Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxi hóa của cây lạc tiên ở tỉnh Thừa Thiên Huế.doc

Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149
Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
NGUYỄN NHỊ HỒNG THỦY
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM, KHÁNG OXI HÓA CỦA CÂY
LẠC TIÊN (PASSIFLORA FOETIDA L.) Ở TỈNH THỪA THIÊN
HUẾ BẰNG DUNG MÔI HỮU CƠ ÍT PHÂN CỰC
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Thừa Thiên Huế, Năm

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
NGUYỄN NHỊ HỒNG THỦY
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM, KHÁNG OXI HÓA CỦA CÂY
LẠC TIÊN (PASSIFLORA FOETIDA L.) Ở TỈNH THỪA THIÊN
HUẾ BẰNG DUNG MÔI HỮU CƠ ÍT PHÂN CỰC
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60 44 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN CHÍ BẢO
Thừa Thiên Huế, Năm
i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết
quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử
dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Họ tên tác giả
Nguyễn Nhị Hồng Thủy
ii

LỜI CẢM ƠN
Luận văn được hoàn thành tại phòng thí nghiệm hợp chất tự nhiên, trường
Đại học Sư phạm Huế.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Chí Bảo, người thầy đã
tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Hóa nói chung và tổ Hóa
hữu cơ nói riêng đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu về chuyên môn giúp tôi hoàn
thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Sau Đại học trường
Đại học Sư phạm Huế đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn!
Học viên thực hiện
Nguyễn Nhị Hồng Thủy
iii

MỤC LỤC
TRANG PHỤ BÌA.................................................................................................................................. i
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................................................... ii
LỜI CẢM ƠN.........................................................................................................................................iii
MỤC LỤC...................................................................................................................................................1
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT...........................................................3
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH ....................................................4
MỞ ĐẦU......................................................................................................................................................4
1. Lý do chọn đề tài..................................................................................................................................5
2. Đối tượng và mục đích nghiên cứu..............................................................................................5
3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................................................6
4. Bố cục luận văn.....................................................................................................................................6
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................7
1. Giới thiệu về chi Passiflora.............................................................................................................7
1.1. Đặc điểm thực vật ............................................................................................................................7
1.2. Một số loài thuộc chi Passiflora phân bố ở Việt Nam.....................................................7
1.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học một số loài thuộc chi Passiflora............10
1.3.1. Các hợp chất flavonoid...........................................................................................................12
1.3.2. Các hợp chất alkaloid ..............................................................................................................15
1.3.3. Các hợp chất cyanogen glycoside......................................................................................16
1.3.4. Các hợp chất khác.....................................................................................................................18
1.4. Giới thiệu về cây lạc tiên ...........................................................................................................20
1.4.1. Đặc điểm thực vật .....................................................................................................................20
1.4.2. Phân bố sinh thái của cây lạc tiên ......................................................................................21
1.4.3. Công dụng của cây lạc tiên ...................................................................................................21
1.4.4. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây lạc tiên ............................................22
1.4.4.1. Thành phần hóa học .............................................................................................................22
1.4.4.2. Hoạt tính sinh học..................................................................................................................23
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM..................................................................................................24
2.1. Phương pháp xử lí mẫu thực vật.............................................................................................24
1

2.1.1. Thu và xử lí mẫu........................................................................................................................24
2.1.2. Xác định tên khoa học.............................................................................................................24
2.2. Hóa chất và dụng cụ, thiết bị nghiên cứu ...........................................................................24
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...........................................................................................................24
2.3.1. Phương pháp chiết mẫu ..........................................................................................................24
2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các cao chiết cây
lạc tiên.........................................................................................................................................................27
2.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa...........................................................28
2.3.4. Xác định thành phần các chất dễ bay hơi trong cao chiết n-hexan của cây lạc tiên29
2.3.5. Phân lập và xác định cấu trúc của các cấu tử tách được ..........................................29
2.3.5.1. Phân lập chất............................................................................................................................29
2.3.5.2. Xác định cấu trúc...................................................................................................................34
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.....................................35
3.1. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxi hóa của các cao
chiết cây lạc tiên .....................................................................................................................................35
3.1.1. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm ..........................................................35
3.1.2. Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa.................................................................................36
3.2. Kết quả xác định thành phần hóa học các chất dễ bay hơi trong cao chiết
n-hexan từ cây lạc tiên .........................................................................................................................36
3.3. Các hợp chất phân lập từ cao chiết điclometan của cây lạc tiên...............................37
3.3.1. Hợp chất PED1...........................................................................................................................38
3.3.2. Hợp chất PED4...........................................................................................................................40
3.3.3. Hỗn hợp PED2 và PED3........................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................................................48
PHỤ LỤC
2

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Tên gọi
13
C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13
C
ĐCM Điclometan
EtOAc Etyl axetat
EtOH Etanol
GC/MS Sắc ký khí ghép khối phổ
1
H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
HTSH Hoạt tính sinh học
IR Phổ hồng ngoại
Me Metyl
MeOH Metanol
P. Passiflora
SKBM Sắc ký bản mỏng
SKC Sắc ký cột
TPHH Thành phần hóa học
3

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Passiflora phân bố ở Việt Nam............................................. 8
Bảng 1.2. Thành phần hóa học một số loài thuộc chi Passiflora.....................................10
Bảng 1.4. Thành phần hóa học của cây lạc tiên.......................................................................22
Bảng 2.2. Kết quả sắc ký cột cao chiết điclometan cây lạc tiên.......................................31
Bảng 3.1. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các cao chiết cây lạc
tiên................................................................................................................................................................35
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa của các cao chiết cây lạc tiên...........36
Bảng 3.4. Các cấu tử dễ bay hơi được định danh trong cao chiết n-hexan của cây lạc
tiên................................................................................................................................................................37
Bảng 3.16. Số liệu phổ 1
H-NMR của hỗn hợp chất PED2 và PED3 với hỗn hợp
stigmasterol và -sitosterol...............................................................................................................45

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Quy trình chiết mẫu .......................................................................................................26
Sơ đồ 2.3. Phân lập chất từ cao chiết điclometan cây lạc tiên...........................................33

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.3. Một số hình ảnh về cây lạc tiên..................................................................................21
Hình 3.3 Sắc ký đồ GC cao chiết n-hexan .................................................................................36
Hình 3.5. Phổ hồng ngoại của hợp chất PED1.........................................................................38
Hình 3.6. Phổ 1
H-NMR giãn rộng của hợp chất PED1.......................................................38
Hình 3.7. Phổ 13
C-NMR của hợp chất PED1..........................................................................39
Hình 3.8. Phổ ESI-MS (+) của hợp chất PED1.......................................................................40
Hình 3.9. Phổ 13
C-NMR của hợp chất PED4..........................................................................41
Hình 3.10. Phổ 13
C-NMR và DEPT của hợp chất PED4...................................................41
Hình 3.11. Phổ 1
H-NMR giãn rộng của hợp chất PED4 ....................................................42
Hình 3.12. Phổ ESI-MS (+) của hợp chất PED4 ....................................................................43
Hình 3.13. Phổ 1
H-NMR của hợp chất PED2 và PED3.....................................................44
4

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây lạc tiên hay còn gọi là cây nhãn lồng có tên khoa học Passiflora foetida
L. thuộc họ lạc tiên (Passifloraceae); là cây dây leo thân cỏ, có lá và quả ăn được.
Cây có nguồn gốc từ tây nam Hoa Kỳ, Mexico, vùng Caribe, Trung Mỹ và Nam Mỹ.
Loài lạc tiên này được du nhập đến các vùng nhiệt đới trên toàn thế giới như Đông
Nam Á hay Hawai [39].
Theo Đông y, nhờ quả có tính ngọt, tính bình nên ban đầu tác dụng của cây
lạc tiên chỉ đơn giản là để thanh nhiệt, giải độc, lợi thủy, chữa ho do phế nhiệt, chữa
ung nhọt, lở loét...Khi sử dụng cây lạc tiên cùng một số thảo dược khác hoặc thái
nhỏ, phơi khô sẽ có tác dụng tốt hơn như: giúp an thần, mát gan, chữa trị đau đầu
[35].
Theo nghiên cứu của Tây Âu, ngoài các tác dụng của nghiên cứu Đông y, lạc
tiên còn có thể chữa trị các bệnh như: hỗ trợ đặc trị chứng mất ngủ, ngủ hay mơ,
chống stress, căng thẳng thần kinh, suy nhược cơ thể, tim mạch. Bên cạnh đó còn
giúp chống co thắt các cơ trơn, làm giãn và chữa được các chứng đau co thắt, đường
tiêu hóa, tử cung [35].
Theo chúng tôi được biết, hiện nay trên thế giới đã có một số công trình khoa
học nghiên cứu về thành phần hóa học (TPHH) và hoạt tính sinh học (HTSH) của
cây lạc tiên cũng như họ Passifloraceae nhằm nâng cao giá trị sử dụng của nó. Tuy
nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu cụ thể về TPHH và HTSH của cây lạc tiên còn
hạn chế.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi chọn đề tài:
“Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm,
kháng oxi hóa của cây lạc tiên (Passiflora foetida L.) ở tỉnh Thừa Thiên Huế
bằng dung môi hữu cơ ít phân cực”.
2. Đối tƣợng và mục đích nghiên cứu
* Đối tƣợng nghiên cứu
Cây lạc tiên (Passiflora foetida L.) ở tỉnh Thừa Thiên Huế.
5

* Mục đích nghiên cứu:
Khảo sát TPHH, phân lập và xác định cấu trúc của một số cấu tử trong các
cao chiết bằng dung môi hữu cơ ít phân cực: n-hexan, điclometan.
Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxi hóa các cao chiết từ cây
lạc tiên ở tỉnh Thừa Thiên Huế.
3. Phƣơng pháp nghiên cứu
* Phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết
Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên.
Tổng quan các tài liệu về đặc điểm thực vật, TPHH, HTSH của một số cây
thuộc chi Passiflora.
* Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm
Sử dụng phương pháp chiết rắn - lỏng để điều chế các cao chiết cây lạc tiên
trong các dung môi n-hexan, điclometan, EtOAc, MeOH.
Thử hoạt tính sinh học của các cao chiết thu được.
Đo GC/MS cao chiết n-hexan để xác định thành phần các cấu tử dễ bay hơi.
Phân lập 1-2 cấu tử từ cao chiết trong các dung môi ít phân cực (n-hexan,
điclometan) bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (SKBM), sắc ký cột (SKC)…
Xác định cấu trúc của các cấu tử tách được bằng các phương pháp phổ: IR,
MS, 1
H-NMR, 13
C-NMR, DEPT.
4. Bố cục luận văn
Luận văn bao gồm: 51 trang.
Mục lục: 2 trang.
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt: 1 trang.
Danh mục các bảng biểu, hình ảnh, sơ đồ: 1 trang.
Phần mở đầu: 2 trang.
Phần nội dung: 40 trang.
Chương 1. Tổng quan: 17 trang
Chương 2. Thực nghiệm: 11 trang.
Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận: 12 trang.
Phần kết luận và kiến nghị: 1 trang
Phần tài liệu tham khảo: 4 trang.
6

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Giới thiệu về chi Passiflora
1.1. Đặc điểm thực vật
Họ lạc tiên (Passifloraceae) là một họ thực vật có hoa chứa hơn 750 loài với
khoảng 27 chi bao gồm các loại cây thân gỗ, cây bụi, dây leo và phân bố ở vùng
nhiệt đới [39].
Chi Passiflora là một chi thực vật thuộc họ lạc tiên (Passifloraceae). Chi này
có khoảng 500 loài chủ yếu là cây dây leo, có một số là cây bụi, và một số loài là
cây thân thảo. Hầu hết các loài được tìm thấy ở Nam Mỹ, Nam Á, Đông Á và New
Guinea [38].
Hầu hết các loài thuộc chi Passiflora có tua cuốn, thân thảo hoặc thân cỏ, dây
leo. Các loài thuộc chi Passiflora có rễ mọc khá cạn, có thể quan sát thấy 60% rễ
cách mặt đất 30 cm. Hoa có thể đơn tính hoặc lưỡng tính, màu sáng, có nhiều sợi
hoặc hình khuyên phụ giữa tràng hoa và nhụy hoa, những đặc điểm này làm hoa có
hình thức rất đa dạng. Đài hoa gồm 3 đến 5 lớp xếp đè lên nhau, nằm tự do hoặc ở
trên lá đài. Mỗi hoa có khoảng 3 đến 5 nhụy dưới bao hoa hoặc ở đầu noãn hoa. Lá
so le, đơn, đôi khi lá kép, thùy lá giống hình bàn tay, một vài trường hợp có lông
mịn. Một số loài có sự khác biệt giữa lá non và lá trưởng thành về hình dáng và kích
thước. Quá trình thụ phấn được thực hiện bởi côn trùng, màu sắc đẹp của hoa đóng
vai trò quan trọng trong việc thu hút côn trùng thụ phấn [12].
1.2. Một số loài thuộc chi Passiflora phân bố ở Việt Nam
Ở Việt Nam, theo danh mục các loài thực vật Việt Nam, chi Passiflora có
khoảng 15 loài, được phân bố rộng rãi trên khắp cả nước từ bắc chí nam. Trong số
15 loài phân bố ở Việt Nam, có đến 10 loài được dùng làm thuốc theo kinh nghiệm
dân gian [2].
7

Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Passiflora phân bố ở Việt Nam
TT Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bố Công dụng
1 Passiflora Chùm bao; Lạc Quảng Nam,Làm cảnh. Lá làm thuốc trị
caerulea L. tiên cảnh. TP. Hồ Chínhức đầu, sốt. Rễ, Thân và
Minh. quả làm thuốc trừ phong
thấp.
2 Passiflora Nhãn lồng hình Lào Cai, Vĩnh Toàn cây tác dụng giải độc
cupiforms ly Phúc, Huế,tán ứ, hoạt huyết, trị ung
Mast. Đà Nẵng. nhọt, rắn cắn. Nước uống trị
viêm gan, sốt rét, liệt do
phong thấp.
3 Passiflora Lạc tiênBắc cạn.
eberhardtii eberhardtii;
Gagnep. nhãn lồng
eberhardtii.
4 Passiflora edulis Dây mát, Hà Nội, KonLàm cảnh, quả ăn được
Sims chùm baoTum, Gia Lai, hoặc làm rau, tác dụng bổ,
trứng. Lâm Đồng. làm cường tráng và hưng
phấn, chữa đau bụng kinh.
5 Passiflora foetida Lạc tiên, Mọc hoangNgọn và lá non làm rau,
L. Chùm bao,khắp nơi ởQuả chín ăn được. Có tác
nhãn lồng. Việt Nam. dụng an thần, điều kinh,
chữa ho suy nhược thần
kinh, phù thũng. Lá giã đắp
chữa mụn nhọt, lở loét ở
chân, viêm mủ da. Toàn cây
chữa bỏng lửa, bỏng nước
sôi.
6 Passiflora Lạc tiên tây,Hà Nội, Lâm Đọt non ăn được có tác
incarnata L. mắc mát. Đồng. dụng an thần, Quả chín ăn
được chữa mất ngủ, đau
dây thần kinh, đau bụng đi
ngoài, kiết lị, trĩ, bại liệt,
8

nhiễm độc Morphin.
7 Passiflora Guồi tây, DưaTP. Hồ ChíQuả chín thơm, vị chua, ăn
laurifolia L. tây. Minh ngon. Lá có độc, tác dụng
an thần, hơ nóng đắp mụn
nhọt đang mưng mủ.
8 Passiflora Lạc tiên Cả nước. Thanh nhiệt, giải độc chữa
moluccana Molucca. ghẻ lở.
Reinw.ex Blume
9 Passiflora Lạc tiên baHà Nội, TP.
pertriloba thùy, nhãn lồng Hồ Chí Minh.
Merr. ba thùy.
10 Passiflora Dưa gang tây. Hà Nội, TP.Làm cảnh, Thực phẩm. Rễ
quadrangulrs Hồ Chí Minh. an thần gây ngủ mạnh. Lá
L. độc nhẹ.
11 Passiflora Lạc tiên thái,Bắc bộ, Tây
siamica Craib. nhãn lồng thái. Nguyên.
12 Passiflora Lạc tiên TP. Hồ Chí
suberora L. Bần, nhãn lồng Minh.
sube.
13 Passiflora Lạc tiênThừa Thiên
sumatrana sumatrana, Huế.
Blume. nhãn lồng
sumatrana.
14 Passiflora Lạc tiên Lạng sơn
tonkinensis bắc, nhãn lồng
W. Wide. bắc.
15 Passiflora Lạc tiênLào Cai. Toàn cây trị phong thấp,
wilsonii Wilson. ngăn tổn thương, mụn nhọt,
Hemsl. chữa sốt rét. Dùng ngoài da
bó gãy xương.
9

1.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học một số loài thuộc chi Passiflora
Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Passiflora cho thấy sự xuất
hiện của nhiều lớp chất như: alkaloid, phenolic, glycosyl flavonoid và cyanogen…
Bảng 1.2. Thành phần hóa học một số loài thuộc chi Passiflora
KH Loài Thành phần hóa học TLTK
1 P. adenopoda Cyanogen glycoside: linamarin (29), [9],
Moc.& Sesse lotaustralin (30). [33]
2 P. alata Dryand. C-glycosyl flavanoid: vitexin (3), isovitexin [9]
(4), orientin (10).
3 P.apetala Linn. Cyanogenic glycoside: Passibiflorine (34). [9]
4 P. biflora Domb. O- và C-glycosylflavon: swertisin (5), 2”-O- [9],
rhamnosyl isoorientin (23) và 2”-O- [16]
rhamnosyl isovitexin (22).
Cyanogenic glycoside: passibiflorine (34) và
epipassibiflorine (35).
5 P. caerulea Linn. Flavone: chrysin (17). [9]
Cyanogen glycoside sulphate: tetraphyllin B-
4-sulphate và epitetraphyllin B-4-sulphate.
6 P. coccinea Aubl. Cyanogenic glycoside: passicoccin (45). [9]
7 P. coriacea Fuss. Cyanogenic glycoside: baterin (40). [9]
8 P. cyanea Mast. Hợp chất coumarin: esculetin (54). [9]
9 P. edulis Hợp chất phenol: 4-hydroxyl- -ionol, 2,6- [9],
dimethylocta-1,7-dien-2,6-diol, 2,6-dimethyl- [34],
1,8-octandiol, 2,6-dimethyl-octa-1,7-dien- [35]
3,6-diol.
Alkaloid: harmane (24), harmine (26),
harmaline (28), harmalol (27).
Hợp chất glycoside: passiflorine (33)
passicapsin (36), passibiflorine (34).
Triterpenoid: cyclopasssifloside XII (46) và
10

cyclopasssifloside XIII (47).
Flavonoid: luteolin-8-C- -
digitoxopyranosyl-4’-O- -D-
glucopyranoside (12), apigenin-8-C- -
digitoxopyranoside (14), apigenin-8-C- -
boivinopyranoside (15), luteolin-8-C- -
boivinopyranoside (13), vicenin-2 (20),
isoorientin (9), isovitexin (4) và 6,8-di-C-
glycosylchrysin (21).
10 P. incarnata Flavonoid: apigenin (6), luteolin (11), [9]
quercetin (2), kaempferol (1), vitexin (3),
isovitexin (4), orientin (10), isoorientin (9),
schaftoside (7), isoschaftoside (8).
Alkaloid: harmane (24), harmol (75),
harmine (26), harmalol (27) và harmalin
(28).
11 P. laurifolia Linn. Axit pantothenic (52), axit ascorbic (51). [9]
12 P. lutea Linn. Cyanogenic glycoside: linamarin (29), [9]
lotaustralin (30) và passibiflorin (34).
13 P. menispermifolia Flavonoid: vitexin (3), orientin (10) và [9]
H.B.K luteolin-7- -D-glycoside (19)
Coumarin: esculetin (54).
14 P. molliseria DC Acid ascorbic (51). [9]
15 P. mollissima Passiflorine (33). [8], [9]
Bayley Hợp chất dễ bay hơi: 1,8 cineole, 3-
sulfanylhexyl acetate, linalool, hexanal.
16 P. oerstedii Mast. C-glycosyl flavonoid: 2’’-O-xylosyl vitexin [9]
(64); -sitosterol (55).
17 P. palmeri Linn. Flavonoid: isovitexin (4), vitexin (3), [6]
quercetin (2), luteolin (11), isoorientin (9),
11

luteolin-7-glucoside (19), vicenin-2 (20), 2’’-
O-rhamnosyl vitexin (18).
18 P.pendens Linn. Linamarin (29), lotaustralin (30), linustatin [9]
(31) và neolinustatin (32).
19 P. pittieri C-glycoside flavonoid: isovitexin (4), [9]
schaftoside (7) và isoschaftoside (8),
luteolin-7-O-glucoside (19).
20 P. quadrangularis Passiflorine (33); triterpene glycoside [9],
Linn. quadranguloside (48). [19]
21 P. sexflora Fuss. Flavonoid: luteolin (16), luteolin-7-O- [9]
glucoside (19).
22 P. suberosa Linn. Cyanogenic glycoside: passisuberosin (37), [9],
epipassisuberosin (38). [33]
23 P. subpeltata Cyanogenic glycoside: barterin (40); [9],
Orteg. quercetin (2), acid gallic (53), apigenin (6). [28]
24 P. talamansis Cyanogenic glycoside: passibiflorine (34) và [9]
epipassibiflorine (35).
25 P. trifasciata Lem. Cyanogenic glycoside: passitrifasciatin (39). [9]
Dựa theo việc phân loại các hợp chất tự nhiên được phân lập từ các loài
thuộc chi Passiflora, có thể thống kê các lớp chất chủ yếu sau:
1.3.1. Các hợp chất flavonoid
Flavonoid là lớp chất thứ cấp thường gặp trong các loài thực vật. Các
flavonoid có cấu trúc chung là bộ khung 15 cacbon gồm hai vòng phenyl và một dị
vòng. Cấu trúc cacbon này có thể được viết tắt C3-C6-C3 [41].
Hiện nay, hơn 5000 flavonoid được tìm thấy ở các loài thực vật trong tự
nhiên và được phân loại theo cấu trúc hóa học thành 5 nhóm chất gồm:
anthoxanthin, flavanone, flavanonol, flavan, anthocyanidin [41].
Năm 2004, theo thống kê của Dhawan và cộng sự cho thấy flavonoid là
nhóm chất chính trong thành phần hóa học của các loài trong chi Passiflora. Trong
đó các flavonoid, chủ yếu là C-glycoside và O-glycoside của khung flavon gồm:
12

kaempferol (1), quercetin (2), vitexin (3), isovitexin (4), swertisin (5), apigenin (6),
schaftoside (7), isoschaftoside (8), isoorientin (9), orientin (10), luteolin (11) [9].
(1) (2)
(3) R: A (4) R: A
(18) R: B (22) R: B
(5) R: A (6) R: H
(14) R: D
(15) R: C
R R1 (9) R: A
(7) A E (23) R: B
(8) E A
13

(10) R: A (11)
A B
C D E
Năm 2013, nhóm nghiên cứu Fengquing Xu đã phân lập được 5 hợp chất C-
dideoxyhexosyl flavone mới từ loài P. edulis Sims gồm: luteolin-8-C- -
digitoxopyranosyl-4’-O- -D-glucopyranoside (12), luteolin-8-C- -
boivinopyranoside (13), apigenin-8-C- -digitoxopyranoside (14), apigenin-8-C- -
boivinopyranoside (15) và 3 hợp chất flavonoid đã biết gồm : luteolin (11), chrysin
(16), chrysin-7-O- -D-glucopyranoside (17) [35].
R R1 R2 R R1 R2
(12) D A H (16) H H H
(13) C H H (17) H A H
(19) H H A (21) A H A
14

Năm 2015, khi tiến hành so sánh hai loài P. edulis phổ biến là P. edulis fo
edulis và P. edulis fo. flavicarpa, Ayres và nhóm nghiên cứu đến từ Brazil đã xác
định được vitexin-2”-O-rhamnoside (18), luteolin-7-O-glucoside (19) là 2 flavonoid
chủ yếu có trong P. edulis fo edulis và isovitexin (4), isoorientin (9), vicenin-2 (20),
6,8-di-C-glycosylchrysin (21) là thành phần chính trong P. edulis fo. flavicarpa [7].
RR1
(20) AA
Năm 2015, Modesti và cộng sự đã phân lập từ loài P. bogotensis hợp chất C-
glycosyl flavonnoid gồm isovitexin (4), isovitexin-2”-O-rhamnoside (22),
isoorientin-2”-O-rhamnoside (23) [17].
1.3.2. Các hợp chất alkaloid
Bên cạnh nhóm chất flavonoid, nhóm chất alkaloid cũng được phân lập từ
các loài thuộc chi Passiflora. Theo Dhawan và cộng sự, các alkaloid có mặt trong
chi Passiflora có cấu trúc indol và khung cơ bản β-carbolin, gồm: harmane (24),
harmol (25), harmine (26), harmalol (27) và harmaline (28) [9].
Tuy nhiên theo Ingale, các alkaloid này tuy có mặt phổ biến trong các loài
thuộc chi Passiflora nhưng hàm lượng tương đối nhỏ [13].
R R
(24) H (27) OH
(25) OH (28) OCH3
(26) OCH3
15

1.3.3. Các hợp chất cyanogen glycoside
Ngoài hai nhóm chất chính là flavonoid và alkaloid, các hợp chất cyanogen
glycoside cũng được phát hiện có trong một số loài thuộc chi Passiflora.
Năm 1986, khi tiến hành nghiên cứu 3 loài P. pendens, P. adenopoda, P.
warmingii, Spencer đã phân lập được 4 hợp chất cyanogen glycoside gồm:
linamarin (29), lotaustralin (30), linustatin (31), neolinustatin (32) [32].
Năm 1987, khi nghiên cứu loài P. suberosa, Spencer và cộng sự tiếp tục
phân lập được 2 hợp chất cyanogen glycoside là passisuberosin (37) và
epipassisuberosin (38) [33].
Năm 2004, theo kết quả thống kê của Dhawan và cộng sự, có 14 hợp chất
cyanogen glycoside được phân lập từ chi Passiflora bao gồm: linamarin (29),
lotaustralin (30), linustatin (31), neolinustatin (32), passiflorine (33), passibiflorine
(34), epipassibiflorine (35), passicapsin (36), passisuberosin (37), epipassisuberosin
(38), passitrifasciatin (39), baterin (40), tetraphyllin A (41), tetraphyllin B (42),
deidaclin (43), volkenin (44), passicoccin (45) [9].
(29) (30)
(31) (32)
16

(33) (34)
(35) (36)
(37) (38)
(39) (40)
17

(41) (42)
(43) (44)
(45)
1.3.4. Các hợp chất khác
Năm 2014, những nghiên cứu của Saravanan và đồng nghiệp cho thấy trong
cao chiết axeton từ quả của loài P. ligularis Juss. có hàm lượng lớn các hợp chất
polyphenol, tannin và flavonoid [29].
* Triterpenoid: Năm 2013, Cong Wang và cộng sự phân lập được 2 hợp chất
cycloartane triterpenoid saponin từ loài P. edulis Sims là cyclopasssifloside XII (46)
và cyclopasssifloside XIII (47) [34].
18

(46) (47)
Quadranguloside (48) là một triterpenoid được nhóm nghiên cứu của Orsini
phân lập từ loài P. quadrangularis [19].
(48)
* Các axit hữu cơ: Axit linoleic (49), axit linolenic (50) [30], axit ascorbic (51),
axit pantothenic (52), axit gallic (53) [9].
(49)
(50)
19

(51) (52) (53)
* Các hợp chất khác: Ngoài ra, các hợp chất coumarin như esculetin (54) và sterol
như -sitosterol (55) cũng được tìm thấy trong một số loài thuộc chi Passiflora [9].
(54) (55)
1.4. Giới thiệu về cây lạc tiên
1.4.1. Đặc điểm thực vật
Tên khoa học : Passiflora foetida L.
Tên Việt Nam : Lạc tiên, nhãn lồng, lồng đèn, hồng tiên.
Chi : Passiflora
Họ : Lạc tiên (Passifloraceae)
Lạc tiên là một loại cây dây leo, thân mềm, trên có rất nhiều lông mềm. Lá
mềm, mọc so le, hình tim, dài 6-10 cm, rộng 5-8 cm, mép lượn sóng và xẻ hơi sâu
thành 3 thùy, đáy lá hình tim, mép lá có lông mịn, cuốn lá dài 7-8 cm. Đầu tua cuốn
thành lò xo. Hoa đơn độc, 5 cánh màu trắng và hơi tím nhạt, đường kính 5,5 cm, lá
đài màu trắng phía dưới có gân xanh, dưới lá đài có 3 gân chính với những gân phụ
trông như lá mà không có phiến chỉ có gân lá. Một đĩa có 2 tầng tua, mặt tua trên có
màu tím trong vàng, trong cùng có lông mịn. Trụ cao có đầu tim đỏ, 5 nhị có bao
phấn màu vàng gục xuống dưới. Quả hình trứng dài 2-3 cm [4].
20

Hình 1.3. Một số hình ảnh về cây lạc tiên
1.4.2. Phân bố sinh thái của cây lạc tiên [3]
Cây lạc tiên phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới trên toàn thế giới như
Đông Nam Á và Hawaii.
Ở Việt Nam, cây lạc tiên mọc hoang ở khắp mọi nơi, nhất là các tỉnh Hòa
Bình, Thái Nguyên, Bắc Giang, Quảng Bình, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Quảng
Nam.
Lạc tiên là cây ưa ẩm và ưa sáng, thường mọc trùm lên các cây bụi ven rừng,
đồi, nhất là các trảng cây bụi, tái sinh sau nương rẫy. Cây sinh trưởng mạnh khoảng
giữa tháng 3 đến tháng 8. Hoa quả nhiều quanh năm. Mùa đông cây có hiện tượng
hơi rụng lá. Tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt. Nguồn lạc tiên ở Việt Nam nhìn chung
khá dồi dào.
1.4.3. Công dụng của cây lạc tiên
Lạc tiên được dùng làm thuốc an thần, chữa mất ngủ, suy nhược thần kinh.
Ngọn non của cây thường được thu hái để luộc ăn vào buổi chiều hoặc trước khi đi
ngủ vài giờ. Dạng thuốc thông thường là cao lỏng có đường [3].
 Bài thuốc có lạc tiên
Chữa thần kinh suy nhược, mất ngủ, hồi hộp: lạc tiên 150 g, lá vông 130 g,
tâm sen 2,2 g, lá dâu 10 g, đường 90 g. Tất cả nấu thành cao lỏng vừa đủ 100 mL.
Ngày dùng 2-4 thìa to, uống trước khi đi ngủ [3].
21

1.4.4. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây lạc tiên
1.4.4.1. Thành phần hóa học
Theo tác giả Patil.A.S và Paikrao.H.M, trong lạc tiên có mặt các nhóm chất:
flavonoid, alkaloid, steroid, tannin, saponin, anthraquinon, phenolic [21].
Bảng 1.4. Thành phần hóa học của cây lạc tiên
STT Bộ phận Thành phần Tài liệu tham khảo
1 Nhựa cây Polyketide -pyrone gọi là passifloricin A [9], [10], [11], [22]
(56), passiflorincin B (57), passifloricin C
(58); ermanin (59).
2 Hạt, mầm Cyanohydrin glycoside: tetraphyllin A [6], [9], [22]
(41), tetraphyllin B (42), tetraphyllin B
sulphate, deidaclin (43), volkenin (44).
3 Lá C-glycosyl flavonoid: apigenin (8), [9], [15], [18], [22]
isovitexin (4), vitexin (3), luteolin-7- -D-
glucoside (19), kaempferol (1),
pachypodol (60), 7,4’-dimethoxyl
apigenin (61), 4’,7-O-dimethyl naringenin
(62), 3,5-dihydroxy-4’,7-dimethoxy
flavanone (63), 2”-xylosyl vitexin (64).
Alkaloid: harmane (24), harmalol (27),
harmine (26), harmaline (28).
Axit linoleic (49) và axit linolenic (50).
(56) (57) R= H
(58) R= CH3CO
22

(60) (61)
(62) (63)
với
(64) R: F F
1.4.4.2. Hoạt tính sinh học
Theo tác giả Vũ Ngọc Lộ và Hoàng Tích Huyền, alkaloid chiết từ cây lạc
tiên có tác dụng giảm hoạt động của chuột nhắt trắng được kích thích do dùng
cafein và kéo dài thời gian gây ngủ của hexobarbital [3].
Theo Ranganatha. N và cộng sự, cao chiết EtOH từ cây lạc tiên giúp nâng
cao chỉ số thực bào trong hoạt động thực bào, kích thích hệ thống miễn dịch trong
cơ thể [24].
Trong một nghiên cứu của Santosh P chỉ ra cao chiết MeOH của cây lạc tiên
có tác dụng chống trầm cảm trên chuột nhắt trắng trong mô hình thực nghiệm [25].
Các kết quả nghiên cứu của Sasikala. V và cộng sự cho thấy tác dụng giảm
đau và khả năng kháng viêm rất tốt từ cây lạc tiên, có tiềm năng dùng trong dược
phẩm [26].
Một nghiên cứu khác của Sasikala. V cũng cho thấy hoạt tính kháng oxi
hóa cao từ cao chiết EtOH của cây lạc tiên thu hái ở phía nam Ấn Độ [27].
23

CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Phƣơng pháp xử lí mẫu thực vật
2.1.1. Thu và xử lí mẫu
Phần trên mặt đất cây lạc tiên được thu hái vào tháng 1 năm 2016 ở huyện
Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên Huế. Cây lạc tiên tươi được rửa sạch, loại bỏ các lá sâu
bệnh, héo úa để ráo nước có khối lượng 9 kg. Cắt nhỏ, tiến hành phơi khô dưới trời
nắng dịu trong thời gian 1 tuần, xay mịn, khối lượng mẫu khô thu được là 1,6 kg.
2.1.2. Xác định tên khoa học
Mẫu cây lạc tiên được giám định tên khoa học bởi NGƯT Đỗ Xuân Cẩm,
nguyên giảng viên Phân loại học Thực vật trường Đại học Nông lâm Huế.
Kết quả giám định mẫu cây thu hái ở huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên Huế
trong luận văn này chính là cây lạc tiên có tên khoa học là Passiflora foetida L.
2.2. Hóa chất và dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất
Hóa chất hữu cơ: n-hexan, điclometan, clorofom, EtOAc, MeOH, EtOH,
axeton, CH3COOH, thuốc thử vanilin/axit sunfuric.
2.2.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
Máy cô đuổi dung môi RE-52CS-1.
Máy UV WFH-203 ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm của công ty Shanghai
Jingle Industrial.
Máy chiết siêu âm Amsco Reliance sonic 550.
Cột sắc ký với các loại kích cỡ khác nhau.
Bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254, độ dày 0,200 mm.
Cân phân tích chính xác 0,001 gam.
Silica gel pha thường Merck 60 cỡ hạt 0,040-0,063 mm.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp chiết mẫu
Mẫu lạc tiên sau khi được phơi khô, xay nhỏ cho vào bình thủy tinh cỡ 5 lít
rồi cho dung môi n-hexan vào ngập quá lượng mẫu. Đậy kín bình để hạn chế dung
24

môi bay hơi, thỉnh thoảng khuấy mẫu và để trong thời gian 24 giờ. Sau thời gian
trên, tiến hành tách lấy phần dịch chiết rồi lọc phần bã còn lại, tiếp tục ngâm với
dung môi n-hexan thêm bốn lần nữa với thời gian mỗi lần là 24 giờ để chiết các hợp
chất kém phân cực trong mẫu thô ban đầu.
Gộp các phần dịch chiết thu được tiến hành cô đuổi dung môi bằng máy cô
quay dưới áp suất thấp. Nhiệt độ cô đuổi dung môi không được lớn hơn 60o
C vì ở
nhiệt độ này có thể làm hư hại một số hợp chất kém bền nhiệt có trong dịch chiết.
Sau khi cô đuổi dung môi, ta thu được cao chiết n-hexan của cây lạc tiên.
Phần bã còn lại tiếp tục được ngâm chiết trong dung môi điclometan. Cách
tiến hành và thời gian ngâm chiết tương tự như khi tiến hành với dung môi n-hexan.
Dịch chiết thu được khi chiết bằng dung môi điclometan được tiến hành cô đuổi
dung môi để thu cao chiết.
Phần bã rắn còn lại tiếp tục được ngâm chiết với dung môi etyl axetat và cuối
cùng là dung môi metanol. Cách tiến hành tương tự như trên.
25

Mẫu cây lạc tiên (1,6 kg)
Ngâm chiết
n-hexan
Dịch chiết n-hexan Bã chiết n-hexan
Cô đuổi
dung môi
Ngâm chiết
điclometan
Cao chiết n-hexan
(17,894 g)
Dịch chiết
Đo GC/MS điclometan
Thành phần cấu
Cô đuổi
dung môi
tử dễ bay hơi
Cao chiết
điclometan
(25,985 g)
SKC, SKBM
Cấu tử tinh
khiết
Bã chiết
điclometan
Ngâm chiết
etyl axetat
Dịch chiết Bã chiết
etyl axetat etyl axetat
Cô đuổi Ngâm chiết
dung môi metanol
Cao chiết Dịch chiết
etyl axetat metanol
(4,392 g)
Cao chiết
metanol
(108,052 g)
Sơ đồ 2.1. Quy trình chiết mẫu
26

2.3.2. Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các cao chiết
cây lạc tiên
2.3.2.1. Các chủng vi sinh vật và nấm kiểm định
Các chủng vi sinh vật và nấm đại diện gây bệnh ở người bao gồm:
Vi khuẩn:
Gram (-) Pseudomonas aeruginosa (Pa) ATCC 15442
Escherichia coli (Ec) ATCC 25922
Gram (+) Staphylococcus aureus (Sa) ATCC 13709
Bacillus subtilis (Bs) ATCC 6633
Lactobasillus fermentum N4
Enterococus faecium B650
Nấm: Candida albicans (Ca) ATCC 10231
2.3.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy
MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar), TSB (Tryptic
Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi sinh vật; SAB (Soy Agar Broth), SA
(Soy Agar) cho nấm.
2.3.2.3. Phƣơng pháp: phƣơng pháp pha loãng đa nồng độ
* Pha loãng mẫu thử
Mẫu ban đầu được pha trong DMSO (dimetyl sulfoxid) với nồng độ thích
hợp theo yêu cầu và mục đích thử.
Các mẫu được pha thành dãy các nồng độ khác nhau có thể dãy 5 nồng độ
hoặc 10 nồng độ.
Mẫu ban đầu có nồng độ 40 mg/mL được pha loãng thành các nồng độ khác
nhau để thử hoạt tính với các chủng từ nồng độ 256g/mL; 64g/mL, 16g/mL;
4g/mL; 1g/mL.
* Thử hoạt tính
Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105
cfu/mL khi tiến
hành thử.
Lấy 10L dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng, thêm 200
L dung dịch vi sinh vật và nấm, ủ 370
C. Sau 24 giờ, bổ sung 50L MTT (3-(4,5-
27

dimetylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromid) (1mg/mL) vào các giếng
thử và đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có
nồng độ chất thử thấp nhất không chuyển hoá MTT thành MTT formazan cho màu
tím đậm. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy
Tecan (Genios) và phần mềm raw data.
* Chất tham khảo
Kháng sinh Ampicilin cho các chủng vi khuẩn gram (+) và chủng vi khuẩn
Ec gram (-) với giá trị IC50 trong khoảng 0,05-2g/mL.
Hỗn hợp kháng sinh Pen/Step cho chủng vi khuẩn Pa gram (-) với giá trị IC50
trong khoảng 4-5g/mL.
Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5-1g/mL.
2.3.3. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa
Nguyên tắc của phương pháp: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất
tạo ra gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên
cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác
định bằng cách đo quang ở bước sóng = 517 nm.
Phương pháp tiến hành: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong
Metanol (MeOH). Chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối
cùng đạt được một dãy các nồng độ 256; 64; 16; 4; 1g/mL. Để thời gian phản ứng
30 phút ở 370
C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH còn lại bằng máy đọc Genios Tecan
ở bước sóng 517 nm. Phần trăm quét gốc tự do DPPH của mẫu thử được tính theo
công thức sau:
SC% = (OD trắng – OD mẫu thử)/ ODtrắng (%).
EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của
chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3.
28

Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ DPPH và mật độ quang học:
Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH
1.8000
1.6000
y = 0.3225x + 0.0241
(
O
D
)
R2
= 0.9938
1.4000
h
ọ
c
1.2000
1.0000
q
u
a
n
g
0.8000
0.6000
đ
ộ
M
ậ
t
0.4000
0.2000
0.0000
0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000
Nồng độ DPPH mM
2.3.4. Xác định thành phần các chất dễ bay hơi trong cao chiết n-hexan của cây
lạc tiên
Trích một ít cao chiết n-hexan, hòa tan trong 3 mL n-hexan Merck, cho một
ít Na2SO4 khan vào để loại nước (nếu có). Sau đó lọc qua đầu lọc để loại hết chất
bẩn. Dịch chiết thu được đem phân tích bằng phương pháp sắc kí khí - khối phổ liên
hợp (GC/MS).
Sắc kí khí - khối phổ liên hợp (GC/MS) được thực hiện trên máy GC/MS
QP2010 Plus hãng Shimadzu (Nhật Bản) tại Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ
phẩm, thực phẩm Thừa Thiên Huế.
2.3.5. Phân lập và xác định cấu trúc của các cấu tử tách đƣợc
2.3.5.1. Phân lập chất
* Sắc ký lớp mỏng
Trước khi triển khai sắc ký cột, sử dụng sắc kí lớp mỏng để tìm hệ dung môi
giải ly thích hợp với các bước:
Mẫu cần sắc ký được hòa tan trong dung môi phù hợp.
Chuẩn bị bản mỏng, chấm lên mỗi tấm một chấm dung dịch mẫu.
Mỗi bản mỏng được triển khai với một loạt hệ dung môi giải ly khác nhau,
tiếp đến hiện hình các vết trên bản bằng thuốc thử axit.
29

Trích một ít cao chiết n-hexan và điclometan, hòa tan trở lại trong dung môi
tương ứng. Tiến hành sắc kí bản mỏng với các hệ dung môi thích hợp để triển khai
sắc ký cột. Sau quá trình giải ly, làm hiện hình các vết bằng máy UV ở bước sóng
254 và 365 nm, thuốc thử vanilin/axit sunfuric, hơ nóng.
Thuốc thử axit: Cho từ từ 10 mL axit sunfuric đặc vào 200 mL metanol.
Thêm 25 mL axit axetic đặc và 3 gam vanilin.
Từ kết quả sắc kí bản mỏng, chúng tôi đã chọn cao chiết điclometan để tiến
hành sắc kí cột với hệ dung môi giải ly là n-hexan:axeton.
* Sắc kí cột cao chiết điclometan của cây lạc tiên
- Chuẩn bị cột chạy sắc kí:
Cột thủy tinh có khóa và cổ nhám, đường kính 3,4 cm, chiều dài 80 cm, rửa
sạch, sấy khô, cố định cột trên giá sắt theo chiều thẳng đứng.
- Nạp chất hấp thu vào cột:
Nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt: silica gel (loại silica gel 60 cỡ hạt
0,040 - 0,063 mm, Merck) cho vào cốc chứa hệ dung môi n-hexan:axeton (95:5,
v/v) cũng chính là hệ dung môi bắt đầu triển khai SKC. Khuấy đều đến khi thu được
hỗn hợp sệt đồng nhất rồi cho vào cột, vừa cho vào vừa dùng bóp cao su gõ nhẹ cho
chặt cột. Cho hệ dung môi n-hexan:axeton (95:5, v/v) vào chảy liên tục một thời
gian để ổn định cột. Trong khi nạp cột, dung môi liên tục chảy qua cột và không để
khô dung môi ở đầu cột. Sau đó hạ mức dung môi sát với bề mặt chất hấp thu có
trong cột. Khi nạp xong, mặt thoáng của silica gel trong cột phải nằm ngang.
- Nạp mẫu chất vào cột:
Nạp mẫu chất vào cột ở dạng khô: khối lượng cao điclometan sử dụng là
14,9 gam, hòa tan cao chiết trong điclometan, cho thêm silica gel (khoảng 20 gam),
cô đuổi dung môi bằng máy siêu âm, vừa siêu âm vừa khuấy liên tục đến khi thu
được hỗn hợp khô, mịn, lúc này cao chiết đã được tẩm lên bề mặt các hạt silica gel.
Cho mẫu này lên trên đầu cột, cho hệ dung môi chảy qua cột để ổn định bề mặt mẫu
chất, khi hệ dung môi còn cách mặt thoáng mẫu chất 3 cm thì cho tiếp một lớp silica
gel khoảng 2 cm lên trên mặt thoáng của mẫu để bảo vệ cột.
- Tiến hành giải ly cột:
30

Tiến hành giải ly cột với hệ dung môi n-hexan:axeton (95:5, v/v). Hứng dung
môi giải ly bằng cốc thủy tinh nhỏ được đánh số thứ tự và có kí hiệu, mỗi cốc hứng
khoảng 50 mL.
Vừa giải ly cột, vừa theo dõi dung dịch giải ly bằng sắc kí bản mỏng để thu
được các phân đoạn, mỗi phân đoạn gồm những cốc cho kết quả sắc kí bản mỏng
gần giống nhau.
Khi kết quả sắc kí bản mỏng của một vài cốc hiện vết lên thấp hoặc không
còn hiện vết nữa, thì chúng tôi thay đổi hệ dung môi phân cực hơn.
Trong quá trình triển khai SKC chúng tôi tăng dần độ phân cực của hệ dung
môi n-hexan:axeton từ (95:5, v/v) đến (0:100, v/v). Kết hợp với sắc kí bản mỏng để
thu được các phân đoạn.
Bảng 2.2. Kết quả sắc ký cột cao chiết điclometan cây lạc tiên
Phân đoạn Số thứ tự cốc Hệ dung môi giải ly Khối lƣợng cao (g)
LTĐ1 1 0,021
LTĐ2 2-3 0,077
LTĐ3 4-7 0,302
LTĐ4 8-16
n-hexan:axeton = 95:05
0,501
LTĐ5 17-21 0,371
LTĐ6 22-29 0,248
LTĐ7 30-33 0,293
LTĐ8 34-43 0,310
LTĐ9 44-51 0,086
LTĐ10 52-65 0,080
LTĐ11 66-74 0,134
LTĐ12 75-83 0,098
LTĐ13 84-88
0,163
LTĐ14 89-93 0,159
LTĐ15 94-99 0,132
LTĐ16 100-105 0,140
LTĐ17 106-109 0,084
31

LTĐ18 110-119 0,191
LTĐ19 120-123 0,081
LTĐ20 124-125 0,068
LTĐ21 126-128 0,860
LTĐ22 129-140 0,219
LTĐ23 141-142 0,079
LTĐ24 143-144 n-hexan:axeton = 80:20 0,093
LTĐ25 145-150 0,280
LTĐ26 151-153 0,085
LTĐ27 154-160 0,080
LTĐ28 161-164 0,095
LTĐ29 165-166 0,108
LTĐ30 167-181 n-hexan:axeton = 70:30 0,309
LTĐ31 182-187 0,219
LTĐ32 188-200 0,259
LTĐ33 201-207 0,343
LTĐ34 208-218 0,543
LTĐ35 219-227
0,171
LTĐ36 228-246 0,332
LTĐ37 247-298 0,751
LTĐ38 299-412 0,398
LTĐ39 413-425 0,075
LTĐ40 426-439 0,157
LTĐ41 440-445 0,056
LTĐ42 446-462 n-hexan:axeton = 0 : 100 0,098
LTĐ43 463-480 0,084
LTĐ44 481-498 0,134
LTĐ45 499-518 1,425
32

Cao chiết điclometan (14,9 g)
Sắc kí cột n-hexan:axeton
(95:5-0:100, v/v)
LTĐ2
Sắc kí cột n-
hexan:etyl axetat
(99:1-98:2, v/v)
LTĐ8 LTĐ13
Rửa, kết tinh lại Rửa, kết tinh lại
nhiều lần nhiều lần
PED4 PED1 Hỗn hợp PED2, PED3
Sơ đồ 2.3. Phân lập chất từ cao chiết điclometan cây lạc tiên
* Phân lập chất từ phân đoạn LTĐ2:
Phân đoạn LTĐ2 có khối lượng 77 mg được cho vào cốc sạch, hòa tan trong
hỗn hợp n-hexan:etyl axetat, cho thêm silica gel (khoảng 80 mg), cô đuổi dung môi
bằng máy siêu âm, vừa siêu âm vừa khuấy liên tục đến khi thu được bột silica gel
khô, mịn, lúc này mẫu đã được tẩm lên bề mặt các hạt silica gel. Cho mẫu này lên
trên đầu cột, cho hệ dung môi chảy qua cột để ổn định bề mặt mẫu chất, khi hệ dung
môi còn cách mặt thoáng mẫu chất 2 cm thì cho tiếp một lớp silica gel lên trên mặt
thoáng của mẫu.
Sau đó rửa giải cột với hệ dung môi n-hexan:etyl axetat (99:1-98:2, v/v).
Dựa vào SKBM thu được 8 phân đoạn kí hiệu lần lượt là LTĐ2.1-LTĐ2.8
Phân đoạn LTĐ2.1 có khối lượng 54 mg thu được khi giải ly với hệ dung
môi n-hexan:etyl axetat (99:1, v/v). Tiến hành tinh chế phân đoạn này bằng cách kết
tinh lại nhiều lần trong n-hexan thu được 33 mg chất kí hiệu PED4.
PED4: chất bột màu trắng, Rf = 0,428 (n-hexan:điclometan = 10:1, v/v), hiện
màu xanh hơi tím với thuốc thử vanilin/ H2SO4 đặc, hơ nóng.
Phân đoạn LTĐ8 có khối lượng 310 mg được cho vào cốc sạch. Hòa tan hoàn toàn
trong dung môi điclometan, sau đó làm lạnh một thời gian thì thấy có kết tủa trắng.
33

Tách lấy phần chất kết tủa này và tiến hành tinh chế lại nhiều lần trong điclometan
thu được 43 mg chất kí hiệu là PED1.
PED1: chất bột màu trắng, Rf = 0,5 (n-hexan:etyl axetat = 9:1, v/v), hiện
màu hơi vàng với thuốc thử H2SO4 10%, hơ nóng.
Phân đoạn LTĐ13 có khối lượng 163 mg được cho vào cốc sạch. Hòa tan
hoàn toàn hỗn hợp với lượng tối thiểu dung môi axeton, sau đó làm lạnh một thời
gian thì thấy có kết tinh màu trắng, hình kim bám trên thành cốc. Tách lấy chất kết
tinh này và tinh chế lại nhiều lần trong axeton thu được 30 mg chất là hỗn hợp gồm
hai chất kí hiệu lần lượt là PED2 và PED3.
PED2 và PED3: chất kết tinh hình kim, màu trắng, Rf = 0,487 (n-
hexan:axeton = 85:15, v/v), hiện màu hồng với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc, hơ
nóng.
2.3.5.2. Xác định cấu trúc
Các cấu tử phân lập được từ các phân đoạn của cao chiết điclometan cây lạc
tiên được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ: IR, MS, 1
H-NMR,
NMR, DEPT.
34
13C-

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxi hóa của cây lạc tiên ở tỉnh Thừa Thiên Huế.doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxi hóa của cây lạc tiên ở tỉnh Thừa Thiên Huế.doc

Similar to Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxi hóa của cây lạc tiên ở tỉnh Thừa Thiên Huế.doc (17)

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói 🥰🥰 Liên hệ ZALO/TELE: 0917.193.864 ❤❤

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói 🥰🥰 Liên hệ ZALO/TELE: 0917.193.864 ❤❤ (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxi hóa của cây lạc tiên ở tỉnh Thừa Thiên Huế.doc