Nghiên cứu sự methyl hóa và mức độ biểu hiện của gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn ở cây lúa (oryza sativa).doc

Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149
Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Nguyễn Thị Thu Tươi
NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA
GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa)
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội –

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------
NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA
GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa)
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số : 60420121
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS.Đỗ Thị Phúc
Hà Nội –

ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các công trình khác. Nếu
không đúng như đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình
Người cam đoan

iii

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Phúc là người đã
chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Bộ môn Di Truyền học - Khoa Sinh
học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giảng dạy và
trang bị cho tôi những kiến thức quý giá trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện
luận văn của mình.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ, ủng hộ và
động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày 08 tháng 03 năm 2018

iv

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................... 3
1.1. ĐẤT NHIỄM MẶN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NÓ ĐỐI VỚI CÂY LÚA..... 3
1.1.1. Khái quát về đất nhiễm mặn ............................................................................ 3
1.1.2. Tình hình đất nhiễm mặn ở Việt Nam .............................................................. 4
1.1.3. Ảnh hưởng của đất nhiễm mặn đến sinh trưởng và phát triển của cây lúa..... 6
1.2. GIỚI THIỆU VỀ HỌ GEN SALT OVERLY SENSITIVE (SOS) Ở THỰC VẬT
10
1.2.1. Giới thiệu chung về họ gen SOS .................................................................... 10
1.2.2. Vai trò của SOS trong khả năng chống chịu mặn của cây trồng .................. 12
1.2.3. Giới thiệu về gen SOS1 ở cây lúa .................................................................. 14
1.3. HIỆN TƯỢNG METHYL HÓA ADN VÀ VAI TRÒ CỦA METHYL HÓA
ADN TRONG CHỐNG CHỊU STRESS Ở CÂY TRỒNG................................. 15
1.3.1. Khái quát về hiện tượng methyl hóa ADN..................................................... 15
1.3.2. Mối liên quan giữa sự methyl hóa ADN và khả năng chống chịu điều kiện
bất lợi ở thực vật...................................................................................................... 16
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN
GEN SOS1 Ở THỰC VẬT TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM ................ 18
1.4.1. Tình hình nghiên cứu Methyl hóa gen SOS1 ................................................. 18
1.4.2. Tình hình nghiên cứu biểu hiện gen SOS1 ở điều kiện mặn.......................... 18
1.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU METHYL HÓA..................................... 19
1.5.1. MSP (Methyl Specific PCR)........................................................................... 19
1.5.2. Giải trình tự bisulfite ..................................................................................... 21
1.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN Ở MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ
22
1.6.1. Real Time RT-PCR (reverse transcription PCR)........................................... 22
1.6.2. RT – PCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang.............................................. 23
1.6.3. RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR TaqMan) ..... 23
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 25
2.1. VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT .......................................................................... 25
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 25

v

2.1.2. Mồi phản ứng PCR ........................................................................................ 25
2.1.3. Hóa chất......................................................................................................... 26
2.1.4. Thiết bị dùng trong nghiên cứu...................................................................... 27
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................. 27
2.2.1. Trồng cây, xử lý mặn, thu mẫu và phương pháp đánh giá kiểu hình ............ 27
2.2.2.1. Thiết kế mồi cho phản ứng MSP................................................................. 28
2.2.3. Nhóm phương pháp sử dụng trong nghiên cứu sự methyl hóa gen SOS1 ..... 29
2.2.4. Nhóm phương pháp sử dụng trong nghiên cứu mức độ biểu hiện gen SOS1 32
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 35
3.1. ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM KIỂU HÌNH.......................................................... 35
3.1.1. Đánh giá đặc điểm hình thái lá ..................................................................... 35
3.1.2. Đánh giá đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các giống lúa ................................ 36
3.2. ĐÁNH GIÁ SỰ METHYL HÓA CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU
KIỆN MẶN ............................................................................................................. 38
3.2.1. Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng MSP ..................................................... 38
3.2.2. Đánh giá sự methyl hóa của gen SOS1.......................................................... 40
3.2.3. Phân tích vị trí cytosine bị methyl hóa gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn
41
3.3. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU
KIỆN MẶN ............................................................................................................. 44
3.3.1. Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng Real time PCR ..................................... 44
3.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện mặn đến mức độ biểu hiện gen SOS1.... 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 50

vi

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
Cs
DEGs
IRRI
NCBI
MSP
PCR
RT-qPCR
SNP
TBE
TE
ScaBP8
SOS
Acid Deoxyribo Nucleic
Cộng sự
Differentially expressed genes
International Rice Research Institute
National Center for Biotechnology Information
Methyl specific polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi
trùng hợp đặc hiệu methyl)
Polymerase Chain Reaction
real-time reverse transcription polymerase chain reaction
Single nucleotide polymorphism (Đa hình nucleotide đơn)
Tris borate EDTA
Tris – EDTA
Calcium Binding Protein 8
Salt Overly Sensitive

vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tình trạng xâm nhập mặn tại đồng bằng sông Cửu Long............................ 5
Hình 1.2. Ảnh hưởng của mặn đến hình thái cây lúa ................................................... 8
Hình 1.3. Các nhóm gen liên quan đến khả năng chịu mặn ở mức độ rễ, thân và lá... 9
Hình 1.4. Con đường SOS tham gia duy trì cân bằng ion ở rễ cây............................ 11
Hình 1.5. Sơ đồ cấu trúc gen SOS1 ở cây lúa............................................................. 14
Hình 1.6. Sơ đồ đại diện của các con đường methyl hóa cytosine, demethylation, và
mutagenesis của cytosine và 5-mC.............................................................................. 16
Hình 1.7. Methylate-specific PCR............................................................................... 20
Hình 1.8. Xác định methyl hóa bằng cách sử dụng methylSEQr™ của AB Bisulfite
Conversion Kit và thiết bị CE để phân tích DNA........................................................ 22
Hình 1.9. Sơ đồ real-time PCR TaqMan .................................................................... 24
Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR............................................................. 31
Hình 3.1. Biểu đồ điểm xếp hạng trung bình của 4 giống lúa sau 14 ngày xử lý mặn.35
Hình 3.2. Biểu đồ về các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 4 giống lúa trong điều kiện
thường và sau 14 ngày xử lý mặn ở 100 mM NaCl..................................................... 37
Hình 3.3. Cấu trúc gen SOS1 với 2 vùng methyl hóa cao b và c................................ 38
Hình 3.4. Kết quả khảo sát methyl hóa vùng promoter của gen SOS1....................... 39
Hình 3.5. Sơ đồ vị trí bắt cặp mồi methyl trên gen SOS1........................................... 40
Hình 3.6. Đánh giá sự methyl hóa gen SOS1 bằng PCR (MSP) đối với 4 giống lúa tương
ứng được xử lý mặn (100 mM NaCl) và giống đối chứng tại các thời điểm 1, 3, 24 giờ
sau xử lý mặn............................................................................................................... 41
Hình 3.7. Kết quả giải trình tự gen SOS1 giống Nipponbare..................................... 43
Hình 3.8. Kết quả đo đường cong nóng chảy ............................................................. 45
Hình 3.9. Biểu hiện của gen SOS1 ở 4 giống lúa được phân tích bằng phương pháp
realtime PCR định lượng............................................................................................. 46

viii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các loại đất mặn (phân theo nồng độ) và ảnh hưởng đối với cây trồng...... 3
Bảng 1.2. Khả năng chịu mặn một số loại cây trồng.................................................... 4
Bảng 1.3. Quan hệ giữa EC và năng suất lúa............................................................... 7
Bảng 2.1. Danh sách các mồi sử dụng trong nghiên cứu ........................................... 25
Bảng 2.2. Chỉ số scoring để đánh giá đặc điểm hình thái lá của IRRI....................... 28
Bảng 2.3. Các thành phần của phản ứng PCR ........................................................... 30
Bảng 3.1. Các vị trí nucleotit bị methyl hóa ............................................................... 43

ix

MỞ ĐẦU
Biến đổi khí hậu làm gia tăng tần suất lũ lụt, hạn hán, nước biển dâng và thay
đổi quy luật mùa vụ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống nhân sinh và tác động
trực tiếp đến sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là sản xuất lúa nước. Đất nhiễm mặn gây
ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng cây trồng và vấn đề đất nhiễm mặn ngày càng là
thách thức lớn đối với nền sản xuất lúa [26].
Lúa là một trong những cây lương thực quan trọng trên thế giới, là nguồn lương
thực chính nuôi sống hơn 1/3 dân số thế giới. Việt Nam với trên 75% dân số phụ
thuộc chủ yếu vào sản xuất nông nghiệp và 100% người Việt Nam sử dụng lúa gạo
làm lương thực chính. Tuy nhiên, hiện nay tình trạng đất nhiễm mặn ngày một gia
tăng, năng suất lúa trồng trên các vùng đất nhiễm mặn bị giảm, thậm chí nhiều nơi bị
mất trắng. Do đó, đất trồng lúa bị xâm nhiễm mặn đang là trở ngại và khó khăn lớn
đối với nông dân và cũng là vấn đề gây tác động đến an ninh lương thực Quốc gia.
Như vậy, giải pháp chiến lược có tính bền vững để hạn chế ảnh hưởng của nhiễm
mặn đến sản xuất lúa là gieo cấy các giống lúa có khả năng chịu mặn [26].
Methyl hóa ADN có vai trò quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện gen, làm
tắt hoạt động của transposon đáp ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường. Sự hiểu biết
về methyl hóa ADN của các gen giúp hiểu rõ hơn về vai trò của gen trong khả năng
chống chịu của cây trồng. Gen Salt Overly Sensitive 1 (SOS1) được chứng minh là có
vai trò quan trọng trong việc đào thải Na+
khỏi tế bào, do đó góp phần vào khả năng
chống chịu mặn của cây trồng. Tuy nhiên, điều hòa biểu hiện gen SOS1 thông qua cơ
chế methyl hóa ADN trong điều kiện mặn chưa được nghiên cứu ở cây lúa. Chính vì
vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài:
“Nghiên cứu sự methyl hóa và mức độ biểu hiện của gen SOS1 đáp ứng với điều
kiện mặn ở cây lúa (Oryza sativa)”
nhằm đánh giá được sự methyl hóa ADN và mức độ biểu hiện gen SOS1 đáp ứng với
điều kiện mặn ở cây lúa, đồng thời đặt cơ sở khoa học bước đầu về nghiên cứu cơ chế
điều hòa biểu hiện gen SOS1 thông qua cơ chế methyl hóa ADN trong điều kiện mặn.
1

Đề tài nghiên cứu này được thực hiện với các nội dung sau:
➢
Đánh giá đặc điểm kiểu hình lúa dưới điều kiện mặn
➢
Đánh giá sự methyl hóa của gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn
➢
Đánh giá mức độ biểu hiện của gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn
2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẤT NHIỄM MẶN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NÓ ĐỐI VỚI CÂY LÚA
1.1.1. Khái quát về đất nhiễm mặn
Đất nhiễm mặn là đất có chứa một lượng muối hòa tan cao đủ gây ảnh hưởng
đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng [4].
Đất mặn được hình thành do hai nguyên nhân: thứ nhất là sự tích tụ muối tự
nhiên và thứ hai là do xâm thực mặn từ nước biển. Đất mặn do nguyên nhân thứ nhất
thường hình thành trên các vùng khô hạn hoặc bán khô hạn, nơi lượng nước bốc thoát
hơi cao hơn lượng mưa và hiện tượng tích tụ muối tự nhiên thường xuyên xảy ra. Các
muối này chủ yếu là dạng anion Cl-
, SO4
2-
cùng với các cation Na+
, Ca2+
, Mg2+
, K+
.
Chúng có thể hình thành từ quá trình phong hóa đất và khoáng, hay được di chuyển
vào đất do mưa và nước tưới. Với nguyên nhân thứ hai đất mặn được hình thành từ
các vùng biển cũ trong lục địa, do các mạch nước ngầm nhiễm mặn nên muối được
bốc lên theo các mao dẫn lên tầng đất mặt [4].
Dựa theo nồng độ muối hòa tan trong đất, người ta phân loại đất mặn
thành nhiều loại khác nhau:
Bảng 1.1.
Các loại đất mặn (phân theo nồng độ) và ảnh hưởng đối với cây trồng [28]
Phân loại Độ dẫn điện Nồng độ muối
Ảnh hưởng đến cây trồng
đất mặn của đất (dS/m) hòa tan (‰)
Không mặn 0 – 2 0 – 1,28 Mặn ảnh hưởng không đáng kể
Mặn ít 2 – 4 1,28 – 2,56
Năng suất của nhiều loại cây có
thể bị giới hạn
Mặn trung
4 – 8 2,56 – 5,12
Năng suất của nhiều loại cây
bình trồng bị giới hạn
Mặn 8–16 5,12 – 10,24
Chỉ một số cây trồng chịu đựng
được
Rất mặn > 16 > 10,24
Chỉ rất ít cây trồng chịu đựng
được.
3

Mỗi loại cây trồng có khả năng chịu mặn khác nhau, được đánh giá qua chỉ số
ngưỡng chịu mặn. Ngưỡng chịu mặn là giá trị mà tại đó, cây trồng bắt đầu bị thiệt hại
năng suất được thể hiện qua bảng 1.2:
Bảng 1.2. Khả năng chịu mặn một số loại cây trồng [30]
Ngưỡng chịu mặn
STT Cây trồng Tên khoa học
Nồng độ
EC (dS/m) muối tan
(‰)
1 Bắp Zea mays L. 1,7 1,088
2 Đậu phộng Arachis hypogaea L. 3,2 2,048
3 Lúa Oryza sativa L. 3,0 1,92
4 Đậu nành Glycine max (L.) Merrrill 5,0 3,2
5
Củ cải
Vulgaris Beta L. 7,0 4,48
đường
6 Mía Saccharum officinarum L. 1,7 1,088
7 Cải bắp B. oleracea L. (Capitata Group) 1,8 1,152
8 Cà rốt Daucus carota L. 1,0 0,64
9 Đậu đũa Vigna unguiculata (L.) Walp. 4,9 3,136
14 Khoai lang Ipomoea batatas (L.) Lam. 1,5 0,96
15 Cà chua
Lycopersicum Lycopersicon(L.)
2,5 1,6
Karst. ex Farw.
1.1.2. Tình hình đất nhiễm mặn ở Việt Nam
Ở Việt Nam, tình trạng đáng báo động về sự xâm nhập mặn diễn biến ngày càng
tăng. Theo báo cáo của Bộ Khoa học và Công nghệ (2016) [1], cuối năm 2015 và
những tháng đầu năm 2016, diễn biến xâm nhập mặn tại đồng bằng sông Cửu Long
được đánh giá nặng nề nhất trong 100 năm qua. Ngay từ tháng 2, độ mặn đã duy trì ở
mức cao và nghiêm trọng. Trên sông Tiền và sông Hậu, độ mặn là trên 45‰, xâm nhập
4

sâu tới 70 km tính từ cửa sông, thậm chí có nơi lên đến 85 km (trong khi theo Trung
tâm phòng tránh và giảm nhẹ thiên tai thì độ mặn bằng 4‰ đã được coi là bị xâm
nhập mặn) [1].
Tại Hội nghị biến đổi khí hậu tác động đến nông nghiệp, Rạch Giá, Kiên Giang
năm 2013, nhiều tác giả đã nhấn mạnh, nếu mực nước biển dâng 12 cm (năm 2020); 30
cm (năm 2050) thì diện tích đất trồng lúa bị ngập vĩnh viễn tại khu vực đồng bằng sông
Cửu Long sẽ là 1,4% và 6,0% tương ứng 1.317 và 1.345,44 km2
[8]. Đặc biệt, việc nuôi
trồng thủy sản không có quy hoạch cùng việc dự trữ nước của các đập thủy lợi, thủy điện
của các quốc gia vùng thượng nguồn hay hiện tượng nước biển dâng làm cho nhiễm mặn
ngày càng nghiêm trọng chủ yếu ở đồng bằng sông Cửu Long [2].
Hình 1.1. Tình trạng xâm nhập mặn tại đồng bằng sông Cửu Long [3]
Các dòng sông ở Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Vĩnh Long đang bị
xâm nhập mặn sâu vào nội địa trên 70 km và có chiều hướng gia tăng nhanh. Độ mặn
5

đo được ở các điểm quan trắc cũng tăng. Tại Sóc Trăng, độ mặn đo được từ tháng
01/2015 tại trạm Đại Ngãi là 8‰ trong và cuối tháng 3 là 6,5‰ trong khi cùng kỳ
năm 2014 độ mặn chỉ tới 4‰. Tại Hậu Giang, tình hình xâm nhập mặn diễn biến rất
phức tạp và cũng có chiều hướng gia tăng, độ mặn đo được ở thành phố Vị Thanh là
12‰, có thời điểm (cuối tháng 3/2015) mỗi ngày độ mặn tăng 0,5 - 1‰ và di chuyển
sâu vào đất liền 2 - 3 km/ngày [7].
Các vùng lúa nhiễm mặn ở đồng bằng sông Hồng thuộc các tỉnh như Thái Bình,
Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hóa,… Vùng ven biển thuộc Hải Phòng bị
nhiễm mặn khoảng 20.000 ha ở cả 2 dạng nhiễm mặn tiềm tàng và nhiễm mặn xâm
nhiễm từ 0,3 - 0,5%. Tỉnh Thái Bình có khoảng 18.000 ha nhiễm mặn. Tỉnh Nam
Định có khoảng 10.000 ha. Tỉnh Thanh Hóa có khoảng 22.000 ha đất nhiễm mặn.
Quan trọng hơn, dưới tác động của biến đổi khí hậu toàn cầu như hiện nay, dự báo
khi mức nước biển dâng cao, diện tích đất nhiễm mặn ở Việt Nam có thể sẽ tăng lên
nhanh và đây sẽ là khó khăn rất lớn cho sản xuất lúa trong tương lai.
1.1.3. Ảnh hưởng của đất nhiễm mặn đến sinh trưởng và phát triển của cây lúa
1.1.3.1. Ảnh hưởng của mặn đến các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây lúa
Ảnh hưởng của mặn đến sinh trưởng, phát triển của cây lúa được đánh giá bằng
mức độ thiệt hại ở từng giai đoạn sinh trưởng, phát triển khác nhau. Ở mức nhiễm
mặn trung bình và thấp có thể ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và phát triển của cây,
gây nên những thay đổi về hình thái, sinh lý, sinh hóa và làm giảm năng suất, trong
khi mức độ nhiễm mặn cao sẽ làm cây chết [30]. Mối quan hệ giữa EC (Electro
Conductivity - chỉ số diễn tả tổng nồng độ ion hòa tan trong dung dịch) và năng suất
lúa được trình bày ở bảng 1.3.
6

Bảng 1.3. Quan hệ giữa EC và năng suất lúa
Theo Akita [8], mặn làm giảm diện tích lá ở cây lúa. Trong điều kiện thiệt hại
nhẹ, khối lượng khô có xu hướng tăng lên trong một thời gian, sau đó giảm nghiêm
trọng vì diện tích lá giảm. Nếu ảnh hưởng mặn lớn hơn, khối lượng khô của chồi và
rễ sẽ giảm tương ứng. Ở giai đoạn mạ, lá già hơn sẽ bị ảnh hưởng nhiều hơn lá non.
Ảnh hưởng của độ mặn thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng, phát triển của lúa.
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng cây lúa chịu được mặn trong quá trình nảy mầm,
nhưng trở nên rất nhạy cảm trong thời kỳ mạ non. Mặc dù chịu được mặn trong suốt
thời gian sinh trưởngvà phát triển, cây lúa lại rất nhạy cảm với độ mặn trong thời gian
thụ phấn và thụ tinh [33].
1.1.3.2. Ảnh hưởng của mặn đến đặc điểm hình thái của cây lúa
Năm 1980, Ponnamperuma và Bandyopadhya [7], đã chỉ ra những biểu hiện đặc
trưng nhất về mặt hình thái do tác động của mặn là cây lúa sinh trưởng, phát triển
kém, lá cuốn lại, khô đầu lá, phiến lá xuất hiện nhiều chấm lốm đốm màu trắng và lá
bên dưới bị khô cháy. Theo Singh (2006) [48], hầu hết các thông số như số nhánh ít,
bông lép, số hoa trên bông ít, khối lượng 1000 hạt thấp và cháy lá đều là biểu hiện
của sự ảnh hưởng mặn.
7

Hình 1.2. Ảnh hưởng của mặn đến hình thái cây lúa [49]
Các triệu chứng chính về mặt hình thái theo Singh (2006) [48] là lá chuyển màu
nâu và chết (trong trường hợp mặn kiềm), cây thấp, đẻ nhánh kém, tăng số bông bất
thụ, chỉ số thu hoạch thấp, giảm số hạt trên bông, giảm khối lượng 1000 hạt, năng
suất thấp và thay đổi thời gian sinh trưởng, lá cuốn lại, lá khô trắng, rễ sinh trưởng
kém và ruộng lúa sinh trưởng, phát triển không đồng đều.
1.1.3.3. Ảnh hưởng của mặn đến đặc tính sinh lý, sinh hóa và điều hòa biểu hiện gen
của cây lúa
Theo Singh (2006) [48], dưới điều kiện mặn cao, hầu hết các cây trồng có những
thay đổi về mặt sinh lý và sinh hoá như tăng vận chuyển Na+
tới chồi, tích lũy Natri
nhiều hơn trong các lá già, tăng hấp thu ion Cl-
, giảm hấp thu ion K+
, giảm khối lượng
tươi và khô của chồi và rễ, giảm hấp thu photpho và kẽm, thay đổi enzyme, tăng cường
sự hoà tan các hợp chất hữu cơ không độc hại và tăng mức polyamine. Theo Amirjani và
Monhammad (2010) [9], mặn ảnh hưởng đến cả sự phát triển lá và tình trạng nước của
cây lúa. Tác dụng thẩm thấu do độ mặn của đất có thể gây ra rối loạn cân bằng nước
trong quá trình sinh trưởng, đồng thời hạn chế sự sinh trưởng, kích thích sự đóng khí
khổng và làm giảm quá trình quang hợp. Cây phản ứng bằng cách điều chỉnh thẩm thấu,
thường bằng cách tăng nồng độ Na+
và Cl-
trong các mô của chúng, mặc dù sự tích lũy
các ion vô cơ như vậy có thể gây độc, làm tổn thương tế bào cũng như làm ảnh hưởng cả
quá trình quang hợp và hô hấp. Sự điều chỉnh phần
8

nào áp suất thẩm thấu này không đủ để tránh tình trạng thiếu nước trong cây, do đó
làm sụt giảm hàm lượng nước trong rễ.
Khả năng chịu mặn của lúa chủ yếu theo hai cơ chế: loại trừ ion và khả năng
thẩm thấu [36]. Loại trừ ion chủ yếu liên quan đến quá trình vận chuyển Na+
và Cl-
trong rễ và ngăn ngừa sự tích tụ dư thừa của Na+
và Cl-
trong lá. Loại trừ ion bao
gồm việc tìm kiếm Na+
từ xylem, và thải loại Na+
ra khỏi tế bào. Khả năng chịu mặn
của lúa được điều chỉnh bởi các tín hiệu đường dài làm giảm sự phát triển của chồi và
được kích hoạt trước khi tích lũy Na+
. Khả năng chịu mặn của mô liên quan đến việc
cô lập Na+
trong không bào, tổng hợp các chất tan tương thích và sản xuất các
enzyme xúc tác phân giải hoạt tính độc của oxi. Hình 1.3 cho thấy phác hoạ các cơ
chế và gen có liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa.
Hình 1.3. Các nhóm gen liên quan đến khả năng chịu mặn ở mức độ rễ, thân và lá
9

Một số loại gen quan trọng trong cơ chế chịu mặn của lúa là OsSOS1, OsNHX1
(Na+
/ H+
antiporters), OsHKT2, 1 (Na+
/ K+
symporter), OsCAX1, OsAKT1 (K+
kênh chẩn đoán chính xác), OsKCO1 (Kênh chỉnh K+
ra bên ngoài), OsTPC1 (kênh
thẩm thấu Ca2+
), OsCLC1 (kênh Cl) và OsNRT1; 2 (vận chuyển nitrat) [27].
1.2. GIỚI THIỆU VỀ HỌ GEN SALT OVERLY SENSITIVE (SOS) Ở THỰC
VẬT
1.2.1. Giới thiệu chung về họ gen SOS
Mặn ảnh hưởng đến sự biểu hiện của nhiều gen, trong đó có một số gen quan
trọng như : NHXs, SOS, HKTs. Trong đó, hai yếu tố chính giúp duy trì lượng Na+
thấp trong tế bào chất của thực vật là các kênh trao đổi (exchanger) Na+
/H+
hiện diện
trên màng không bào (tonoplast) NHX1 và kênh đối chuyển (antiporter) Na+
/H+
-
SOS1 trên màng sinh chất (plasma membrane). Hầu hết các kênh NHXs cần thiết cho
quá trình khử độc Na+
thông qua sự cô lập Na+
trong không bào thực vật, trong khi
con đường tín hiệu Salt Overly Sensitive (SOS) được ghi nhận là xuất Na+
ra khỏi tế
bào [25].
Ở cấp độ phân tử, con đường Salt Overly Sensitive (SOS) bao gồm các protein
SOS3, SOS2 và SOS1 đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng nồng độ
của các ion trong tế bào. Trong đó, SOS1 là protein vận chuyển ion Na+
/ H+
nằm trên
màng tế bào và được điều chỉnh bởi phức hợp protein kinase SOS2-SOS3 [37]. Gen
mã hóa cho SOS1 chủ yếu biểu hiện ở lớp tế bào biểu bì rễ và trong xylem ở ranh
giới xylem-symplast trong cơ thể thực vật, trong khi SOS3 mã hóa cho một protein
gắn Canxi có chức năng cảm biến sự gia tăng nồng độ Canxi gây ra do dư thừa Na+
trong tế bào chất. SOS2 mã hóa cho protein kinase serine/ threonine với 446 amino
axit và khối lượng phân tử ước tính là 51 kD [29]. SOS2 có một đầu N-terminal
khoảng 270 axit amin và đuôi C-terminal quy định các chức năng kinase. Khi gắn kết
với Ca2+
, SOS3 có thể tương tác và kích hoạt protein kinase serine/ threonine SOS2.
Các tương tác SOS3-SOS2 hoặc SCaBP8-SOS2 kích hoạt hoạt động của protein
SOS1 giúp ngăn cản sự tăng quá mức nồng độ Na+
/H+
trong tế bào [25].
10

Hình 1.4. Con đường SOS tham gia duy trì cân bằng ion ở rễ cây [25]
Chú thích: Các mũi tên nét liền biểu thị các tương tác đã được thiết lập, các đường
nét đứt chỉ ra mối liên kết được đề xuất giữa các thành phần được trình bày.)
Gần đây, một số lượng lớn các bằng chứng nghiên cứu cho thấy sự đa dạng chức
năng của các protein trong con đường SOS cũng rất quan trọng đối với khả năng chịu
mặn. Một số báo cáo đã chỉ ra rằng, trong rễ, các protein SOS có những chức năng mới
ngoài cân bằng nồng độ ion natri đó là duy trì khung xương tế bào dưới điều kiện bất lợi
và phát triển rễ bên thông qua điều chỉnh gradient auxin dưới điều kiện mặn. Nghiên cứu
các đột biến đơn hình của các gen trong con đường SOS biểu hiện các kiểu hình khiếm
khuyết đối với rễ, củ, gốc, cho thấy hoạt động của các gen SOS là rất cần thiết cho việc
thiết lập sự phát triển của tế bào thượng bì phần gốc nhằm đáp ứng với điều kiện mặn và
duy trì sự cân bằng nồng độ ion trong các tế bào [25]. Trong năm 2007, Verslues và các
đồng nghiệp đã chứng minh rằng SOS2 tương tác với Nucleoside Diphosphate Kinase 2,
Catalase 2 và 3, cho thấy SOS2 là một phần của nút tín hiệu kết
11

nối phản ứng đáp ứng với điều kiện mặn và tín hiệu ROS [53]. Ngoài ra, các bằng
chứng khác cũng cho thấy SOS2 tương tác và điều chỉnh hoạt động của các protein
nằm trên màng không bào như CAX1 và Vaccin ATPaa Vacuolar (V-ATPase) điều
này chứng tỏ rằng SOS2 đóng vai trò trung tâm của các quá trình vận chuyển [53].
SOS2 cũng được chứng minh tương tác với ABI2, cho thấy một sự liên hệ giữa con
đường ABA và con đường SOS [42]. Những kết quả này cho thấy một mạng lưới
phức tạp liên quan đến phản ứng của thực vật trong điều kiện mặn có liên quan đến
con đường SOS.
1.2.2. Vai trò của SOS trong khả năng chống chịu mặn của cây trồng
Ở thực vật, sự cân bằng nồng độ ion chủ yếu có liên quan đến con đường tín
hiệu SOS, trong đó SOS1 đóng vai trò quan trọng trọng việc thải loại trực tiếp Na+
ra
môi trường đất giúp kiểm soát quá trình vận chuyển Na+
trong tế bào. Bên cạnh đó,
các báo cáo trước đây cũng cho thấy SOS1 đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm
soát sự cô lập Na+
trong không bào và điều chỉnh lượng Na+
vào xylem [37]. Điều
này cho thấy SOS1 có liên quan đến nhiều quá trình trung gian trong đáp ứng với
điều kiện mặn ở thực vật.
Ở Arabidopsis, SOS1 mã hóa cho một protein vận chuyển Na+
/ H+
với một khối
lượng phân tử được dự đoán là 127 kD [25]. Vùng N-terminal của SOS1 là kỵ nước
và có thể chứa từ 10 đến 12 domain xuyên màng, tùy thuộc vào chương trình dự đoán
được sử dụng để phân tích. SOS1 đại diện cho một lớp các protein mới vận chuyển
Na+
/ H+
có thể hoạt động trên màng tế bào [25]. Đặc biệt, đuôi dài kỵ nước của
SOS1 được dự đoán là nằm trong bào tương. Chiều dài đuôi của SOS1 sẽ tạo ra nhiều
cơ hội để tương tác với vô số các protein dự kiến sẽ điều chỉnh hoạt động của nó.
Mức độ biểu hiện của gen SOS1 được điều chỉnh bởi điều kiện bất lợi mặn [25].
Không giống nhiều loại gen đáp ứng điều kiện mặn khác, quy định này rất cụ thể đối
với NaCl và không xảy ra trong con đường ABA hoặc đáp ứng với điều kiện lạnh
[25]. Như vậy, mô hình này cho thấy rằng SOS1 có chức năng trong việc thu nhận
Na+
từ xylem hoặc thải loại Na+
qua xylem.
Vai trò của SOS1 trong việc kiểm soát sự cân bằng ion đã được thể hiện thông qua
sự kết hợp các phân tích sinh lý, sinh hóa và di truyền học. Sử dụng các chủng nấm
12

men đột biến để nghiên cứu, SOS1 lần đầu tiên được chứng minh có thể vận chuyển
Na+
ra khỏi tế bào dưới điều kiện mặn [21]. Phân tích sinh lý của cây đột biến SOS1
cùng với các nghiên cứu biểu hiện gen ở Arabidopsis cho thấy SOS1 có liên quan đến
quá trình thải loại ion từ tế bào chất ra môi trường xung quanh, trong các tế bào biểu
bì và các mô mạch, do đó duy trì nồng độ Na+
trong các tế bào rễ [45]. Một vài
nghiên cứu khác đã cho thấy sự biểu hiện của tất cả ba gen SOS được tạo ra bởi stress
mặn trong rễ, và đặc biệt, mức độ biểu hiện SOS1 cao đã được phát hiện trong các tế
bào biểu bì phần gốc của A. thaliana [45]. Có thể hiểu rằng trong trường hợp nồng độ
NaCl thấp, Na+
trung gian do SOS1 gây ra cho môi trường tăng trưởng bởi các tế bào
biểu bì có thể là đủ để duy trì trạng thái cân bằng ion và các chức năng tế bào thích
hợp. Quá trình loại trừ ion đặc biệt này trong các tế bào biểu bì gốc có thể được điều
chỉnh bởi cả con đường tín hiệu phụ thuộc vào con đường SOS. Một nghiên cứu gần
đây đã chỉ ra rằng, phần lớn các quá trình sinh lý và sinh hóa của các loại tế bào đặc
biệt rất nhạy cảm với stress mặn trong rễ [19]. Phân tích Microarray cho thấy rằng
biểu hiện gen SOS3 thể hiện cảm ứng khác biệt trong các loại tế bào nằm ở các vùng
rễ phát triển khác nhau để đáp ứng với stress mặn.
Các nghiên cứu ở một số loài đã chỉ ra rằng SOS1 được bảo tồn ở các thực vật
bậc cao bao gồm cả lá đơn và lá kép [45]. Đặc biệt là, hoạt động của SOS1 đã được
chứng minh là cần thiết cho các đặc tính chịu mặn của Thellungiella salsuginea (còn
gọi là T. halophila), một loài thực vật chịu mặn tự nhiên liên quan chặt chẽ đến
Arabidopsis [25]. Việc giảm 50% hoặc tăng cao hơn mức biểu hiện SOS1 bằng cách
sử dụng RNAi dẫn đến sự tích tụ ion cao gây độc cho T. salsuginea [25]. Do đó, tín
hiệu SOS3 / SCaBP8-SOS2-SOS1 là một cơ chế điều tiết tối ưu trong việc loại trừ
ion Na+
và cân bằng nồng độ ion trong tế bào.
Các nghiên cứu trong A.thaliana, những cây đột biến thiếu gen SOS1 cho thấy cực
kỳ nhạy cảm với điều kiện mặn và có khiếm khuyết khác nhau trong việc thải loại Na+
và vận chuyển ion [25]. Khi biểu hiện trên màng tế bào S.cerevisia, SOS1 hoạt động như
một chất vận chuyển Na+
/ H+
làm giảm nồng độ Na+
trong tế bào chất [25].
Ở Arabidopsis, việc đưa các gen SOS1 vào các cây bị đột biến sos1 đã giúp khôi phục
khả năng chịu mặn của dòng đột biến này. Sau 3 giờ xử lý mặn, mức độ biểu hiện của
13

gen SOS1 trong rễ cây Arabidopsis đã tăng lên khoảng 2 lần và đạt đến cực đại 6 lần
sau 15 giờ trong khi nó giảm trong mô lá [9]. Ở vùng tiếp xúc gốc-đất, SOS1 sẽ thải
loại một lượng các ion Na+
dư thừa từ các tế bào biểu bì gốc ra ngoài môi trường đất.
Ngoài ra, phân tích khả năng vận chuyển Na+
trong cây bị đột biến sos1 theo các
mức độ mặn khác nhau đã chỉ ra rằng SOS1 cũng tham gia phân phối lại Na+
giữa các
mô, tế bào và các cơ quan trong cơ thể thực vật [42]. Ở độ mặn trung bình (25 mM
NaCl), các cây đột biến gen sos1 tích tụ ít Na+
trong các cơ quan hơn các cây bình
thường, không đột biến gen. Điều này cho thấy SOS1 có chức năng vận chuyển Na+
vào xylem để phân phối đến chồi, lá. Ngược lại, ở độ mặn cao (100 mM NaCl), rễ và
các cơ quan khác của cây đột biến sos1 tích tụ nhiều Na+
hơn các cây bình thường,
có thể là do sự loại bỏ Na+
ở lớp tế bào biểu bì gốc và gradient điện hóa lớn của Na+
ở cây bình thường tốt hơn cây đột biến [42].
Vậy từ những nghiên cứu ở trên có thể kết luận được SOS1 đóng vai trò vô cùng
quan trọng trong khả năng đáp ứng với điều kiện mặn ở cây trồng. SOS1 vừa có vai
trò thải loại các ion Na+
dư thừa ra ngoài môi trường, vừa tham gia phân phối lại ion
Na+
giữa các cơ quan trong cơ thể, giúp cây sinh trưởng và phát triển tốt hơn trong
điều kiện mặn.
1.2.3. Giới thiệu về gen SOS1 ở cây lúa
Lúa (Oryza sativa) là một trong những cây lương thực quan trọng ở các vùng
nhiệt đới và ôn đới trên thế giới. Trong số những bất lợi về môi trường, độ mặn là
yếu tố chính làm giảm chất lượng và năng suất của cây. Ở lúa, gen SOS1
(LOC_Os12g44360) mã hóa cho một protein vận chuyển Na+
/H+
nằm trên màng tế
bào có độ dài 14451 bp, gồm 23 exon và 22 intron với độ dài trình tự cds là 3447 bp
tương ứng 1148 acid amin (Hình 1.5)
Hình 1.5. Sơ đồ cấu trúc gen SOS1 ở cây lúa
14

Tương tự như ở Arabidopsis, gen SOS1 ở lúa có vai trò quan trọng trọng việc
thải loại trực tiếp NaCl ra môi trường giúp kiểm soát quá trình vận chuyển Na+
trong
tế bào. Đồng thời, SOS1 cũng đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự phân
phối Na+
trong không bào và xylem [41].
1.3. HIỆN TƯỢNG METHYL HÓA ADN VÀ VAI TRÒ CỦA METHYL HÓA
ADN TRONG CHỐNG CHỊU STRESS Ở CÂY TRỒNG
1.3.1. Khái quát về hiện tượng methyl hóa ADN
Methyl hóa ADN là một trong những cơ chế sửa đổi gen có vai trò quan trọng
trong việc điều hòa hoạt động của gen. Không giống như trong tế bào động vật, sự
methyl hóa ADN trong tế bào thực vật không chỉ xảy ra ở vùng trình tự CG đối xứng
mà còn ở các vùng trình tự CHH và CHG (với H = A, T hoặc C) có tỷ lệ phần trăm
thấp hơn, tương ứng là 1,7% và 6,7%. Methyl hóa ADN với tỷ lệ phần trăm cao chủ
yếu được tìm thấy trong heterochromatin nơi chứa các transposons và các trình tự lặp
đi lặp lại [10]. Methyl hóa ở thực vật thường xảy ra trong hệ gen và chỉ có 5% gen
được methyl hóa trong promoter của chúng, cơ chế này thường liên quan đến sự ức
chế biểu hiện gen.
15

Hình 1.6. Sơ đồ đại diện của các con đường methyl hóa cytosine, demethylation,
và mutagenesis của cytosine và 5-mC. [40]
Methyl hóa ADN rất quan trọng đối với sự tăng trưởng và phát triển của cây
trồng để đáp ứng các điều kiện bất lợi từ môi trường [40]. Là một trong những sửa
đổi cấu trúc ADN đầu tiên được phát hiện, methyl hóa ADN đã được quan sát thấy ở
nhiều sinh vật. Việc methyl hoá ADN nhân tạo thường xảy ra ở vị trí 5 của cytosine,
tạo ra 5-methylcytosine. Trong các điều kiện tăng trưởng bình thường, tỷ lệ cytosines
được methyl hóa trong thực vật là 20-30% [40]. Có rất nhiều bằng chứng chỉ ra rằng
những thay đổi của gen khi bị methyl hóa ảnh hưởng đáng kể đến khả năng đáp ứng
của thực vật đối với các điều kiện bất lợi từ môi trường [40].
1.3.2. Mối liên quan giữa sự methyl hóa ADN và khả năng chống chịu điều kiện
bất lợi ở thực vật.
Methyl hóa ADN để đáp ứng với các điều kiện bất lợi từ môi trường được chứng
minh là đặc tính của cơ quan và gen [62]. Trong nghiên cứu của Zhikang Li và cộng
16

sự [60], phương pháp methyl hóa kết hợp với sự biểu hiện gen ở các giống khác nhau
nhằm đánh giá ảnh hưởng của sự methyl hóa ADN đối với sự biểu hiện của các gen
trong cùng một loài. Kết quả cho thấy tổng cộng khoảng 39% (2010) và 30% (966) các
gen trong giống lúa N22 / IR64 và PK / IR64, đã được tìm thấy có liên quan đến các
vùng methyl hóa khác nhau. Điều này cho thấy rằng biểu hiện của các gen liên quan đến
các vùng methyl hóa khác nhau phụ thuộc vào hướng thay đổi trạng thái methyl hóa.
Nhìn chung, các gen gần với các vùng methyl hóa thể hiện mức độ sao chép thấp hơn
(giảm xuống) so với toàn bộ hệ gen. Sự methyl hóa ADN dường như tương quan với tình
trạng bật / tắt biểu hiện gen đối với các vùng methyl hóa (14,5% đối với N22
/ IR64 và 7,2% đối với PK / IR64) [62]. Đối với các trường hợp khác, trạng thái
methyl hóa ADN tương quan với sự khác biệt về số lượng trong biểu hiện gen.
Hơn nữa, phân tích mức độ biểu hiện gen DEGs của các vùng methyl hóa khác
nhau cho thấy mối tương quan giữa tình trạng methyl hóa và mức độ biểu hiện gen.
Các kết quả trong nghiên cứu này đã chỉ ra rằng sự methyl hoá gen đóng một vai trò
quan trọng trong việc điều hòa sự biểu hiện gen của các giống lúa [62].
Methyl hóa của các gen liên quan đến đáp ứng điều kiện bất lợi và điều chỉnh
mức độ biểu hiện gen. Sự biểu hiện của các gen liên quan đến sự khác nhau giữa các
giống lúa. Việc tăng cường kích hoạt hoặc kìm hãm nhiều gen phụ thuộc vào cấu trúc
chromatin và sự methyl hóa ADN [62].
Một vài ví dụ điển hình về sự methyl hóa của các gen liên quan đến các phản
ứng stress phi sinh học và sự điều hòa biểu hiện gen đã được thể hiện trong nghiên
cứu của Zhikang Li và cộng sự [60], Sự biểu hiện quá mức các gen mã hóa protein
này đã được chứng minh có liên quan đến tình trạng methyl hóa ADN . Ví dụ, các
nhân tố sao chép, chẳng hạn như A20 / AN1 (Os05g23470), homeobox (Os02g43330
và Os03g43930) và AGL19 (Os10g39130) biểu hiện methyl hóa không đồng đều
trong N22 / IR64 và / hoặc PK / IR64. Tình trạng methyl hóa của các nhân tố phiên
mã này có thể điều chỉnh sự biểu hiện của hàng loạt các gen đích khác.
17

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN
GEN SOS1 Ở THỰC VẬT TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM
1.4.1. Tình hình nghiên cứu Methyl hóa gen SOS1
Methyl hóa ADN có vai trò quan trọng trong sự biểu hiện gen và sự phát triển
của cây trồng trong điều kiện môi trường bất lợi [11]. Nếu trước đó, sự methyl hóa
ADN trong vùng promoter đã được chứng minh có ảnh hưởng đến biểu hiện gen, thì
phân tích methyl hóa trong vùng mã hóa của gen cho thấy có ảnh hưởng tích cực đến
sự biểu hiện gen [44]. Ở lúa, bản đồ toàn bộ gen methyl hóa cytosine cho thấy có
13,1% gen được methyl hóa trong vùng promoter và 5,4% gel được methyl trong
vùng mã hóa của gen [57]. Trong một điều kiện nhất định, methyl hóa ADN kiểm
soát sự biểu hiện của gen để đáp ứng lại stress. Ở cây ngô, sự biểu hiện ZmMI1 tương
quan với sự giảm methyl hóa ADN của lõi nucleosome dưới điều kiện lạnh [46].
Trong đột biến Arabidopsis Met1-3, sự giảm methyl hóa cytosine gây ra biểu hiện
gen AtHKT1 thấp, khiến đột biến này trở nên quá nhạy cảm với mặn [10].
Ở Việt Nam, trong nghiên cứu của Hoa và cs (2016) [40] đã phân tích tình trạng
methyl hóa của gen SOS1 trong 2 giống lúa Nipponbare (nhạy cảm) và giống Pokkali
(chịu mặn) dưới điều kiện mặn trong cả mô chồi và rễ. Nghiên cứu đã giúp xác định
được chính xác các vị trí methyl hóa ở cặp base đơn trong giải trình tự bisulfite và
đưa đến kết luận sự methyl hóa chỉ xảy ra ở các vị trí CpG mà không mở rộng ở các
vị trí CHG và CHH [36].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu biểu hiện gen SOS1 ở điều kiện mặn
Trong nghiên cứu của Praveen Soni và cs (2013) [49], gen SOS1 đã được xác định
là không chịu ảnh hưởng ở mức độ phiên mã của yếu tố nhịp điệu ngày đêm. Theo đó,
trong nghiên cứu của mình, Praveen Soni và cs đã đánh giá hoạt động tuần hoàn của các
gen SOS ở lúa trong giai đoạn cây con nhằm đáp ứng với những thay đổi của nhịp điệu
ngày đêm. Để loại trừ sự thay đổi nhiệt độ của các mô hình biểu hiện của các gen này,
cây con được nuôi trong điều kiện nhiệt độ không đổi. Kết quả cho thấy gen SOS3 và
SOS2 biểu hiện cùng một nhịp điệu, trong khi SOS1 không đánh giá được trong bất kỳ
mô hình biểu hiện cụ thể nào. Phân tích này thiết lập một liên kết chéo
18

giữa nhịp điệu ngày đêm và con đường SOS cho thấy con đường SOS bị ảnh hưởng
bởi nhịp điệu ngày đêm ở lúa.
Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện mặn đến sự cân bằng ion và chuyển hóa
nitơ của lá già và lá non trong lúa đã chứng minh khi các gen HKT1; 5 và SOS1 biểu
hiện thấp ở lá già có thể làm giảm tần suất thu nhận Na+
từ các tế bào lá già [49].
Ngoài ra, còn một số nghiên cứu khác đã chứng minh được vai trò quan trọng của
gen SOS1 trong việc kiểm soát và duy trì ổn định nồng độ Na+
trong tế bào thực vật.
Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào về biểu hiện gen SOS1 ở thực vật, cũng chưa có
nghiên cứu nào kết hợp cả hai phương pháp methyl hóa và biểu hiện gen SOS1 trong
điều kiện mặn.
1.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU METHYL HÓA
1.5.1. MSP (Methyl Specific PCR)
Kỹ thuật MSP (Methyl Specific PCR) được phát triển bởi Stephen Baylin và
Jim Herman tại trường Y Johns Hopkins và được sử dụng để phát hiện methyl hóa
các đảo CpG trong ADN của bộ gen [23]
Nguyên lý: Đầu tiên, ADN được biến đổi với sodium bisulfite để chuyển hóa tất
cả các cytosine không bị methyl hóa thành uracil, sau đó, ADN này được khuếch đại
lên qua phản ứng PCR bằng cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho đoạn trình tự bị methyl hóa
và không bị methyl hóa. Kỹ thuật MSP đòi hỏi lượng ADN rất ít, phát hiện nhạy tới
0,1% các alen bị methyl hóa trên locus đảo CpG quan tâm và cũng có thể thực hiện
được với ADN tách chiết từ các mẫu đúc paraffin. Sơ đồ mô tả kỹ thuật MSP:
19

Hình 1.7. Methylate-specific PCR [23]
Chú thích: Methylate-specific PCR bao gồm việc sử dụng hai cặp mồi: cặp 1
được thiết kế để khuếch đại trình tự gen đã xử lý bisulfite (các chấm đen) và cặp 2 là
cặp mồi khuếch đại trình tự gen chưa xử lý bisulfite (các chấm trắng). Các cặp mồi
được thiết kế sao cho có sự khác biệt về kích thước. Sau khi nhân bản ADN bằng
phản ứng PCR sử dụng hai cặp mồi trên, sản phẩm được đem đi điện di trên gel
agarose. Kết quả giả thuyết được trình bày như sau: Mẫu 1 cho thấy sản phẩm của
cả mồi methyl hoá (M) và không methyl hóa (U) đều hiển thị; mẫu 2 chỉ chứa ADN
không methyl; mẫu 3 chỉ chứa ADN đã bị methyl hóa; và mẫu 4 không cho sản phẩm
nào. Điện di sử dụng marker L.DNA ladder.
20

Ưu điểm: Kỹ thuật MSP hạn chế được các kết quả dương tính giả từ các nghiên
cứu trước đó dựa trên PCR và sự phân cắt của enzyme giới hạn để phân biệt giữa
ADN bị methyl hóa và không bị methyl hóa.
Hiện nay, kỹ thuật MSP được sử dụng phổ biến nhất do tính đơn giản, nhạy và
chi phí hợp lý của nó, chủ yếu để phát hiện sự tăng cường methyl hóa tại một vùng
promoter quan tâm của một số gen có chức năng quan trọng, liên quan tới sự bất hoạt
gen đó trong các bệnh ung thư ở. Đây là kỹ thuật nhanh chóng phát hiện được sự
methyl hóa của bất kỳ vị trí CpG nào trong một đảo CpG [23].
1.5.2. Giải trình tự bisulfite
Giải trình tự toàn bộ hệ gen bisulfite (Whole genome bisulfite sequencing), còn
được gọi là BS-Seq, là kỹ thuật phân tích hệ gen đầu vào cao cho sự methyl hóa ADN.
Nó dựa trên sự chuyển đổi sodium bisulfite ADN hệ gen, sau đó được giải trình tự bằng
Next-generation sequencing platform. Các trình tự thu được sau đó được sắp xếp lại với
hệ gen tham chiếu để xác định trạng thái methyl hóa của dinucleotide CpG dựa trên sự
bắt cặp sai là do việc chuyển các Cytosine không bị methyl hóa thành Uracil. Dữ liệu
trình tự bisulfit được phân tích bằng công cụ trực tuyến Kismeth2 [10].
21

Hình 1.8. Xác định methyl hóa bằng cách sử dụng methylSEQr™ của AB Bisulfite
Conversion Kit và thiết bị CE để phân tích DNA [10].
1.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN Ở MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ
1.6.1. Real Time RT-PCR (reverse transcription PCR)
Real time PCR là kĩ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN được hiển thị ngay
sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Kĩ thuật này cho phép phát hiện và định lượng
tuyệt đối số lượng bản sao của một hay nhiều trình tự cụ thể của một mẫu ADN [32].
Phản ứng qRT-PCR (Real-time reverse transcription PCR) được sử dụng để
phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua quá trình tổng hợp cADN từ ARN bằng
enzyme phiên mã ngược. cADN sau đó được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.
Sản phẩm của RT-PCR có thể được định lượng nhờ điện di trên gel agarose sau khi
chạy phản ứng PCR hoặc sử dụng phản ứng Real-time PCR. Real-time PCR cho phép
phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại ngay khi phản ứng đang diễn ra dựa
trên cơ sở đánh dấu huỳnh quang, nồng độ sản phẩm được phân tích, dựa trên cường
độ tín hiệu huỳnh quang, từ đó tính toán được nồng độ khuôn ban đầu [32].
22

Ứng dụng: qRT – PCR được sử dụng rộng rãi trong biểu hiện gene, để xác định
sự biểu hiện của một gen hoặc để xác định trình tự của một bản sao mã ARN, bao
gồm cả vùng khởi đầu và kết thúc phiên mã.
1.6.2. RT – PCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang
Phương pháp phổ biến nhất là sử dụng thuốc nhuộm ADN, thường là SYBR
Green, thuốc nhuộm gắn không đặc hiệu vào tất cả các chuỗi ADN kép và phát
huỳnh quang, sau mỗi chu kỳ phản ứng, lượng ADN sản phẩm tăng làm tăng cường
độ tín hiệu huỳnh quang tương ứng. Nhược điểm của chất huỳnh quang là có thể gắn
vào các sản phẩm tự mồi gây nên hiện tượng nhiễu, làm giảm độ chính xác trong
phân tích định lượng kết quả trình tự đích cần khuếch đại [32].
Phản ứng được thực hiện trong một máy chu kỳ nhiệt như bình thường, trừ việc
thêm thuốc nhuộm chuỗi ADN kép, thuốc nhuộm chỉ phát quang khi gắn với chuỗi
ADN kép, và đầu dò sẽ đo mức huỳnh quang sau mỗi chu kỳ. Nếu kèm gam chuẩn
ngoài thì phản ứng có thể định lượng được [32].
1.6.3. RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR TaqMan)
Sử dụng đầu dò mang chất huỳnh quang là một phương pháp chính xác và đáng
tin cậy nhất, nhưng cũng đắt nhất. Nguyên lý của phương pháp này là các đầu dò
chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang tới sản phẩm khuếch đại cần phát hiện
(hiện tượng FRET). Đầu dò ADN hay ARN gắn đặc hiệu vào khu vực giữa hai đoạn
mồi để định lượng chỉ những ADN chứa trình tự đầu dò, do vậy làm tăng đáng kể độ
đặc hiệu, và thậm chí có thể cho phép định lượng khi có mặt cả một số sản phẩm
khuếch đại không đặc hiệu. Khả năng này còn cho phép làm thử nghiệm đa mồi khi
sử dụng các đầu dò đặc hiệu đánh dấu các mầu khác nhau.
23

Hình 1.9. Sơ đồ real-time PCR TaqMan [32].
Thông thường, đầu dò mang huỳnh quang ở một đầu (Reporter – 5’) và một
chất chặn ở đầu kia (Quencher – 3’), vị trí gần nhau giữa chất mang và chất chặn làm
thuốc nhuộm huỳnh quang truyền năng lượng tới chất chặn gần đó chứ không phát
quang. Khi taq polymerase hoạt động, do enzyme này có hoạt tính 5’ – 3’
exonuclease nên đầu dò bị đánh bật khỏi khuôn mẫu, lúc này, trạng thái gần nhau
giữa chất mang và chất chặn bị phá vỡ nên hiện tượng FRET không xảy ra nữa, chất
huỳnh quang không còn bị chặn, ở trạng thái tự do nên phát quang và tín hiệu phát
quang này sẽ được máy đo lại. Sản phẩm đích tăng lên sau mỗi chu kỳ phản ứng thì
lượng chất huỳnh quang tự do được giải phóng ra cũng tích tụ lại ngày càng nhiều.
PCR được tiến hành bình thường, trừ việc thêm đầu dò có đánh dấu huỳnh quang;
Khi phản ứng bắt đầu, ở giai đoạn gắn mồi của PCR, cả mồi và đầu dò đều gắn đặc hiệu
vào ADN đích; Quá trình tổng hợp chuỗi được thực hiện từ vị trí các mồi, và khi taq
polymerase chạm vào đầu dò thì hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của enzyme này phá hủy
đầu dò, tách chất mang huỳnh quang khỏi chất chặn và do đó làm tăng lượng chất huỳnh
quang ở dạng tự do. Chất huỳnh quang được đo bằng máy real-time PCR, lượng tăng
trung bình nhân chất huỳnh quang tương ứng với lượng tăng cấp số mũ của sản phẩm và
được sử dụng để xác định chu kỳ ngưỡng (Ct) của mỗi phản ứng.
24

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bốn giống lúa khác nhau bao gồm
giống Nipponbare, Pokkali, Dâu Ấn Độ và Nếp Nõn Tre do Học viện Nông nghiệp
Việt Nam cung cấp.
2.1.2. Mồi phản ứng PCR
Các mồi đặc hiệu sử dụng trong phản ứng PCR được thiết kế sau đó được đặt tại
IDT (Integrated DNA technologies), Mỹ bao gồm:
Bảng 2.1. Danh sách các mồi sử dụng trong nghiên cứu
Kích
Tm
thước
Mồi phản ứng MSP sản
(°C)
phẩm
(bp)
Mồi Fw: 5’-TTTTTAAATGAGTAGGTTGTTACGA-3’ 54 122
Methyl Rv: 5’-TTTTTAAATGAGTAGGTTGTTACG-3’ 54 122
Mồi Fw: 5’-TTTTTTAAATGAGTAGGTTGTTATGA-3’ 54 122
Unmethyl Rv: 5’-TACCATCTTACAATTCTATAAACACAA-3’ 54 122
Mồi phản ứng RT-qPCR
Mồi gen
Fw: 5’-CTGTGGCAGGAAAGTGCTCTA-3’ 60 96
SOS1
Rv: 5’-TTCAGTGATGAGAACCCTGAGC-3’ 60 96
Mồi gen Fw: 5’-ATCATCAGGTGTGTTCCTCTCTC-3’ 60 85
OsHKT
2,1 Rv: 5’-CATTGGCTTGATGCCCAGTGT-3’ 60 85
Mồi gen
Fw: 5’-CTCCCCCATGCTATCCTTCG-3’ 60 91
Actin
Rv: 5’-TGAATGAGTAACCACGCTCCG-3’ 60 91
Chú thích: Fw: Mồi xuôi, Rv: Mồi ngược
25

2.1.3. Hóa chất
2.1.3.1. Hóa chất tách chiết ADN tổng số
Hoá chất tách chiết ADN bao gồm: Tris HCl, EDTA, NaCl, CTAB,
Chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol, Ethanol
- Đệm tách chiết ADN tổng số (đệm CTAB):
✓
CTAB 1%
✓
Tris-HCl 0,1M
✓
EDTA 0,5M, pH 8,0
✓
NaCl 5M
- TE buffer pH = 8,0
✓
Tris 1M, pH = 8,0
✓
NaCl 5M
✓
EDTA 0,5M, pH 8,0
2.1.3.2. Hóa chất điện di
Các hóa chất dùng để điện di bao gồm: Agarose, Ethidium bromide; Tris base,
EDTA, ladder 100 bp plus (Thermo Fisher) và Dye 6X
2.1.3.3. Hóa chất cho MSP
Bisulfite modification: EpiJET Bisulfite Conversion Kit (Thermo Fisher
Scientific, USA), 500 ng ADN.
MSP-PCR: được thực hiện cùng với HotStart Taq Master Mix 2X Kit (Qiagen,
USA), Taq buffer, dNTPs của Fermentas, mồi đặc hiệu và Enzyme CpG
Methyltrasferase (M.SssI) (New England Biolabs, Mỹ).
Tinh sạch ADN: QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Đức).
2.1.3.4. Hóa chất cho Realtime PCR
Kit phản ứng RT-PCR: Revert-Aid First Strand cDNA Synthesis Kit ( Thermo
Fisher Scientific, USA)
26

SYBR Green PCR Master Mix ( Thermo Scientific, Hoa Kỳ)
2.1.4. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
Bao gồm các thiết bị và máy móc thuộc khoa Sinh học và phòng thí nghiệm
Trọng Điểm Công nghệ Enzyme- Protein, Trường Đại học Khoa học tự nhiên- Đại
học Quốc Gia Hà Nội như: Máy nghiền mẫu Retsch-Đức, Máy li tâm Mikro 22R
Hettich-Đức, Thiết bị điện di ngang: Mini-Subcell GT (Bio-Rad, Mỹ), Thiết bị điện
di đứng Mini-protein 3 (Bio-Rad, Mỹ), Máy nhân gen PCR ABI Fast 7500 (Applied
Biosystem, Mỹ), Máy Speed vac (Thermo Scientific, Mỹ), Máy soi gel Doc XR
Biorad -Mỹ, máy đo hàm lượng chlorophyll SPAD-502 (Konica-Minolta, Nhật Bản),
máy đo diện tích lá của Licor-3100C (LI-COR Bioscience, USA). Ngoài ra còn các
thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như cân phân tích, cân kỹ thuật, tủ
lạnh -20o
C, máy vortex, bể ổn nhiệt, bể điện di…
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Trồng cây, xử lý mặn, thu mẫu và phương pháp đánh giá kiểu hình
Hạt giống của bốn giống lúa Oryza sativa L.: Nipponbare, Pokkali, Dâu Ấn Độ và
Nếp Nõn được ủ nảy mầm trong bóng tối 4 ngày. Sau đó, các cây con được chuyển sang
các hộp có chứa môi trường Yoshida [58] trong nhà kính để đánh giá kiểu hình hoặc
trong buồng tăng trưởng (12 giờ ở điều kiện 500 μE m-2
s-1
, 26 ° C và 12 giờ ở 22
° C) cho thí nghiệm biểu hiện gen và methyl hóa. Cây con được trồng trên các lỗ cố
định của nắp đậy hộp chứa. Môi trường tăng trưởng được đổi mới mỗi tuần.
Cây con 14 ngày tuổi được đem đi xử lý mặn bằng cách bổ sung NaCl vào môi
trường nuôi cấy để đạt nồng độ 100 mM NaCl. Sau đó tiến hành thu mẫu lá tại các
thời điểm 1, 3, 24 giờ sau xử lý mặn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Đồng
thời, tiến hành thu mẫu lá 14 ngày không xử lý mặn để làm giống đối chứng. Thí
nghiệm xử lý mặn được thực hiện tiếp trong 14 ngày. Kết quả kiểu hình lá thu được
dùng để đánh giá kiểu hình cây chịu mặn và cây mẫn cảm.
Ảnh hưởng của stress mặn lên các cây con được đánh giá thông qua việc đánh
giá một số chỉ số hình thái, sinh hóa như : đánh giá đặc điểm lá (chỉ số scoring của
IRRI, bảng 2.2), chiều cao cây, số nhánh, hàm lượng chlorophyll, diện tích lá.
27

Đặc điểm kiểu hình lá của cây bị xử lý mặn và cây đối chứng được xếp hạng theo
giá trị xếp hạng trung bình quy ước trong bảng 2.2, theo Do và cộng sự (2014) [21].
Bảng 2.2. Chỉ số scoring để đánh giá đặc điểm hình thái lá của IRRI
Điểm Đặc điểm Khả năng chịu mặn
1
Tăng trưởng bình thường, không có triệu
Khả năng chịu mặn cao
chứng bất thường của lá
3
Sự phát triển gần như bình thường, hoặc vài
Có khả năng chịu mặn
lá cuộn lại và màu trắng
5
Tăng trưởng chậm; hầu hết lá cuộn; chỉ có
Chịu mặn vừa phải
một số ít phát triển
7
Chấm dứt sự tăng trưởng; hầu hết lá khô;
Nhạy cảm
một số cây chết
9 Hầu như tất cả các cây chết Nhạy cảm cao
Với quy ước như trên, điểm đánh giá hình thái lá theo IRRI được tính theo
thang điểm 1, 3, 5, 7 và 9, trong đó điểm hình thái lá quy ước là 1, 3 và 5 thể hiện là
cây có khả năng chịu mặn. Còn điểm hình thái lá đạt 7, 9 thể hiện cây mẫn cảm với
mặn, khi đạt tới điểm 9 hầu như các cây không thể sống sót.
Đồng thời 14 ngày sau khi xử lý mặn, số nhánh, chiều cao cây, hàm lượng
chlorophyll và diện tích lá được đo cho mỗi cây. Trong đó, hàm lượng chlorophyll lá
được đo bằng máy SPAD-502 (Konica-Minolta, Nhật Bản), diện tích lá được đo bằng
máy đo diện tích của Licor-3100C (LI-COR Bioscience, USA). Giá trị thu được là
giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (Số cây được đo là n = 3 trong mỗi điều kiện). Sau
đó, tiến hành so sánh và phân tích dữ liệu thu được.
2.2.2. Thiết kế mồi cho nghiên cứu sự methyl hóa và biểu hiện gen SOS1 ở lúa
2.2.2.1. Thiết kế mồi cho phản ứng MSP
*Mục tiêu thiết kế mồi
Theo nghiên cứu của Hoa và cộng sự [40], gen SOS1 có 2 vị trí methyl hóa
cao nằm trong vùng mã hóa của gen, do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự methyl
hóa trên 1 trong hai vùng trình tự đó. Mặt khác, sản phẩm MSP được giải trình tự cho
28

kết quả tốt nhất là từ 150-300 bp nên cần thiết kế được cặp mồi phù hợp có thể nhân
được đoạn trình tự mong muốn. Các bước thiết kế mồi được tiến hành như sau:
Trình tự gen và trình tự CDS của gen SOS1 được lấy từ dữ liệu ngân hàng gen
lúa : http://rice.plantbiology.msu.edu/. Sử dụng phần mềm Methprimer, chúng tôi dự
đoán được các vùng methyl trên gen SOS1 và các cặp mồi tương ứng cho phản ứng
MSP. Lựa chọn các cặp mồi đảm bảo các tiêu chí nhân được đoạn trình tự methyl hóa
cao như mong muốn từ vị trí exon 10 đến exon 14 để kết quả giải trình tự bisulfit
không bị gián đoạn.
2.2.2.1. Thiết kế mồi cho phản ứng RT-PCR
* Mục tiêu thiết kế mồi: Để đánh giá mức độ biểu hiện gen SOS1 sử dụng phản
ứng Real time RT-PCR dùng dye SYBR-Green, chúng tôi đã tiến hành các bước thiết
kế mồi như sau:
Từ cơ sở dữ liệu ngân hàng gen lúa Rice Genome Annotation project chúng tôi
có được trình tự gen SOS1 (LOC_Os12g44360) và Actin 1. Sau đó cặp mồi SOS1-
Forward/ SOS1-Reverse dùng để nhân bản trình tự gen SOS1 và cho gen Actin 1 từ
cDNA được thiết kế sử dụng phần mềm Primer Blast. Trình tự mồi cần đảm bảo
không chứa cấu trúc bậc hai, các khu vực giàu G/C và A/T được phân bố đồng đều và
không có các trình tự bổ trợ giữa hai đầu 3’ để tránh hiện tượng tự mồi. Sau đó, trình
tự mồi đặc hiệu được lựa chọn khi nhân gen mong muốn.
2.2.3. Nhóm phương pháp sử dụng trong nghiên cứu sự methyl hóa gen SOS1
2.2.3.1. Tách chiết ADN tổng số bằng phương pháp CTAB
Để thu ADN tổng số phục vụ cho nhân bản và giải trình tự gen, chúng tôi tiến
hành tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB: là phương pháp sử dụng chất
có hoạt tính bề mặt là cation. Đây là phương pháp đơn giản nhất thường được sử
dụng để tách chiết ADN từ thực vật.
Các bước tiến hành cụ thể: Đầu tiên, cho 50mg mẫu lá lúa đã nghiền vào ống
efpendoff 2ml có chứa 500µl dung dịch đệm CTAB buffer 2X, vortex, sau đó ủ ở
650
C khoảng 15 phút rồi lấy ra để hạ nhiệt độ. Tiếp tục bổ sung 500µl chloroform/
isoamylalcohol (24:1), vortex trong 15 giây rồi tiến hành ly tâm mẫu ở 10000rpm/10
29

min, 40
C, sau đó thu dịch pha trên (300µl) và chuyển sang ống efpendoff 1,5ml mới
có chứa 300µl isopropanol để tủa ADN. Để mẫu trong đá lạnh 10 phút, sau đó lấy ra
và ly tâm lần 2 ở điều kiện 14000rpm/5min, 40
C rồi rửa tủa bằng 500µl EtOH 700
.
Tiếp tục ly tâm ở 14000rpm/5min sau đó để khô. Bước cuối cùng là bổ sung 50µl TE
buffer và bảo quản ở -200
C.
Sau khi tách chiết ADN tổng số, ADN tổng số được kiểm tra chất lượng bằng
phương pháp điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE (Tris base, acid
acetic, EDTA) ở 90V trong 30 phút và được so sánh với maker 1kb và có thể quan sát
được dưới tia UV khi nhuộm Ethidium Bromide
2.2.3.2. Xử lý bisulfite
Mẫu ADN tổng số thu được từ phương pháp CTAB sau đó đem xử lý bisulfit sử
dụng EpiJET Bisulfite Conversion Kit (Thermo Fisher Scientific, UAS). 500ng AND
được xử lý bisulfit để chuyển tất cả các Cytosine không bị methyl hóa thành Uracil
sau đó được khuếch đại bằng phản ứng PCR.
2.2.3.3. Phản ứng PCR
Phản ứng PCR với tổng thể tích 50 µl bao gồm các thành phần được trộn theo
thứ tự trong bảng 2.3 và chạy PCR với chu trình nhiệt của phản ứng như hình 2.1
Bảng 2.3. Các thành phần của phản ứng PCR
Thành phần Thể tích
Nồng độ cuối
cùng
H2O 33,6 µl
Buffer 10X 2,5 µl 1X
MgCl2 2,5 µl 1,5 mM
dNTPs 5 µl 2 mM
Primer SOS1 Forward 2 µl 10 µM
30

Primer SOS1 Reverse 2 µl 10 µM
Taq ADN polymerase 0,4 µl 5 unit
ADN khuôn 2 µl 570ng/nl
Tổng thế tích 50
Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
2.2.3.4. Điện di trên gel agarose
Sản phẩm thu được của phản ứng PCR được đem đi điện di trên gel agarose 2%
và so sánh với Maker 1kb
2.2.3.5. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR sau đó được tinh sạch sử dụng Kit thôi gel Gene
JET PCR Purification Kit của hãng Thermo scientific và được gửi đi giải trình tự.
Quy trình được thực hiện như sau: Bước 1 là cắt phần gel chứa ADN vào ống
efpendoff 1.5ml sau đó bổ sung thêm 200µl buffer 1 (Binding bufer) gấp 3 lần lượng
gel. Ủ ở 60o
C trong 10’, 2-3’ vortex 1 lần. Nếu gel chưa tan thì tăng thời gian ủ. Sau
khi gel tan hết kiểm tra màu dung dich, màu vàng là đạt. Tiếp đó, đổ dung dịch sang
ống “DNA binding colum” ly tâm 13000rpm/1min và đổ dung dịch phía dưới. Tiếp
tục bổ sung 100µl buffer 1, ly tâm 13000rpm/1min và cũng đổ dung dich phía dưới.
Sau đó, Bổ sung 700µl buffer 2 (wash buffer) vào ống “DNA binding colum”, ly tâm
13000rpm/1min và đổ dung dich phía dưới. Tiếp đến, ly tâm 13000rpm/1min với ống
DNA binding colum để loại bỏ wash buffer thừa. Đổ bỏ dung dịch phía dưới, chuyển
31

sang ống 1.5ml. Sau đó bổ sung thêm 20µl buffer 3 (Elution buffer) vào giữa màng
ống. Chờ khoảng 5’ cho dung dich thấm màng. Ly tâm 13000rpm/1min. Thu dung
dịch phía dưới có chứa ADN. Tiếp tục lặp lại bước 9 để thu được ADN với nồng độ
thấp hơn.
Cuối cùng sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được bảo quản ở -200
C trước khi
gửi đi giải trình tự .
2.2.4. Nhóm phương pháp sử dụng trong nghiên cứu mức độ biểu hiện gen SOS1
2.2.4.1. Tách chiết ARN tổng số
Các mẫu được nghiền trong nitơ lỏng, ARN tổng số được tách chiết bằng kit
GeneJET Plant RNA purification Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) theo quy trình
của nhà sản xuất.
2.2.4.2. Xử lý DNase I, kiểm tra chất lượng ARN
Lá của cả cây đối chứng và cây xử lý mặn đã được thu hoạch sau 1, 3 và 24 giờ sau
khi xử lý mặn và ngay lập tức làm lạnh bằng Ni tơ lỏng để phân tích mức độ biểu hiện và
phân tích sự methyl hóa. ARN tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra nồng độ ARN
bằng đo quang phổ (NanoDrop ND-1000 UV-Vis quang phổ, Nanodrop Technologies,
Wilmington, DE) sau đó được loại bỏ ADN bằng xử lý với DNase I (Thermo Fisher
Scientific, USA) và được kiểm tra việc loại bỏ ADN hệ gen bằng qRT-PCR sử dụng mồi
khuếch đại trình tự intron của gen OsHKT2; 1 (LOC_Os06g48810). Các mẫu ARN thu
được cuối cùng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%.
2.2.4.3. Tổng hợp cDNA
1 μg ARN tổng số được chuyển thành cDNA sử dụng Kit Revert-Aid First
Strand cDNA Synthesis (Thermo Fisher Scientific, USA) với mồi OligodT. Quy trình
thao tác được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.4.4. Phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu
Tổng thể tích của mỗi phản ứng Real-time PCR định lượng là 20 µl, bao gồm
SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Scientific, Hoa Kỳ), khuôn cDNA và một cặp
primer thiết kế đặc hiệu cho gen SOS1 hoặc gen Actin 1 với nồng độ sau cùng là 0,4
32

µM. Các phản ứng được thực hiện trên máy AB ABI Fast 7500 (Applied Biosystems,
Foster City, CA). Chu trình chạy phản ứng bao gồm giai đoạn biến tính ở 95°C trong 10
phút, giai đoạn bắt cặp trong 40 chu kỳ ở 95°C ( trong 15 giây) và giai đoạn kéo dài
ở 60°C ( trong 1 phút) sử dụng đĩa 96 giếng. Tính đặc hiệu của phản ứng và kích
thước chính xác của ADN khuếch đại được kiểm tra bằng điện di gel agarose và phân
tích đường cong nóng chảy. Gen đối chứng Actin1, đã được sử dụng để so sánh sự
khác biệt về lượng cDNA đầu vào.
2.2.4.5. Phân tích số liệu
Để kiểm tra độ đặc hiệu hay số sản phẩm được khuếch đại ở mỗi phản ứng,
phân tích đường cong nóng chảy DNA (dissociation melting curves) được thực hiện
bằng cách giữ ở nhiệt độ 95°C trong 15 giây trước khi gia tăng nhiệt đều từ 60°C lên
95°C. Phương pháp delta Ct được sử dụng để so sánh tương đối mức độ biểu hiện
gen ở các giống lúa khác nhau [35].
Phương pháp 2-∆∆Ct
của Livak [35]
Đây là phương pháp dùng để nghiên cứu biểu hiện của một gen đột biến so với
mẫu tế bào bình thường. Trong phương pháp này, người làm thí nghiệm cần định lượng
gen cần nghiên cứu ( Targer = Tg) và một gen tham chiếu hay gen đối chứng ( reference
= Ref) tức là gen mà các nghiên cứu trước đó đã xác định là có biểu hiện như nhau
giữa hai mẫu tế bào (Mẫu thí nghiệm được gọi là T và mẫu đối chứng được gọi là C).
Như vậy ứng với mẫu T và mẫu C sẽ có các kết quả định lượng cho cả gen Tg và gen
Ref qua các thông số:
• Ct (T/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gen đích ( Tg) trong mẫu thí nghiệm (T),
• Ct (T/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu (Ref) trong mẫu thí nghiệm (T),
• Ct (C/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gen đích (Tg) trong mẫu đối chứng (C),
• Ct ( C/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu (Ref) trong mẫu đối chứng (C).
Dựa trên các thông số này, chúng ta sẽ thường hóa ( nomalized) chu kỳ ngưỡng
của gen đích trên mẫu thí nghiệm ( T) và mẫu đối chứng (C) bằng cách tính hiệu số
chênh lệch Ct của gen đích với gen tham chiếu trên các mẫu:
Mẫu thí nghiệm : ∆Ct(T) = Ct (T/Tg) – Ct( T/Ref)
Mẫu đối chứng : ∆Ct (C) = Ct (C/Tg) – Ct ( C/Ref)
33

Sau đó sẽ thường hóa ∆Ct mẫu thử bằng hiệu số chênh lệch ∆Ct (T) với ∆Ct (C)
∆∆Ct = ∆Ct(T) - ∆Ct (C)
Từ đó tính ra tỷ lệ biểu hiện của gen đích trên mẫu thí nghiệm so với mẫu đối chứng
bằng 2-∆∆Ct
34

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Nghiên cứu sự methyl hóa và mức độ biểu hiện của gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn ở cây lúa (oryza sativa).doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên cứu sự methyl hóa và mức độ biểu hiện của gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn ở cây lúa (oryza sativa).doc

Similar to Nghiên cứu sự methyl hóa và mức độ biểu hiện của gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn ở cây lúa (oryza sativa).doc (12)

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói ☎☎☎ Liên hệ ZALO/TELE: 0973.287.149 👍👍

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói ☎☎☎ Liên hệ ZALO/TELE: 0973.287.149 👍👍 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên cứu sự methyl hóa và mức độ biểu hiện của gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn ở cây lúa (oryza sativa).doc