol. Phƣơng pháp có khoảng
tuyến tính là 0,6-20 µg/mL [21].
Một phƣơng pháp đơn giản để xác định nhanh chóng PAR trong dƣợc phẩm
đƣợc Van Staden JK và Tsanwani MM thực hiện năm 2002 liên quan đến quá trình
oxy hóa PAR do kali hexacryanoferrate (III) và một phản ứng tiếp theo với phenol
trong sự hiện diện của amoniac. Phức tạo thành đƣợc đo ở bƣớc sóng 630 nm. Giới
hạn phát hiện là 0,2 µg/mL, tuyến tính đến 60 µg/mL với độ lệch tƣơng đối là 1,2 %
(n=10) [40].
Năm 2013 Mohammed Khair E.A. Al-Shwaiyat đã xác định hàm lƣợng PAR
trong dƣợc phẩm bằng phƣơng pháp trắc quang thông qua việc tạo phức màu xanh
của PAR và 18 – molybdo – 2 - phosphate. Phức đƣợc đo tại bƣớc sóng 820 nm,

27. 24
giới hạn phát hiện là 0,03 µg/mL, khoảng tuyến tính 0,3-7,5 µg/mL. Độ lệch chuẩn
tƣơng đối không vƣợt quá 2,5 %. Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng thành công
trong việc xác định hàm lƣợng của PAR trong dƣợc phẩm [34].
Phương pháp sắc ký
Năm 1998 Sinan Suzen, Cemal Akay và các cộng sự sử dụng HPLC để xác
định hàm lƣợng PAR trong dƣợc phẩm, sử dụng cột C18; pha động là hỗn hợp dung
môi methanol và nƣớc theo tỉ lệ thể tích 1:2, tốc độ pha động là 2,56 phút với độ thu
hồi đạt 98,8% ± 0,83 [37].
Năm 2001, J.Meyer và U.Karst đã đƣa ra một phƣơng pháp mới đƣợc mô tả
cho việc xác định PAR trong nƣớc tiểu. Sau giai đoạn đảo ngƣợc HPLC tách, PAR
bị oxy hóa bởi H2O2 với peroxidase xúc tác. Với bƣớc sóng kích thích 329 nm và
bƣớc sóng phát xạ 435 nm. Mẫu nƣớc tiểu đƣợc pha loãng và tiêm trực tiếp mà
không cần xử lý thêm. Giới hạn phát hiện là 2.10-8
mol/L, giới hạn định lƣợng là
7.10-8
mol/L [26].
Năm 2010, Nadia M. Mostafa đã đƣa ra phƣơng pháp xác định PAR trong
dƣợc phẩm một cách đơn giản, nhạy cảm và chính xác. Bằng cách hòa tan thuốc
trong methanol sau đó quét một lớp mỏng lên silica G254. PAR đƣợc tách trên gel
silica sử dụng hỗn hợp pha động etyl axetic, benzen, axit axetic theo tỉ lệ thể tích
1:1:0,05. Đo độ hấp thụ của thuốc tiến hành ở 250 nm. Khoảng tuyến tính 5-20 µg/
mL [35].
1.4. TỔNG QUAN VỀ CAFFEIN [6],[7]
1.4.1. Giới thiệu chung
Cafein (CAF) là một hợp chất tự nhiên đƣợc tìm thấy trong lá, hạt và trái cây
của trên 63 loại nông sản tự nhiên và là một phần của một số nhóm các hợp chất
đƣợc biết đến nhƣ metylxathin. Cafein là một chất gây nghiện chủ động và thƣờng
đƣợc sử dụng nhƣ một loại dƣợc phẩm vì có tính chất của một chất kích thích thần
kinh ôn hoà và đƣợc bài tiết ra ngoài trong vài giờ sau khi đƣợc hấp thụ vào cơ thể.
- Tên quốc tế: Cafein.

28. 25
- Một số tên khác: Trimethylxanthine, Coffeine, Theine, Mateine, Guaranine,
Methyltheobromine hay 1,3,7-trimethylxanthine.
- Công thức phân tử: C8H10N4O2.
- Khối lƣợng mol phân tử: 194,19 (g/mol).
- Công thức cấu tạo:
- Tên IUPAC: 1,3,7-trimethylxanthine
* Tính chất vật lý
Cafein ở dƣới dạng tinh thể trắng, mịn hay bột kết tinh trắng, hoặc không
màu, không mùi, vị hơi đắng. Nhiệt độ nóng chảy ở khoảng 234 C-239C, vụn nát
ngoài không khí khô. Khi đun nóng ở 100 C sẽ mất nƣớc và thăng hoa ở khoảng
200 C.
Cafein tan ít trong nƣớc, dễ tan trong nƣớc sôi và clorofom, một phần trong
etanol (ở nhiệt độ bình thƣờng 1 lít nƣớc chỉ hòa tan 20g cafein, nhƣng 1 lít nƣớc
sôi hòa tan tới 700g cafein). Cafein tan trong các dung dịch axit và trong các dung
dịch đậm đặc của benzoat hay salicylat kiềm. Dung dịch cafein trong nƣớc có phản
ứng trung tính với giấy quỳ. Cafein rất giống 2 hợp chất sau:
- Theophylin: chất đƣợc sử dụng để điều trị bệnh suyễn.
- Theobromin: thành phần chính của ca cao.
* Tính chất hóa học
Cafein là một chất có tính bazơ yếu, chỉ tạo muối với các axit mạnh và các
muối này không bền, dễ bị phân hủy. Trong môi trƣờng kiềm cafein không bền, dễ
bị phân hủy thành chất cafeidin không có tác dụng nhƣ cafein nữa nhƣng không

29. 26
độc.
* Tổng hợp
CAF là một alcaloit có nhân purin đƣợc tìm thấy trong nhiều loại thực vật
nhƣ chè, cà phê, cacao... Nó đƣợc Runge chiết xuất năm 1920, Pelletier và
Caventou chiết đƣợc vào năm 1921. Do nhu cầu sử dụng ngày càng lớn nên ngày
nay đƣợc điều chế bằng phƣơng pháp tổng hợp hóa học.
Phƣơng pháp đi từ dẫn xuất của ure và axit xyanoaxetic theo sơ đồ sau:
Trong công nghiệp dƣợc phẩm còn sử dụng nguyên liệu có nhân purin để
tổng hợp caffeine, ví dụ axit uric lấy từ phân gà, phân chim.
CAF còn đƣợc điều chế bằng cách metyl hóa
Xanthin là dẫn chất hydroxy của nhân purin.

30. 27
Bản thân xathin không có tác dụng sinh học nhƣng dẫn chất metyl hóa của nó
là những chất có tác dụng tốt nhƣ :
Cafein Theophylin Theobomin
Cafein, theophylin và theobromin đều là những bazơ yếu do nguyên tử nitơ ở
vị trí 9. Theophylin và theobromin còn có tính axit vì chúng có một nguyên tử
hydro linh động ở nhóm imit (vị trí 7 đối với theophilin và vị trí 1 đối với
theobromin). Các hydro này có thể chuyển thành dạng enol với nguyên tử oxy bên
cạnh. Vì vậy theophilin và theobromin là những chất lƣ ng tính (vừa có tính kiềm
vừa có tính axit). Chúng có thể tạo muối dễ tan trong nƣớc với các axit và kiềm.
Trong môi trƣờng kiềm chúng có thể tạo muối với các muối kim loại khác
nhƣ muối bạc cho kết tủa trắng, muối coban cho kết tủa có màu (ứng dụng để định
tính các chất này). Cafein trong phân tử không có hydro linh động nên không có
tính axit mà chỉ là một bazơ yếu. Dựa vào sự khác nhau này để xác định giới hạn
tạp chất theophylin và theobromin trong cafein. Phản ứng chung của các alcaloit có
nhân xanthin là phản ứng vớ i amoniac. Cho các chế phẩm tác dụng với chất oxy
hóa (nhƣ Br2, H2O2, HNO3 ...) bằng cách đun trên nồi điện đến cạn , sau đó cho
tác dụng với amoniac thì có màu đỏ tía do tạo thành muối amoni của axit puric.
Trong số các dẫn xuất của xathin thì CAF có tác dụng kích thích thần kinh

31. 28
trung ƣơng tốt nhất.
* Công dụng
Cafein có tác dụng kích thích hoạt động hệ thần kinh trung ƣơng chọn lọc
trên vỏ não, làm tăng khả năng nhận thức, tăng khả năng làm việc trí óc, làm giảm
cảm giác mệt mỏi, buồn ngủ. Thuốc có tác dụng kích thích, liều cao làm tim đập
nhanh, co bóp mạnh, tăng lƣu lƣợng máu qua tim. Thuốc có tác dụng lợi tiểu nhƣng
kém theophyllin và theobromin.
*Ảnh hƣởng của cafein
Cafein khi dùng với liều lƣợng nhiều sẽ gây ra các ảnh hƣởng nhƣ căng
thẳng thần kinh, hƣng phấn, tăng huyết áp, giãn nở phế quản, lợi tiểu (từ
300mg/ngày trở lên), kích thích nhu động ruột, mất ngủ. Tổ chức y tế thế giới
(WHO) không xếp cafein vào nhóm các chất gây nghiện. Đến nay vẫn không có dấu
hiệu gì rõ ràng chứng minh cafein nguy hại đến sức khỏe, ngay cả những trƣờng
hợp sử dụng thƣờng xuyên cafein trong thời gian dài. Tuy nhiên việc dùng cafein
nhiều có thể dẫn tới sự phụ thuộc về tâm lý, trong trƣờng hợp này mùi vị cà phê,
khẩu vị ngƣời uống và truyền thống cũng đóng một vai trò quan trọng. Sự phụ
thuộc vào cafein có thể dẫn tới các biểu hiện nhƣ nhức đầu căng thẳng, run rẩy, hồi
hộp, thiếu tập trung, cáu giận, cơ thể cần khoảng 3 ngày để loại bỏ cafein, sau thời
gian này những tác dụng phụ sẽ hoàn toàn mất đi. Nếu dùng cafein với liều lƣợng
cao có thể làm tăng nhịp tim và lợi tiểu. Tuy vậy nếu uống những loại đồ uống
chậm giải phóng cafein nhƣ guarana hay chè đen thì có thể hạn chế đƣợc các ảnh
hƣởng tiêu cực của cafein cũng nhƣ tận dụng đƣợc các tác dụng của nó.
1.4.2. Một số phƣơng pháp xác định riêng lẽ CAF
Hàm lƣợng CAF có trong huyết thanh ngƣời và thức uống có cola đã đƣợc
Wenrui Jin và các cộng sự xác định bằng phƣơng pháp điện di mao quản vào năm
2000. Giới hạn phát hiện của CAF thu đƣợc là 2,9.10-4
mM và độ lệch chuẩn của
thời gian điện di và diện tích pic thu đƣợc của CAF lần lƣợt là 0,68 % và 2,3 %
[43].
Năm 2000, Guzin Alpdogan, Kadir Karabina, Sidika Sungurg dùng phƣơng

32. 29
pháp phổ đạo hàm để xác định CAF trong các loại nƣớc uống nhƣ cola, cà phê và
trà, phƣơng pháp sử dụng để đối chiếu là phƣơng pháp HPLC. Kết quả thu đƣợc với
phƣơng pháp trên là 2 µg/g; 1,5 µg/mL và 2 µg/g đối với trà, cola và cà phê [24].
1.5. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI PAR VÀ CAF
Năm 2001, M. Levent Altun dùng phƣơng pháp HPLC phân tích đồng thời
PAR, CAF và dipyrone, sử dụng cột C8 với tốc độ pha động là 1 ml/phút. Hệ dung
môi pha động đƣợc sử dụng gồm 0,01 M KH2PO4, methanol, acetonitrile, isopropyl
alcohol với tỉ lệ thể tích 420:20:30:30 và bƣớc sóng của đầu dò tại 215 nm. Khoảng
nồng độ tuyến tính của PAR, CAF và dipyrone lần lƣợt là 0,409 – 400 µg/mL,
0,151 – 200 µg/mL và 0,233 – 600 µg/mL [33].
M. Prodan và cộng sự (2003) đã xác định PAR và CAF trong thuốc bằng
phƣơng pháp HPLC sử dụng cột C18, dung môi pha động là methanol: nƣớc theo tỉ
lệ 40:60, tốc độ pha động là 0,5 ml/phút. Bƣớc sóng của đầu dò với mỗi chất là 249
nm và 279 nm [32].
H. Tavallali và M. Sheikhaei (2009) đã tiến hành xác định đồng thời PAR và
CAF bằng phƣơng pháp thêm chuẩn. Phƣơng pháp dựa trên sự khác nhau về khả
năng oxi hóa của hai chất cần xác định với Cu(II) neocuproine và sự tạo thành phức
Cu(I) neocuproine tại bƣớc sóng quang phổ là 453 nm và điều kiện pH là 5,0 với sự
có mặt của chất hoạt động bề mặt natri dodecyl sunfat. PAR đƣợc xác định trong
khoảng nồng độ 1,5 – 7,0 µg/mL và CAF đƣợc xác định trong khoảng nồng độ 0,1
– 3,0 µg/mL [25].
Viswanath Reddy Pyreddy cùng các cộng sự (2011) đã xác định đồng thời
PAR, CAF, pseudoephedrine và chlorpheniramine maleate trong dƣợc phẩm bằng
phƣơng pháp HPLC. Chƣơng trình sắc kí sử dụng cột C18 (150 nm, 4.6 mm và 3
µm) với chƣơng trình gradient nồng độ. Hệ dung môi pha động gồm dung dịch A là
đệm phosphate (1,0g KH2PO4 trong 1000 ml nƣớc) và dung dịch B là acetonitrile
với tốc độ pha động là 1 ml/phút ở 400 0
C tại bƣớc sóng 210 nm. Kết quả thu đƣợc
pic sắc kí của PAR, pseudoephedrine, CAF và chlorpheniramine maleate theo tƣơng
ứng 6,5; 9,7; 12,0; 16,2 phút. Khoảng nồng độ tuyến tính thu đƣợc của mỗi chất

33. 30
trong khoảng từ 10 – 60 µg/mL với hệ số tƣơng quan r=0,999 và độ thu hồi đạt 98 –
102% [41].
SM Ashraful Islam, Shamina Shultana, Muhammed Shahdaat Bin Sayeed và
Irin Dewan (2012) xác định đồng thời PAR và CAF bằng phƣơng pháp trắc quang
và HPLC sử dụng cột C18 với dung môi pha động là đệm photphat (pH=5,5) và
methanol theo tỉ lệ thể tích là 60:40, tốc độ pha động là 1 ml/phút tại bƣớc sóng 273
nm. Độ thu hồi đạt 99,29 – 100,19% khi phân tích bằng phƣơng pháp trắc quang và
đạt 99,14 – 100,25% khi phân tích bằng phƣơng pháp HPLC [39].
A. Hakan Aktas (2013) dùng ba kỹ thuật phân tích là hồi quy cấu tử chính,
bình phƣơng tối thiểu và mạng noron nhân tạo để xác định đồng thời CAF và PAR.
Dung môi đƣợc lựa chọn là HCl 0,1 M [18].
Ahmed Ashour cùng các cộng sự (2015) tiến hành xác định đồng thời PAR
và CAF sử dụng phƣơng pháp quang phổ đạo hàm bằng cách sử dụng bô lọc
Savitsky – Golay và wavelet. Các tác giả đã chọn dung môi HCl 1M để hòa tan hỗn
hợp PAR và CAF. [19].
Kuldeep delvadiya và cộng sự (2011) đã xác định đồng thời PAR, CAF và
propyphenazone trong dạng bào chế viên nén dựa trên sự cộng tính độ hấp thụ của
thuốc. Dung môi đƣợc lựa chọn là nƣớc cất hai lần. Cực đại hấp thụ đƣợc tìm thấy
của PAR ở 243 nm, của propyphenazone ở 266 nm, và của CAF ở 272,8 nm.
Khoảng tuyến tính tuân theo định luật Beer của PAR ở 243 nm là 2-16 µg/ml, ở 266
nm là 4-40 µg/ml và ở 272,8 nm là 6-60 µg/ml. Propyphenazone tuyến tính trong
khoảng 2-20 µg/ml ở cả 3 bƣớc sóng. Khoảng tuyến tính của CAF ở 272,8 nm và
266 nm là 2-20 µg/ml và ở 272,8 nm là 10-70 µg/ml. Phƣơng pháp cho độ lặp lại tốt
(<5%) và độ thu hồi 95-102% đối với cả 3 chất [29].
Ở Việt Nam, năm 2005 Thái Duy Thìn trong đề tài cấp Bộ đã sử dụng
phƣơng pháp HPLC với chƣơng trình sắc kí sử dụng cột C18 (250 x 4 mm, 10 µm),
pha động là dung dịch axit photphoric 0,75% trong hỗn hợp dung môi methanol :
nƣớc (35:65), tốc độ dòng là 1 ml/phút. Kết quả thu đƣợc thời gian lƣu của PAR và
CAF lần lƣợt là 2,219 và 6,041 phút. Độ lặp lại của phƣơng pháp tốt với sai số

34. 31
tƣơng đối nằm trong khoảng 0,54 – 1,07 % [8].
Trong luận vặn thạc sỹ năm 2013, Nguyễn Ngọc Yến Nhi và Vĩnh Đinh đã
xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời PAR và CAF bằng phƣơng pháp điện di
mao quản micelle điện động, xây dựng quy trình định lƣợng và tối ƣu hóa điều kiện
phân tích bằng phần mềm JMP. Phƣơng pháp có độ thu hồi 100,10 % và 99,2 %, độ
lặp lại 1,72 và 1,8 tƣơng ứng với PAR và CAF. Phƣơng pháp đƣợc áp dụng để xác
định PAR và CAF trong nhiều loại chế phẩm trên thị trƣờng [11].
Trong luận văn thạc sỹ năm 2014, Trƣơng Xuân Hiếu đã tiến hành xác định
đồng thời PAR, CAF và phenobarbital trong thuốc thần kinh D3 bằng phƣơng pháp
quang phổ hấp thụ UV-Vis sử dụng thuật toán lọc Kalman và phƣơng pháp HPLC.
Kết quả cho thấy cả hai phƣơng pháp đều có độ lặp lại và độ thu hồi tốt [5].

35. 32
CHƢƠNG 2
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Để thực hiện mục đích của luận văn là nghiên cứu xác định đồng thời PAR
và CAF trong dƣợc phẩm bằng phƣơng pháp quang phổ đạo hàm và phƣơng pháp
chemometrics, đề tài cần thực hiện những nội dung sau:
2.1.1. Khảo sát lựa chọn các điều kiện thí nghiệm thích hợp để xác định PAR
và CAF bằng phƣơng pháp chemometrics
- Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của PAR và CAF
- Khảo sát tính cộng tính của phổ hấp thụ phân tử của PAR và CAF
- Khảo sát sự ổn định phổ hấp thụ phân tử của PAR và CAF
2.1.2. Khảo sát lựa chọn các điều kiện thí nghiệm thích hợp để xác định PAR
và CAF bằng phƣơng pháp quang phổ đạo hàm
- Khảo sát phổ đạo hàm của PAR và CAF. Chọn bƣớc sóng thích hợp để xác
định PAR và trong dƣợc phẩm ứng với bậc phổ đạo hàm đã chọn;
- Khảo sát phổ đạo hàm của PAR và CAF với các nồng độ khác nhau;
- Khảo sát sự ảnh hƣởng qua lại của PAR và CAF trong dung dịch hỗn hợp.
- Khảo sát tính cộng tính của phổ đạo hàm
- Khảo sát khoảng tuyến tính của PAR và CAF
- Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng
2.1.3. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp
- Trên mẫu tự pha ở một tỉ lệ nồng độ xác định
- Trên mẫu tự pha ở các tỉ lệ nồng độ khác nhau
2.1.4. Đề xuất quy trình xác định PAR và CAF trong dƣợc phẩm
2.1.5. Áp dụng quy trình để xác định PAR và CAF trong dƣợc phẩm

36. 33
2.1.6. So sánh kết quả của hai phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.7. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích
- Độ thu hồi.
- So sánh với kết quả của phƣơng pháp HPLC.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp trắc quang - chemometrics
Áp dụng phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu dùng phổ toàn phần để xác định
đồng thời PAR và CAF (phần mềm SIMULANA.exe).
Tiến hành:
- Bƣớc 1: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn của mỗi cấu tử cần xác định và các
dung dịch hỗn hợp của chúng.
- Bƣớc 2: Quét phổ các dung dịch trong khoảng bƣớc sóng thích hợp, lƣu và
truy xuất số liệu đo đƣợc dƣới file dạng “.txt”.
- Bƣớc 3: Chạy chƣơng trình SIMULANA.exe để tính toán nồng độ các cấu
tử trong dung dịch hỗn hợp và sai số tƣơng đối của chúng.
2.2.2. Phƣơng pháp quang phổ đạo hàm
Tiến hành:
- Bƣớc 1: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn mỗi chất cần xác định và các dung
dịch hỗn hợp của chúng;
- Bƣớc 2: Quét phổ đạo hàm của dung dịch trong khoảng bƣớc sóng thích
hợp, chọn bƣớc sóng thích hợp để xác định từng chất ứng với bậc đạo hàm đã chọn;
- Bƣớc 3: Xây dựng đƣờng chuẩn của mỗi chất tại bƣớc sóng định lƣợng và
xác định hàm lƣợng của mỗi chất theo đƣờng chuẩn này.
2.2.3. Phƣơng pháp khảo sát đơn biến
Khảo sát các yếu tố để lựa chọn các điều kiện thí nghiệm thích hợp nhƣ dung
môi, thời gian ổn định của phổ đạo hàm mỗi chất, ảnh hƣởng của các chất trong hỗn

37. 34
hợp, ...
2.2.4. Phƣơng pháp thống kê
Việc đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích là một trong các yêu cầu
cần thiết khi nghiên cứu một phƣơng pháp phân tích. Độ tin cậy của phƣơng pháp
nghiên cứu đƣợc đánh giá thông qua các đại lƣợng thống kê nhƣ sai số tƣơng đối,
độ lặp lại, độ đúng, …
2.2.4.1. Sai số tương đối
0
0
C C
RE(%) .100
C


(2.1)
Trong đó, C: nồng độ của chất xác định đƣợc (µg/mL)
C0: nồng độ của chất đã biết trƣớc (µg/mL)
2.2.4.2. Khoảng tuyến tính
Trong phân tích công cụ ngƣời ta thƣờng thiết lập phƣơng trình đƣờng chuẩn
biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ chất phân tích và tín hiệu đo tƣơng ứng với
nồng độ đó. Từ đó suy ra nồng độ chất phân tích bằng phƣơng pháp nội suy. Trong
phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS thƣờng định lƣợng bằng phƣơng
pháp đƣờng chuẩn hay phƣơng pháp đƣờng chuẩn thêm chuẩn. Để kết quả phân tích
tin cậy, mật độ quang phải tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ với nồng độ chất phân
tích trong dung dịch mẫu. Mức độ tƣơng quan tuyến tính giữa tín hiệu đo và nồng
độ chất phân tích trên đƣờng chuẩn hoặc thêm chuẩn dạng y = a + bx đƣợc đánh giá
thông qua hệ số tƣơng quan R. Hệ số tƣơng quan R đƣợc tính theo biểu thức sau:
ii i i
2 2 2 2
i i i i
n x y x y
R
([n x ( x ) ][n y ( y ) ])


 
 
    (2.2)
Trong đó: y là mật độ quang
x là nồng độ chất phân tích
Biểu thức (2.2) chỉ ra đƣợc giá trị R nằm trong khoảng từ -1 đến +1. Nhƣ vậy
nếu phƣơng trình đƣờng chuẩn hay phƣơng trình đƣờng thêm chuẩn có tƣơng quan

38. 35
tuyến tính tốt thì giá trị R sẽ xấp xỉ ±1 và nếu R≈0 thì chúng không có mối tƣơng
quan tuyến tính.
2.2.4.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích tạo ra
đƣợc một tín hiệu đo có thể phân biệt một cách tin cậy với tín hiệu đo của mẫu trắng
(hay tín hiệu nền).
LOD đƣợc xác định theo quy tắc “3σ”: y = yB + 3σB
hay y = yB + 3SB (2.3)
Trong đó, y: tín hiệu ứng với LOD
yB:tín hiệu ứng với mẫu trắng
σB: độ lệch chuẩn của tín hiệu mẫu trắng
Biết tín hiệu y sẽ tính đƣợc LOD từ phƣơng trình đƣờng chuẩn hồi quy tuyến
tính:
y = a + bx → LOD = x =
(y a)
b

(2.4)
Trong phƣơng pháp đƣờng chuẩn, yB và SB đƣợc xác định dựa vào phƣơng
trình hồi quy có dạng y = a +bC (C là nồng độ) đƣợc thiết lập theo phƣơng pháp
bình phƣơng tối thiểu. Từ đó xác định đƣợc yB và SB bằng cách chấp nhận yB là giá
trị của y khi C = 0 => yB = a (đoạn cắt trên trục tung của đƣờng chuẩn hồi quy tuyến
tính) và SB đƣợc chấp nhận bằng Sy (độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đƣờng chuẩn)
n
2
i i
i 1
B y
(y Y )
S S
n 2


 


(2.5)
Trong đó: yi là giá trị thực nghiệm của y;
Yi là các giá trị tính từ phƣơng trình đƣờng chuẩn của y.
Từ (2.3) ta có: y = yB + 3SB = a + 3Sy (2.6)
Thay y ở (2.6) vào (2.4) ta đƣợc công thức tính LOD:

39. 36
y3S
LOD
b

(2.7)
b: độ dốc của đƣờng chuẩn hồi quy tuyến tính.
Giới hạn định lƣợng (LOQ): là tín hiệu hay nồng độ nhỏ nhất của chất phân
tích trên một đƣờng chuẩn tin cậy.
y10S
LOQ 3,3LOD
b
 
(2.8)
Khi xây dựng đƣờng hồi quy tuyến tính để xác định LOD đại diện nên xây
dựng ở gần gốc toạ độ và các Ci không lớn hơn nhau quá 30 lần. Mỗi mẫu đƣợc đo
lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình. Kết quả đƣợc tính toán và xử lý trên Microsoft
Excel.
2.2.4.4. Độ lặp lại
Độ lặp lại đƣợc đánh giá qua giá trị độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn
tƣơng đối (RSD).
n
2
i
i 1
(x x)
S
n 1





S.100
RSD(%)
x

Trong đó, xi: giá trị nồng độ tính đƣợc tại lần đo thứ i (µg/mL);
x : giá trị trung bình của nồng độ sau n lần đo (µg/mL);
n: số lần thí nghiệm.
Khi xác định chất phân tích có một nồng độ xác định, có thể ƣớc lƣợng sai số
giá trị định lƣợng (giá trị đó có đƣợc chấp nhận hay không) bằng cách dựa vào
phƣơng trình Horwitz (RSDHorwitz) theo công thức:
RSDHorwitz = 2(1 – 0.5*lgC)
(2.11)
Trong đó, C: nồng độ (đƣợc biểu diễn dƣới dạng thập phân).
(2.9)
(2.10)

40. 37
RSDHorwitz xác định chất phân tích có nồng độ C đó ở các phòng thí nghiệm
khác nhau (dùng bất kỳ phƣơng pháp phân tích nào). Khi phân tích chất có nồng độ
C trong nội bộ phòng thí nghiệm, nếu đạt đƣợc độ lặp lại với RSD(%) ≤ ½
RSDHorwitz là đạt yêu cầu.
2.2.4.5. Độ đúng
Để đánh giá độ đúng của phƣơng pháp phân tích bất kỳ, ngƣời ta có thể tiến
hành 1 trong 3 hoặc cả 3 cách sau:
- Phân tích mẫu chuẩn CRMs (Certified Refference Materials);
- Thông qua độ thu hồi bằng cách thêm chất phân tích vào mẫu đƣợc tính
theo công thức:
T aC C
Re v(%) .100
a


(2.12)
Trong đó,
a: nồng độ của chất chuẩn thêm vào mẫu (µg/mL);
CT: nồng độ chất xác định đƣợc trong mẫu sau khi thêm chuẩn (µg/mL);
Ca: nồng độ chất xác định đƣợc trong mẫu khi chƣa thêm chuẩn (µg/mL);
- Phân tích bằng phƣơng pháp tiêu chuẩn HPLC để so sánh kết quả đo đƣợc
với kết quả đo của phƣơng pháp nghiên cứu.
2.2.4.6. So sánh với kết quả của phương pháp HPLC
Sau khi thu đƣợc các giá trị trung bình 1x , 2x từ kết quả thí nghiệm của hai
phƣơng pháp và hai phƣơng sai S1
2
và S2
2
tƣơng ứng, ta tiến hành sử dụng chuẩn
Fisher để so sánh hai phƣơng sai và hai giá trị trung bình.
So sánh hai phƣơng phƣơng sai S1
2
và S2
2
sử dụng F – test:
- Tính Ftính =
2
1
2
2
S
S
(Ftính> 1, giả thiết 2
1S > 2
2S ); (2.13)
- Tra bảng, xác định giá trị F(p = 0,05, f1 = n1 – 1, f2= n2 – 1);

41. 38
- So sánh Ftính và F(p; f1; f2):
+ Nếu Ftính< F(p; f1; f2)  Hai phƣơng sai nhƣ nhau (độ lặp lại của hai
phƣơng pháp là nhƣ nhau), với p > 0,05;
+ Nếu Ftính> F(p; f1; f2)  Hai phƣơng sai khác nhau (độ lặp lại của hai
phƣơng pháp là khác nhau), với p < 0,05.
 So sánh hai giá trị trung bình 1x và 2x áp dụng T –test:
- Trƣờng hợp hai phƣơng sai nhƣ nhau S1
2
= S2
2
= S2
 Tính 2
p pS S (Sp
2
là phƣơng sai chung của hai tập số liệu thí nghiệm)
theo công thức:
2 2
2 1 1 2 2
p p
1 2
(n 1)S (n 1)S
S S
(n 1) (n 1)
  
 
  
(2.14)
 Tính
1 2 1 2
tinh
p 1 2
x x n n
t
S n n



(2.15)
 Tra bảng tìm giá trị: t(p=0,05; f = n1 + n2 – 2)
 So sánh ttính và tbảng:
+ Nếu ttính<t(p; f ) => Hai giá trị trung bình là nhƣ nhau, với p>0,05;
+ Nếu ttính> t(p; f ) => Hai giá trị trung bình khác nhau, với p<0,05.
-Trƣờng hợp hai phƣơng sai khác nhau: S1
2
≠ S2
2
:
 Tính
1 2
tinh 2 2
1 2
1 2
x x
t
S S
n n



(2.16)
 Tra bảng tìm giá trị t(p; f) với bậc tự do f đƣợc xác định theo công thức:

42. 39
2
2 2
1 2
1 2
2 2
2 2
1 2
1 2
1 2
2
1 1
S S
n n
f
S S
n n
n n
 
 
       
    
    
    
   
(giá trị f đƣợc làm tròn)
 So sánh ttính và tbảng:
+ Nếu ttính<t(p; f ) => Hai giá trị trung bình là nhƣ nhau, với p>0,05;
+ Nếu ttính> t(p; f ) => Hai giá trị trung bình khác nhau, với p<0,05.
2.3. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.3.1. Thuốc Panadol Extra
Sản xuất tại công ty cổ phần dƣợc phẩm SANOFI – SYNTHELABO VIỆT
NAM, số lô/ngày sản xuất: 15123, HDS: 13/10/2017, hàm lƣợng ghi trên nhãn 500
mg PAR và 65 mg CAF.
2.3.2. Thuốc Colocol Extra
Sản xuất tại công ty CP dƣợc phẩm Sao Kim, số lô/ngày sản xuất: 040715,
HSD: 16/07/2018, hàm lƣợng ghi trên nhãn 500 mg PAR và 65 mg CAF.
2.4. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.4.1. Thiết bị, dụng cụ
- Máy quang phổ UV - VIS hiệu V630 UV/ Vis Spectrometer JCAFo (Nhật);
- Cân phân tích hiệu Precisa XB 2204, độ chính xác 0,0001g;
- Máy cất nƣớc 2 lần bằng thạch anh hiệu Fistreem Cyclon và Aquatron;
- Các dụng cụ khác: pipet, bình định mức, cốc thủy tinh, bình tam giác, đũa
thủy tinh, giấy lọc, phễu, các lọ đựng hóa chất và mẫu.
(2.17)

43. 40
2.4.2. Hóa chất
Tên hóa chất Xuất xứ - Thành phần
Chất chuẩn PAR Trung tâm kiểm nghiệm thuốc TW – 98,86%
Chất chuẩn CAF Trung tâm kiểm nghiệm thuốc TW – 100,26 %
Nƣớc cất 2 lần Phòng thí nghiệm
2.4.3. Dung môi
Từ những nghiên cứu trƣớc đây, chúng tôi lựa chọn nƣớc cất làm dung môi
để hòa tan PAR, CAF và tiến hành các thí nghiệm của chúng [17],[29].
2.4.4. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
* Pha dung dịch chuẩn PAR.
Pha dung dịch gốc PAR nồng độ 500 µg/ml: Cân chính xác 50,5 mg PAR
cho vào bình định mức 100 mL, hoà tan bằng nƣớc cất lắc đều và định mức đến
vạch.
Pha dung dịch PAR trung gian nồng độ 50 µg/ml: Lấy 10 mL dung dịch PAR
gốc trên cho vào bình định mức 100 mL, định mức bằng nƣớc cất đến vạch.
Pha dung dịch PAR làm việc 10 µg/ml: Lấy 5 mL dung dịch PAR trung gian
trên cho vào bình định mức 25 mL, định mức bằng nƣớc cất đến vạch.
* Pha dung dịch chuẩn CAF.
Pha dung dịch gốc CAF nồng độ 500 µg/ml: Cân chính xác 50 mg CAF cho
vào bình định mức 100 mL, hoà tan bằng nƣớc cất lắc đều và định mức đến vạch.
Pha dung dịch CAF trung gian nồng độ 50 µg/ml: Lấy 10 mL dung dịch CAF
gốc trên cho vào bình định mức 100 mL, định mức bằng nƣớc cất đến vạch.
Pha dung dịch CAF làm việc 10 µg/ml: Lấy 5 mL dung dịch CAF trung gian
trên cho vào bình định mức 25 mL, định mức bằng nƣớc cất đến vạch.

44. 41
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KHẢO SÁT LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM CHO PHƢƠNG
PHÁP CHEMOMETRICS
3.1.1. Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của PAR và CAF
Tiến hành: Pha các dung dịch chuẩn PAR 5 µg/mL, CAF 5 µg/mL trong
nƣớc. Quét phổ của các dung dịch PAR 5 µg/ml và CAF 5 µg/ml từ 200 -300 nm.
Phổ hấp thụ phân tử của các dung dịch đƣợc thể hiện ở hình 3.1.
200 220 240 260 280 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
273
(2)
(1) CAF 5 g/mL
(2) PAR 5 g/mL
(1)
A
nm)
243,2
Hình 3.1. Phổ hấp thụ phân tử của dung dịch PAR 5 µg/mL và CAF µg/mL trong
dung môi nước cất
Nhận xét:
Trong dung môi nƣớc cất PAR có độ hấp thụ quang cực đại tại λmax = 243,2
nm, CAF có độ hấp thụ quang cực đại tại λmax = 273 nm.
Phổ hấp thụ phân tử của các dung dịch chuẩn PAR và CAF xen phủ nhau
trong khoảng bƣớc sóng 200-300 nm gây khó khăn cho việc xác định PAR và CAF
trong hổn hợp bằng phƣơng pháp thông thƣờng.

45. 42
3.1.2. Khảo sát tính cộng tính phổ hấp thụ phân tử của PAR và CAF
Tiến hành: Pha các dung dịch chuẩn PAR 5 µg/mL, CAF 5 µg/mL và hỗn
hợp chứa PAR 5 µg/mL và CAF 5 µg/mL. Quét phổ của ba dung dịch này trong
khoảng bƣớc sóng 200 -300 nm. Phổ của các dung dịch đƣợc thể hiện ở hình 3.2.
Trong đó: HH 5 – 5 TN là giá trị thực nghiệm đo đƣợc của dung dịch hỗn
hợp, HH 5 – 5 LT là giá trị lý thuyết tính toán từ việc cộng phổ của PAR 5 µg/mL
với CAF 5 µg/mL.
200 220 240 260 280 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
(1)
(4)
(3)
(2)
(1) CAF 5 g/mL
(2) PAR 5 g/mL
(3) HH 5 - 5 TN
(4) HH 5 - 5 LT
(1)
A
nm)
Hình 3.2. Phổ hấp thụ phân tử của dung dịch chuẩn PAR 5 µg/mL, CAF 5 µg/mL và
hỗn hợp PAR 5 µg/mL và CAF 5 µg/mL
Nhận xét:
Phổ hấp thụ phân tử của hai chất PAR, CAF trong dung môi nƣớc cất có tính
cộng tính và cộng tính tốt trong khoảng bƣớc sóng 215 – 300 nm (theo phụ lục 1),
đây là điều kiện cho phép xác định đồng thời PAR và CAF bằng phƣơng pháp
chemometrics.
Khoảng bƣớc sóng từ 215-300 nm đƣợc lựa chọn để xác định PAR và CAF
bằng phƣơng pháp chemometrics.

46. 43
3.1.3. Khảo sát sự ổn định của phổ hấp thụ phân tử của PAR, CAF và hỗn hợp
hai chất theo thời gian
Tiến hành: Quét phổ của các dung dịch chuẩn PAR 5 µg/ml, CAF 5 µg/ml
và hỗn hợp PAR 5 µg/mL và CAF 5 µg/mL trong 7 giờ với các khoảng thời gian
quét lặp lại là: 15 phút, 30 phút, 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ và 7 giờ. Phổ của các dung dịch
đƣợc thể hiện ở hình 3.3.; 3.4.; 3.5.
200 220 240 260 280 300
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
A
nm)
(1) PAR 15p
(2) PAR 30p
(3) PAR 1h
(4) PAR 3h
(5) PAR 5h
(6) PAR 7h
200 220 240 260 280 300
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
(1) CAF 15p
(2) CAF 30p
(3) CAF 1h
(4) CAF 3h
(5) CAF 5h
(6) CAF 7h
A
nm)
Hình 3.3. Phổ hấp thụ của dung dịch
chuẩn PAR 5 µg/mL trong thời gian 7
giờ
Hình 3.4. Phổ hấp thụ của dung dịch
chuẩn CAF 5 µg/mL trong thời gian 7
giờ
200 220 240 260 280 300
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
(1) HH 15p
(2) HH 30p
(3) HH 1h
(4) HH 3h
(5) HH 5h
(6) HH 7h
A
nm)
Hình 3.5. Phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn hỗn hợp PAR 5 µg/mL và CAF 5 µg/mL
trong thời gian 7 giờ

47. 44
Nhận xét:
Trong khoảng thời gian khảo sát 7 giờ, phổ của các dung dịch chuẩn PAR,
CAF và hỗn hợp của chúng rất ổn định. Đây là khoảng thời gian thuận lợi để tiến
hành các thí nghiệm.
3.2. KHẢO SÁT LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM CHO PHƢƠNG
PHÁP QUANG PHỔ ĐẠO HÀM
3.2.1. Khảo sát phổ đạo hàm của PAR và CAF
Tiến hành: Lấy phổ đạo hàm của các dung dịch chuẩn PAR 5 µg/mL và
CAF 5 µg/mL từ phổ hấp thụ phân tử của chúng. Phổ đạo hàm bậc 1 của dung dịch
PAR 5 µg/mL và CAF 5 µg/mL đƣợc biểu diễn ở hình 3.6.
200 220 240 260 280 300
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
216,4205,4
(2)
(1) PAR 5 g/mL
(2) CAF 5 g/mL
A'
nm)
(1)
Hình 3.6. Phổ đạo hàm bậc 1 của dung dịch chuẩn PAR 5 µg/mL và CAF 5 µg/mL
Nhận xét:
Tại bƣớc sóng 205,4 nm giá trị phổ đạo hàm bậc 1 A’CAF = 0, A’PAR ≠ 0. Có
thể sử dụng bƣớc sóng này để xác định giá trị phổ đạo hàm riêng phần A’PAR.
Tại bƣớc sóng 216,4 nm giá trị phổ đạo hàm bậc 1 A’PAR = 0, A’CAF ≠ 0. Có
thể sử dụng bƣớc sóng này để xác định giá trị phổ đạo hàm riêng phần A’CAF.

48. 45
Tuy nhiên, điều này chỉ có thể khẳng định sau khi tiến hành khảo sát phổ đạo
hàm của PAR và CAF ở các nồng độ khác nhau.
3.2.2. Khảo sát phổ đạo hàm của PAR ở các nồng độ khác nhau
Tiến hành: Pha dãy các dung dịch chất chuẩn PAR có nồng độ là 2,5 µg/mL;
5,0 µg/mL; 7,5 µg/mL; 10 µg/mL; 12,5 µg/mL; 15 µg/mL. Quét phổ đạo hàm của
các dung dịch trong khoảng bƣớc sóng 200 – 300 nm. Phổ đạo hàm của các dung
dịch đƣợc thể hiện ở hình 3.7.
200 220 240 260 280 300
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
(6)
(5)
(4)
(3)
(2)
(1)
216,4
(1) PAR 2,5 g/mL
(2) PAR 5 g/mL
(3) PAR 7,5 g/mL
(4) PAR 10 g/mL
(5) PAR 12,5 g/mL
(6) PAR 15 g/mL
A'
nm)
Hình 3.7. Phổ đạo hàm của dung dịch chuẩn PAR ở các nồng độ khác nhau
Nhận xét:
Tại bƣớc sóng 216,4 nm giá trị phổ đạo hàm của các dung dịch PAR có nồng
độ khác nhau đều bằng 0.
3.2.3. Khảo sát sự ảnh hƣởng của PAR tới CAF trong dung dịch hỗn hợp
Tiến hành: Pha dãy dung dịch hỗn hợp có nồng độ CAF không đổi và nồng
độ PAR tăng dần nhƣ bảng 3.1. Quét phổ đạo hàm của các dung dịch này trong
khoảng bƣớc sóng từ 200 – 300 nm. Phổ đạo hàm đƣợc thể hiện ở hình 3.8.

49. 46
Bảng 3.1. Các dung dịch hỗn hợp với nồng độ PAR khác nhau
Hỗn hợp HH1 HH2 HH3 HH4 HH5 HH6
Tỉ lệ 1:0 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5
CCAF (µg/mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
CPAR (µg/mL) 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5
200 220 240 260 280 300
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
(1) HH1
(2) HH2
(3) HH3
(4) HH4
(5) HH5
(6) HH6
A
nm)
(6)
(5)
(4)
(3)
(2)
(1)
216,4
Hình 3.8. Phổ đạo hàm dung dịch hỗn hợp với nồng độ PAR khác nhau
Nhận xét:
Phổ đạo hàm của các dung dịch hỗn hợp giao nhau tại bƣớc sóng 216,4 nm.
Điều đó cho thấy tại bƣớc sóng 216,4 nm giá trị phổ đạo hàm của PAR luôn bằng 0,
giá trị phổ đạo hàm của hỗn hợp chỉ phụ thuộc vào nồng độ của CAF. Vì vậy có thể
xác định đƣợc CAF trong hỗn hợp tại bƣớc 216,4 nm mà không có sự ảnh hƣởng
của PAR
3.2.4. Khảo sát phổ đạo hàm của CAF ở các nồng độ khác nhau
Tiến hành: Pha dãy các dung dịch chất chuẩn CAF có nồng độ là 2,5 µg/mL;
5,0 µg/mL; 7,5 µg/mL; 10,0 µg/mL; 12,5 µg/mL; 15,0 µg/mL. Quét phổ đạo hàm
của các dung dịch trong khoảng bƣớc sóng 200 – 300 nm. Phổ đạo hàm của các

50. 47
dung dịch đƣợc thể hiện ở hình 3.9.
200 220 240 260 280 300
-0,10
-0,05
0,00
0,05
0,10
(1) CAF 2,5 g/mL
(2) CAF 5 g/mL
(3) CAF 7,5 g/mL
(4) CAF 10 g/mL
(5) CAF 12,5 g/mL
(6) CAF 15 g/mL
A'
nm)
Hình 3.9. Phổ đạo hàm của dung dịch chuẩn CAF ở các nồng độ khác nhau
Nhận xét:
Ở bƣớc sóng 205,4 nm, giá trị phổ đạo hàm của CAF ở nồng độ 5 µg/mL
bằng 0 nhƣng các nồng độ khác lại khác 0 (phụ lục 2). Điều này có thể do tại bƣớc
sóng gần vùng 200 nm, dung môi ảnh hƣởng đến độ hấp thụ của dung dịch nên phổ
hấp thụ cũng nhƣ phổ đạo hàm của dung dịch không ổn định tại vùng bƣớc sóng
này. Do đó không thể sử dụng bƣớc sóng 205,4 nm để xác định PAR nhƣ dự định.
Do phổ đạo hàm có tính chất cộng tính nên ta có thể sử dụng tính chất này để
xác định nồng độ của PAR sau khi đã tính đƣợc nồng độ của CAF tại bƣớc sóng
216,4 nm.
3.2.5. Khảo sát tính cộng tính của phổ đạo hàm
Tiến hành: Pha các dung dịch chuẩn PAR 2,5 µg/mL, CAF 2,5 µg/mL và
dung dịch hỗn hợp chứa PAR 2,5 µg/mL, CAF 2,5 µg/mL. Quét phổ đạo hàm của
các dung dịch trong vùng bƣớc sóng 200-300 nm. Phổ đạo hàm đƣợc thể hiện ở
hình 3.10.

51. 48
Trong đó: HH 2,5–2,5 TN là giá trị đo đƣợc của dung dịch hỗn hợp, HH 2,5
– 2,5 LT là giá trị tính toán từ việc cộng phổ đạo hàm của PAR 2,5 µg/mL với CAF
2,5 µg/mL.
200 220 240 260 280 300
-0,02
-0,01
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
(4)
(3)
(2)
A' (1) CAF 2,5 g/ml
(2) PAR 2,5 g/ml
(3) HH 2,5-2,5 TN
(4) HH 2,5- 2,5 LT
(1)
 (nm)
Hình 3.10. Phổ đạo hàm của dung dịch chuẩn PAR 2,5 µg/mL, CAF 2,5 µg/mL và
hỗn hợp PAR 2,5 µg/mL và CAF 2,5 µg/mL
Nhận xét:
Phổ đạo hàm của PAR và CAF có tính chất cộng tính. Ở bƣớc sóng 260 nm
giá trị phổ đạo hàm của PAR và CAF cách xa nhau, có thể sử dụng bƣớc sóng này
để xác định nồng độ PAR khi đã biết nồng độ CAF.
3.2.6. Khảo sát tính cộng tính của phổ đạo hàm tại bƣớc sóng 260 nm
Tiến hành: Pha dãy dung dịch chuẩn PAR, CAF và dung dịch hỗn hợp của
chúng ở các nồng độ khác nhau nhƣ bảng 3.2. Quét phổ đạo hàm của các dung dịch
này trong khoảng bƣớc sóng 215-300 nm, sau đó so sánh giữa giá trị A’HH đo đƣợc
và A’LT = A’PAR + A’CAF tại bƣớc sóng 260 nm.

52. 49
Bảng 3.2. Giá trị phổ đạo hàm tại bước sóng 260 nm của PAR, CAF và hỗn hợp
Nồng độ (µg/mL)
Giá trị phổ đạo hàm bậc 1 tại bƣớc
sóng 260 nm (A’260 nm ) RE%
PAR CAF Hỗn hợp A’PAR A’CAF A’HH A’LT
2,5 2,5 2,5 – 2,5 0,0064 -0,0049 0,0014 0,0014 -2,79
2,5 5,0 2,5 – 5,0 0,0064 -0,0099 -0,0036 -0,0035 1,01
2,5 7,5 2,5 – 7,5 0,0064 -0,0150 -0,0086 -0,0087 -0,93
2,5 10 2,5 – 10 0,0064 -0,0199 -0,0136 -0,0135 0,15
5,0 2,5 5,0 – 2,5 0,0127 -0,0049 0,0077 0,0078 -0,65
7,5 2,5 7,5 – 2,5 0,0192 -0,0049 0,0141 0,0142 -0,74
10 2,5 10 – 2,5 0,0254 -0,0049 0,0202 0,0204 -1,41
Nhận xét:
Tại bƣớc sóng 260 nm, giá trị phổ đạo hàm của hỗn hợp đo đƣợc và giá trị lý
thuyết xấp xỉ bằng nhau, sai số thấp (RE < 3%). Vì vậy có thể sử dụng bƣớc sóng
này để xác định nồng độ PAR trong hỗn hợp bằng phƣơng pháp đƣờng chuẩn nhƣ
sau:
A’HH (260 nm) = A’PAR(260 nm) + A’CAF(260 nm)
A’PAR(260 nm) = A’HH (260 nm) – A’CAF(260 nm)
A’PAR(260 nm) = A’HH (260 nm) – ε’CAF(260 nm).l.CCAF
Với ε’CAF(260 nm) là một hằng số sẽ đƣợc khảo sát; CCAF đã đƣợc xác định
trƣớc đó ở bƣớc sóng 216,4 nm, sau khi tính đƣợc A’PAR(260 nm) dựa vào phƣơng
trình đƣờng chuẩn của PAR ở 260 nm để xác định nồng độ của PAR.
3.2.7. Khảo sát khoảng tuyến tính của PAR tại bƣớc sóng 260 nm
Tiến hành: Quét phổ đạo hàm của các dung dịch chuẩn PAR có nồng độ từ
0,2 – 35 µg/mL. Giá trị phổ đạo hàm của các dung dịch chuẩn PAR có nồng độ
khác nhau tại bƣớc sóng 260 nm đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.

53. 50
Bảng 3.3. Giá trị phổ đạo hàm của PAR tại bước sóng 260 nm ở các nồng độ khác
nhau
CPAR (µg/mL) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 2,0 4,0
A’(λ = 260 nm) 0,0005 0,0011 0,0017 0,0022 0,0027 0,0054 0,0104
CPAR (µg/mL) 8,0 10 15 20 25 30 35
A’(λ = 260 nm) 0,0207 0,0251 0,0381 0,0511 0,0651 0,0786 0,0960
Kết quả khảo sát cho thấy tại bƣớc sóng 260 nm giá trị phổ đạo hàm của
PAR phụ thuộc tuyến tính tốt với nồng độ trong khoảng 0,2 ÷ 30 µg/mL.
0 5 10 15 20 25 30 35
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
y = 0,0026x - 7E-05
R² = 0,9997
A'
C (g/mL)
Hình 3.11. Phương trình hồi quy tuyến tính của PAR tại bước sóng 260 nm
3.2.8. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của PAR
Tiến hành xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của PAR theo
quy tắc 3ϭ trong khoảng nồng độ nhỏ từ 0,2 ÷ 1 µg/mL

54. 51
Bảng 3.4. LOQ, LOD của PAR tại λ = 260 nm theo phổ đạo hàm
CPAR (µg/mL) 0,2 0,4 0,6 0,8 1
A’(λ = 260 nm) 0,0005 0,0011 0,0017 0,0022 0,0028
Phƣơng trình hồi quy y = 0,0028x – 4.10-5
R2
0,9996
Sy 2,09.10-5
LOD (µg/mL) 0,022
LOQ (µg/mL) 0,073
3.2.9. Khảo sát khoảng tuyến tính của CAF tại bƣớc sóng 216,4 nm
Tiến hành: Quét phổ đạo hàm của các dung dịch chuẩn CAF có nồng độ từ
0,2 ÷ 25 µg/mL. Giá trị phổ đạo hàm của các dung dịch chuẩn PAR có nồng độ
khác nhau tại bƣớc sóng 216,4 nm đƣợc thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Giá trị phổ đạo hàm của CAF tại bước sóng 216,4 nm ở các nồng độ
khác nhau
CCAF (µg/mL) 0,2 0,4 0,6 0,8 1 2 4
A’(λ = 216,4 nm) 0,0013 0,0027 0,0042 0,0055 0,0071 0,0141 0,0278
CCAF (µg/mL) 6 8 10 15 20 25
A’(λ = 216,4 nm) 0,0422 0,0565 0,0698 0,1054 0,1484 0,2191
Kết quả khảo sát cho thấy tại bƣớc sóng 216,4 nm giá trị phổ đạo hàm của
CAF phụ thuộc tuyến tính tốt với nồng độ trong khoảng 0,2 ÷ 15 µg/mL.

55. 52
0 5 10 15
0,00
0,05
0,10
y = 0,0073x - 0,0001
R² = 1
A'
C (g/mL)
Hình 3.12. Phương trình hồi quy tuyến tính của CAF tại bước sóng 216,4 nm
3.2.10. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của CAF
Tiến hành xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của CAF theo
quy tắc 3ϭ trong khoảng nồng độ nhỏ từ 0,2 – 1 µg/mL
Bảng 3.6. LOD, LOQ của CAF tại λ = 216,4 nm theo phổ đạo hàm
CCAF (µg/mL) 0,2 0,4 0,6 0,8 1
A’(λ = 216,4 nm) 0,0013 0,0027 0,0042 0,0055 0,0071
Phƣơng trình hồi quy y = 0,0074x - 0,0002
R2
0,9995
Sy 6,26.10-5
LOD (µg/mL) 0,025
LOQ (µg/mL) 0,083
3.2.11 Khảo sát tìm giá trị hệ số độ hấp thụ phổ đạo hàm của CAF tại bƣớc
sóng 260 nm (ε’260 nm của CAF)
Theo định luật Bughe-Lambe-Bia: A = ɛ.l.C (*)

56. 53
Lấy đạo hàm bậc 1 của (*) theo λ ta đƣợc: A’= ɛ’.l.C
Suy ra:
A'
'
l.C
 
Tiến hành: Pha các dung dịch chuẩn CAF có nồng độ khác nhau. Quét phổ
đạo hàm các dung dịch này trong khoảng bƣớc sóng 215-300 nm. Từ giá trị phổ đạo
hàm tính đƣợc ε’260 nm của CAF ở các nồng độ nhƣ bảng 3.7.
Bảng 3.7. Giá trị ε’260 nm của CAF ở các nồng độ khác nhau
CCAF (µg/mL) A'(λ = 260 nm) ε’260 nm
0,2 -0,0004 -0,0023
0,4 -0,0008 -0,0021
0,6 -0,0012 -0,0020
0,8 -0,0016 -0,0020
1 -0,0019 -0,0019
2 -0,0039 -0,0020
4 -0,0077 -0,0019
6 -0,0117 -0,0020
8 -0,0158 -0,0020
10 -0,0196 -0,0020
15 -0,0296 -0,0020
Kết luận ε’260 nm = 0,002
3.3. ĐÁNH GIÁ ĐỒNG THỜI ĐỘ TIN CẬY CỦA HAI PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
3.3.1. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp trên mẫu chuẩn tự pha
Tiến hành: Pha 3 dung dịch hỗn hợp chứa 5 µg/mL PAR và 5 µg/mL CAF.
Quét phổ hấp thụ các dung dịch .Sử dụng phần mềm Simulan.exe để xác định nồng
độ của PAR và CAF trong mẫu dựa trên phổ toàn phần. Lấy giá trị phổ đạo hàm của
hỗn hợp tại bƣớc sóng 216,4 nm và 260 nm, xác định nồng độ PAR và CAF theo
phƣơng pháp đƣờng chuẩn (phụ lục 3).

57. 54
Bảng 3.8. Kết quả xác định độ đúng và độ lặp lại của phương pháp chemometrics
Lần
PAR CAF
CPAR
(µg/mL)
RE
(%)
CCAF
(µg/mL)
RE
(%)
1 5,01 0,28 5,05 1,1
2 5,02 0,32 5,04 0,92
3 5,01 0,28 5,04 0,96
TB 5,01 5,04
SD 0,005 0,005
RSD 0,12 0,11
RSDHorwitz 12,56 12,56
Bảng 3.9. Kết quả xác định độ đúng và độ lặp lại của phương pháp quang phổ đạo
hàm
Lần
PAR CAF
CPAR
(µg/mL)
RE
(%)
CCAF
(µg/mL)
RE
(%)
1 5,03 0,52 4,97 -0,69
2 5,04 0,88 4,96 -0,90
3 5,03 0,61 4,95 -0,98
TB 5,03 4,96
SD 0,009 0,007
RSD 0,19 0,15
RSDHorwitz 12,56 12,56

58. 55
Nhận xét:
Kết quả bảng 3.8. và bảng 3.9. cho thấy khi xác định PAR và CAF trong hỗn
hợp ở nồng độ 5 µg/mL cả hai phƣơng pháp đều cho sai số nhỏ và độ lặp lại tốt.
3.3.2. Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp trên mẫu chuẩn tự pha ở các tỉ lệ
nồng độ khác nhau
Pha các hỗn hợp dung dịch chuẩn PAR và CAF có nồng độ nhƣ ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Các dung dịch hỗn hợp với tỉ lệ nồng độ khác nhau
Tỉ lệ TL1 TL2 TL3 TL4 TL5 TL6 TL7 TL8 TL9
CPAR (µg/mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9
CCAF (µg/mL) 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Quét phổ hấp thụ các dung dịch trong khoảng bƣớc sóng từ 215 – 300 nm
Sử dụng phần mềm Simulan.exe để xác định nồng độ của PAR và CAF trong
hỗn hợp dựa trên phổ toàn phần. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Kết quả xác định PAR và CAF ở các tỉ lệ khác nhau theo phương pháp
chemometrics
Hỗn
hợp
PAR CAF
CPAR lt
(µg/mL)
CPAR tt
(µg/mL)
RE
(%)
CCAF lt
(µg/mL)
CCAF tt
(µg/mL)
RE
(%)
TL1 1 0,99 -0,18 9 9,04 0,49
TL2 2 1,94 -2,97 8 8,07 0,81
TL3 3 3,02 0,70 7 7,06 0,81
TL4 4 4,05 1,31 6 6,10 1,70
TL5 5 5,01 0,29 5 5,05 0,97
TL6 6 6,02 0,42 4 4,05 1,19
TL7 7 7,01 0,16 3 3,00 0,05
TL8 8 8,18 2,30 2 1,98 -0,95
TL9 9 9,05 0,55 1 0,99 -0,37
Lấy giá trị phổ đạo hàm của các hỗn hợp tại bƣớc sóng 216,4 nm và 260 nm

59. 56
(phụ lục 4), xác định nồng độ PAR và CAF theo phƣơng pháp đƣờng chuẩn. Kết
quả đƣợc trình bày ở bảng 3.12.
Bảng 3.12. Kết quả xác định PAR và CAF ở các tỉ lệ khác nhau theo phương pháp
quang phổ đạo hàm
Hỗn
hợp
PAR CAF
CPAR lt
(µg/mL)
CPAR tt
(µg/mL)
RE
(%)
CCAF lt
(µg/mL)
CCAF tt
(µg/mL)
RE
(%)
TL1 1 0,99 -0,04 9 8,97 -0,37
TL2 2 1,92 -3,92 8 7,98 -0,26
TL3 3 3,00 0,15 7 6,96 -0,62
TL4 4 3,98 -0,36 6 5,98 -0,33
TL5 5 4,97 -0,58 5 4,95 -0,98
TL6 6 5,94 -1,06 4 3,93 -1,65
TL7 7 6,94 -0,86 3 2,92 -2,37
TL8 8 8,17 2,09 2 1,98 -0,87
TL9 9 8,95 -0,53 1 0,98 -2,31
Nhận xét:
Cả hai phƣơng pháp khi xác định PAR và CAF trong hỗn hợp ở các tỉ lệ
nồng độ khác nhau đều cho sai số nhỏ.
3.3.3. Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp trên mẫu chuẩn tự pha ở tỉ lệ nồng
độ PAR:CAF = 100 : 13
Trên thị trƣờng có nhiều loại dƣợc phẩm chứa hai thành phần PAR và CAF
với tỉ lệ hàm lƣợng PAR:CAF phổ biến là 100 : 13 (500 mg PAR, 65 mg CAF).
Trong đề tài, đối tƣợng nghiên cứu đƣợc chọn là Panadol Extra, và Colocol Extra có
thành phần PAR:CAF = 100 : 13 nên cần tiến hành khảo sát khoảng nồng độ tuyến
tính của hỗn hợp PAR và CAF ở tỉ lệ nồng độ này.
Tiến hành: Pha dung dịch hỗn hợp trung gian có nồng độ PAR=100 µg/mL,
CAF = 13 µg/mL từ 20 ml dung dịch gốc PAR 500 µg/mL và 26 ml dung dịch

60. 57
trung gian CAF 50 µg/mL.
Từ dung dịch hỗn hợp trung gian lần lƣợt lấy các thể tích V1 đến V8 định
mức lại trong bình định mức 25 ml thu đƣợc các dung dịch làm việc có tỉ lệ PAR :
CAF = 100 : 13 với nồng độ nhƣ bảng 3.13.
Bảng 3.13. Nồng độ các dung dịch hỗn hợp PAR và CAF ở tỉ lệ 100:13
Ký hiệu
Thể tích dung
dịch trung gian
V (mL)
Nồng độ
CPAR lt
(µg/mL)
CCAF lt
(µg/mL)
HH1 2 8 1,04
HH2 3 12 1,56
HH3 4 16 2,08
HH4 5 20 2,6
HH5 6 24 3,12
HH6 7 28 3,64
HH7 8 32 4,16
HH8 9 36 4,68
Quét phổ hấp thụ các dung dịch trong khoảng bƣớc sóng từ 215 – 300 nm
(phụ lục 5).Sử dụng phần mềm Simulan.exe để xác định nồng độ của PAR và CAF
trong hỗn hợp dựa trên phổ toàn phần. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.14.
Lấy phổ đạo hàm của các dung dịch tại bƣớc sóng 216,4 nm và 260 nm (phụ
lục 6). Sử dụng phƣơng trình đƣờng chuẩn phổ đạo hàm của PAR ở bƣớc sóng 260
nm và CAF ở bƣớc sóng 216,4 nm để xác định nồng độ PAR , CAF trong hỗn hợp.
Kết quả đƣợc trình bảy ở bảng 3.15.

61. 58
Bảng 3.14. Kết quả xác định PAR và CAF ở tỉ lệ 100:13 theo phương pháp
chemometrics
Ký hiệu
PAR CAF
CPAR lt
(µg/mL)
CPAR tt
(µg/mL)
RE
(%)
CCAF lt
(µg/mL)
CCAF tt
(µg/mL)
RE
(%)
HH1 8 7,93 -0,85 1,04 1,03 -1,00
HH2 12 11,97 -0,21 1,56 1,57 0,92
HH3 16 16,06 0,40 2,08 2,12 2,11
HH4 20 20,15 0,77 2,6 2,64 1,61
HH5 24 24,27 1,14 3,12 3,09 -0,88
HH6 28 28,96 3,43 3,64 3,38 -7,03
HH7 32 33,66 5,20 4,16 3,62 -12,92
HH8 36 43,60 21,12 4,68 1,32 -71,75
Bảng 3.15. Kết quả xác định PAR và CAF ở tỉ lệ 100:13 theo phương pháp quang
phổ đạo hàm
Ký hiệu
PAR CAF
CPAR lt
(µg/mL)
CPAR tt
(µg/mL)
RE
(%)
CCAF lt
(µg/mL)
CCAF tt
(µg/mL)
RE
(%)
HH1 8 8,12 1,52 1,04 1,03 -1,30
HH2 12 12,18 1,53 1,56 1,54 -1,29
HH3 16 16,29 1,83 2,08 2,08 -0,21
HH4 20 20,46 2,29 2,6 2,57 -1,05
HH5 24 24,59 2,44 3,12 3,10 -0,74
HH6 28 29,27 4,53 3,64 3,71 1,81
HH7 32 34,21 6,90 4,16 4,20 0,85
HH8 36 39,58 9,93 4,68 5,06 8,18