Nghiên cứu đặc điểm đa hình nucleotide đơn ở hai vùng siêu biến hvs-i và hvs-ii trên d-loop ty thể của một số dân tộc Việt Nam.doc

Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149
Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Nguyễn Doãn Tình
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM ĐA HÌNH NUCLEOTIDE ĐƠN Ở HAI
VÙNG SIÊU BIẾN HVS-I VÀ HVS-II TRÊN D-LOOP TY THỂ
CỦA MỘT SỐ DÂN TỘC VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hà Nội,

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM ĐA HÌNH NUCLEOTIDE ĐƠN Ở
HAI VÙNG SIÊU BIẾN HVS-I VÀ HVS-II TRÊN D-LOOP TY
THỂ CỦA MỘT SỐ DÂN TỘC VIỆT NAM
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hướng dẫn 1: TS. Nguyễn Thùy Dương
Hà Nội,

i
Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác
với các cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần
đã được công bố tại hội nghị khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả;
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả

ii
Lời cảm ơn
Để thực hiện thành công luận văn thạc sĩ này, tôi xin gửi lời cảm ơn
sâu sắc và chân thành đến TS. Nguyễn Thùy Dương (Trưởng phòng Hệ gen
học người - Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam), người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian
tôi thực hiện đề tài. Cô là người đã tạo điều kiện cũng như truyền cho tôi
những kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học.
Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn của mình đến PGS. TS. Nông Văn
Hải (Chủ tịch Hội đồng Khoa học, Viện Nghiên cứu hệ gen), tập thể cán bộ
Phòng Hệ gen học người và các cán bộ Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình
hướng dẫn, trợ giúp tôi thực hiện tốt đề tài nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô thuộc Khoa Công nghệ sinh học,
Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi để hoàn
thành luận văn này.
Luận văn được thực hiện trong khuôn khổ của đề tài “Xây dựng cơ sở dữ
liệu hệ gen biên thể ty thể và nhiễm sắc thể Y của một số dân tộc người Việt
Nam” mã số ĐTĐL.CN-60/19 thuộc Bộ Khoa học và Công nghệ.
Tác giả

iii
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Chữ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng việt
bp Base pair Cặp bazơ
DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic
ddNTP Dideoxynucleoside Dideoxynucleoside
triphosphate triphosphate
dNTP Deoxynucleoside Deoxynucleoside triphosphate
triphosphate
EDTA Ethylene diamine tetra-acetic Axit ethylene diamine tetra-
acid acetic
EtOH Ethanol Etanol
HVS-I Hypervariable segment 1 Đoạn siêu biến 1
HVS-II Hypervariable segment 2 Đoạn siêu biến 2
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase
RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic
RFLP Restriction Fragment Length Đa hình chiều dài đoạn cắt giới
Polymorphism hạn
TAE Tris – acetate – EDTA Tris – acetate – EDTA
SNP Single nucleotide Đa hình nucleotide đơn
polymorphism

iv
Danh mục các bảng
Bảng 2.1. Danh sách mẫu nghiên cứu của mỗi dân tộc Kinh...................................19
Bảng 3.1. Thống kê các đa hình xuất hiện ở 2 vùng trình tự HVS-I và HVS-II
ở 120 mẫu nghiên cứu .....................................................................................................................47
Bảng 3.2. Số lượng các đa hình trung bình phát hiện được trong từng dân tộc
52
Bảng 3.3. Tần suất các đa hình trình tự vùng siêu biến D-loop thuộc hệ gen ty
thể ở ba nhóm cá thể thuộc các tộc người Kinh, Cờ Lao và Phù Lá....................53
Bảng 3.4. Các đa hình có phân bố khác biệt ở các tộc người trong nghiên cứu
54
Bảng 3.5. Khoảng cách di truyền giữa các dân tộc trong nghiên cứu.................56

v
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1.1. Cách thiết lập bản đồ SNP.........................................................................................5
Hình 1.2. Vị trí các gen trên DNA ty thể.................................................................................8
Hình 1.3. Cấu trúc vùng điều khiển (D-loop) DNA ty thể.........................................11
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số 51 mẫu dân tộc Kinh. ..............................26
Hình 3.2. Kết quả điện di DNA tổng số 34 mẫu dân tộc Cờ Lao ..........................26
Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số 35 mẫu dân tộc Phù Lá...........................27
Hình 3.4. Kết quả PCR nhân vùng trình tự HVS-I ở 120 mẫu dân tộc Kinh,
Cờ Lao và Phù Lá..............................................................................................................................28
Hình 3.5. Kết quả PCR nhân vùng trình tự HVS-II ở 120 mẫu dân tộc Kinh,
Cờ Lao và Phù Lá...............................................................................................................................30
Hình 3.6. Kết quả giải trình tự một số mẫu đại diện chứa một số đa hình trên
đoạn HVS-II..........................................................................................................................................31
Hình 3.7. Kết quả so sánh trình tự vùng HVS-II với trình tự chuẩn rCRS của
120 mẫu dân tộc tộc Kinh, Cờ Lao và Phù Lá ..................................................................38
Hình 3.8. Kết quả so sánh trình tự vùng HVS-I với trình tự chuẩn rCRS của
120 mẫu dân tộc tộc Kinh, Cờ Lao và Phù Lá ..................................................................46

vi
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..........................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU................................................2
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐA HÌNH NUCLEOTIDE ĐƠN................................2
1.1.1. Đặc điểm của đa hình nucleotide đơn .............................................2
1.1.2. Tầm quan trọng và ứng dụng của đa hình nucleotide đơn ............... 4
1.1.2.1. Bản đồ SNP ....................................................................................................................... 4
1.1.2.2. Phát triển SNP và y học............................................................................................. 5
1.1.2.3. Phát triển SNP và dược phẩm................................................................................ 6
1.2. HỆ GEN TY THỂ.......................................................................................................................7
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể.............................................. 7
1.2.1.1. Cấu trúc hệ gen ty thể ................................................................................................. 7
1.2.1.2. Đặc điểm di truyền hệ gen ty thể.......................................................................... 9
1.2.2. Đặc điểm vùng điều khiển (D-loop) trên ty thể....................................... 10
1.2.3. Tình hình nghiên cứu hệ gen ty thể trên thế giới và ở Việt Nam12
1.2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới................................................................... 12
1.2.3.2. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể tại Việt Nam ........................................ 13
1.3. ĐẶC ĐIỂM DÂN TỘC HỌC CỦA CÁC DÂN TỘC TRONG NGHIÊN
CỨU...........................................................................................................................................................15
1.3.1. Người Kinh........................................................................................................................ 15
1.3.2. Người Cờ Lao.................................................................................................................. 16
1.3.3. Người Phù Lá.................................................................................................................. 17
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 19
2.1. VẬT TƯ, THIẾT BỊ.................................................................................19
2.1.1. Nguyên vật liệu ................................................................................19
2.1.2. Hóa chất ...........................................................................................18
2.1.3. Thiết bị .............................................................................................19
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................21
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số........................................................................................... 21
2.2.2. Phương pháp điện di kiểm tra trên gel agarose ..................................... 22

vii
2.2.3. Phương pháp khuếch đại 2 vùng siêu biến DNA HVS–I và HVS–II
bằng phản ứng PCR................................................................................................................. 23
2.2.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR........................................................ 24
2.2.5. Phương pháp giải trình tự DNA........................................................................ 25
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu thống kê và so sánh
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................196
3.1. TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ CÁC MẪU MÁU..........................24
3.2. KHUẾCH ĐẠI 2 VÙNG SIÊU BIẾN HVS-I VÀ HVS-II BẰNG PHẢN
ỨNG PCR...............................................................................................................................................27
3.3. XÁC ĐỊNH CÁC ĐA HÌNH THUỘC HAI VÙNG SIÊU BIẾN HVS-I
VÀ HVS-II TRÊN TY THỂ Ở CÁC MẪU NGHIÊN CỨU...................................30
3.4. PHÂN TÍCH THỐNG KÊ SO SÁNH ĐA HÌNH VÀ TÍNH TOÁN
KHOẢNG CÁCH DI TRUYỀN GIỮA 3 DÂN TỘC KINH, CỜ LAO VÀ
PHÙ LÁ...................................................................................................................................................52
KẾT LUẬN ....................................................................................................57
KIẾN NGHỊ...................................................................................................58
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................59
DANH MỤC PHỤ LỤC................................................................................63
PHỤ LỤC.......................................................................................................62

1
MỞ ĐẦU
Ty thể là bào quan đóng vai trò trung tâm trong tổng hợp năng lượng tế
bào. Chúng tham gia chuyển hóa vật chất hữu cơ thành năng lượng nội bào
thông qua quá trình phosphoryl hóa và vận chuyển electron. Ty thể sở hữu hệ
thống vật chất di truyền riêng, tồn tại độc lập với hệ gen nhân dưới dạng DNA
mạch vòng kép. Tuy có kích thước bé (tương đương 0,0005% kích thước hệ
gen nhân) nhưng hệ gen ty thể có những đặc trưng quan trọng, rất thuận lợi
cho nghiên cứu di truyền như di truyền chủ yếu theo dòng mẹ, không hoặc rất
ít xảy ra trao đổi chéo… Ngoài ra, trên DNA ty thể tồn tại 2 đoạn siêu biến
HVS-I và HVS-II với mật độ xuất hiện các đa hình cao. Đây là những khu
vực chứa nhiều điểm đa hình, có trình tự thay đổi theo thời gian và tương đối
khác biệt giữa các nhóm người thuộc các dân tộc và khu vực địa lý khác nhau.
Do đó, chúng được xem là những đối tượng phù hợp và được sử dụng rộng rãi
trong nhiều nghiên cứu nhân chủng học, xác định nguồn gốc và mối quan hệ
giữa các dân tộc [1].
Việt Nam là một quốc gia đa dân tộc với 54 dân tộc anh em cùng chung
sống [2]. Hiện đã có nhiều nghiên cứu về các đặc điểm văn hóa, phong tục tập
quán ở 54 dân tộc được tiến hành. Tuy nhiên, tính đến nay, số lượng những
nghiên cứu dựa trên nền tảng di truyền nhằm xác định nguồn gốc cũng như
mối quan hệ giữa các dân tộc vẫn rất ít ỏi, đặc biệt đối với các dân tộc ít
người [3-5]. Nhận thức rõ tầm quan trọng của vấn đề này, chúng tôi đã tiến
hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm đa hình nucleotide đơn ở hai
vùng siêu biến HVS-I và HVS-II trên D-loop ty thể của một số dân tộc Việt
Nam” với mục đích khai thác nguồn dữ liệu di truyền ty thể ở 3 dân tộc Cờ
Lao, Phù Lá và Kinh đồng thời đánh giá làm rõ sự tương đồng và khác biệt di
truyền giữa 3 dân tộc.
Các mục tiêu chính của nghiên cứu bao gồm:
1. Xác định được các đa hình nucleotide đơn ở 2 vùng siêu biến HVS-I
và HVS-II trên ty thể của các mẫu thuộc 3 dân tộc Kinh, Cờ Lao và Phù Lá.
2. Phân tích đánh giá các đặc điểm đa hình cũng như sự khác biệt di
truyền dựa trên trình tự 2 vùng siêu biến của các mẫu thuộc 3 dân tộc.

2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐA HÌNH NUCLEOTIDE ĐƠN
1.1.1. Đặc điểm của đa hình nucleotide đơn
Đa hình nucleotide đơn hay SNP (“Single Nucleotide Polymorphisms”)
là những biến thể trình tự DNA xảy ra khi một đơn nucleotide (A, T, C, G)
trong trình tự hệ gen bị thay đổi so với các cá thể khác trong cùng loài sinh
học hoặc so với NST còn lại trong cặp NST tương đồng [6]. Ví dụ: SNP
rs4680 (G>A) ở vị trí chr22:19963748 làm thay đổi trình tự DNA từ
GGCGTGAAG thành GGCATGAAG. Xét về nguyên lý, sự phát sinh đa hình
đơn nucleotide hoàn toàn giống với đột biến điểm. Hai loại biến thể này chỉ
khác nhau ở tần suất xuất hiện trong quần thể. Trong khi SNP phải xảy ra
trong ít nhất 1% dân số thì đột biến điểm chỉ xảy ra với tần suất bé hơn 1%
[6].
Trung bình cứ mỗi 1000 nucleotide sẽ xuất hiện 1 SNP, do đó sẽ có
khoảng 4 đến 5 triệu SNP trong mỗi một hệ gen. Tính đến nay, các nhà khoa
học đã thiết lập nhận diện được hơn 100 triệu SNP ở các cá thể thuộc nhiều
dân tộc khác nhau trên thế giới [7].
Hầu hết các đa hình SNP đã được xác định nằm ở các vùng không mã
hóa và xuất hiện ít hơn trong các vùng mã hóa [8]. SNP nằm ở vùng không
mã hóa không làm thay đổi trình tự protein, có thể đóng vai trò là các chỉ thị
di truyền và vật lý quan trọng cho các nghiên cứu so sánh và nhân chủng học
tiến hóa. Trong khi đó, các SNP nằm ở vùng điều hòa có thể ảnh hưởng đến
quá trình ghép nối và tác động đến các yếu tố phiên mã, làm suy thoái RNA
thông tin hoặc trình tự của RNA không mã hóa. Sự biểu hiện gen bị ảnh
hưởng bởi loại SNP này được gọi là eSNP, dẫn đến sự tăng hoặc giảm biểu
hiện gen. Các SNP khác ở vùng mã hóa có thể dẫn đến những thay đổi trong
cấu trúc và chức năng protein. Tùy vào mức độ ảnh hưởng, SNP được phân
thành 2 nhóm đồng nghĩa (không làm thay đổi trình tự chuỗi polypeptide)
hoặc không đồng nghĩa (làm thay đổi trình tự chuỗi polypeptide). Các SNP
không đồng nghĩa bao gồm 2 phân nhóm SNP sai nghĩa (missense) hoặc vô
nghĩa (nonsense). Các SNP sai nghĩa sẽ dẫn đến việc thay thế 1 amino acid

3
trong chuỗi polypeptide. Trong khi đó, SNP vô nghĩa tạo ra stop codon, báo
hiệu tế bào ngưng tổng hợp protein dẫn tới hình thành protein có chức năng
không hoàn chỉnh hoặc không có chức năng. Thực tế chứng minh có tới hơn
một nửa trong số những đột biến bệnh hiện nay có nguồn gốc từ các đa hình
vô nghĩa [9]. Do đó chúng có thể được sử dụng như là các chỉ thị phân tử tiềm
năng trong các nghiên cứu dược lý và di truyền học.
Ngoài ra, dựa vào mức độ ảnh hưởng đến chức năng cơ thể, SNP cũng
được chia thành các nhóm: vô hại (không gây bệnh), có hại (gây các bệnh như
tiểu đường, ung thư, bệnh tim, bệnh Huntington và chứng Haemophilia) và
tiềm tàng (biến thể xảy ra trong vùng mã hóa và vùng điều khiển; không gây
hại trong điều kiện bình thường nhưng khi đáp ứng một số điều kiện cụ thể có
thể làm tăng khả năng phát triển thành bệnh, ví dụ như tính mẫn cảm của ung
thư phổi) [10].
1.1.2. Tầm quan trọng và ứng dụng của đa hình nucleotide đơn
SNP là kiểu đa hình cực kỳ phổ biến, chiếm đến 80% sự biến đổi trong
hệ gen [11]. Mặt khác, chúng cũng tiến hóa ổn định, không thay đổi nhiều từ
thế hệ này sang thế hệ khác. Do đó, SNP rất có giá trị trong các nghiên cứu di
truyền học ở người.
1.1.2.1. Bản đồ SNP
Các nhà khoa học tin rằng việc thiết lập một bản đồ SNP sẽ đem lại
tiềm năng rất lớn, cho phép xác định được các gen liên quan đến các bệnh
phức tạp như ung thư hay tiểu đường. Với mục đích đó, hai nhóm nghiên cứu
gồm Human Genome Project (HGP) và SNP Consortium đã tập trung vào xác
định và thiết lập một bản đồ SNP. Tháng 10 năm 2000, kết quả của cả 2 nhóm
đã được công bố rộng rãi trên thế giới [12, 13]. Thành quả này đã cung cấp
một công cụ mới mẻ, cho phép nghiên cứu hiệu quả đặc tính của các biến thể
trình tự DNA trên hệ gen người. Ngoài ra, bản đồ SNP cũng đã được sử dụng
để mô tả sự đa dạng haplotype trên hệ gen, phục vụ cho các nghiên cứu tiến
hóa. Hiện, rất nhiều cấu trúc haplotype hiện vẫn chưa được khám phá. Bản đồ
này cho phép xác định quy mô, sự biến đổi của các haplotype giống nhau; số

4
lượng, tần số của haplotype phổ biến và sự phân bố của chúng giữa và trong
các nhóm dân tộc hiện có.
Hình 1.1. Cách thiết lập bản đồ SNP: (1) Giải mã bộ gen trên số lượng lớn
người, (2) So sánh bộ gen giữa các cá thể để tìm kiếm SNP, (3) Xây dựng 1
bản đồ chứa các SNP đã tìm thấy
1.1.2.2. Phát triển SNP và y học
Hiện nay nhiều chứng minh cho thấy hầu hết các SNP không chịu trách
nhiệm cho một bệnh, tuy nhiên chúng có thể giúp xác định rằng ai đó có khả
năng phát triển một căn bệnh cụ thể. Một ví dụ rõ ràng về cách SNP ảnh
hưởng đến sự phát triển của bệnh là ảnh hưởng của chúng đến gen
apolipoprotein E hoặc APOE, một trong những gen liên quan với bệnh
Alzheimer [1]. Giống như các rối loạn mãn tính như bệnh tim, tiểu đường,
hoặc ung thư phổ biến nhất, bệnh Alzheimer là một bệnh được gây ra bởi các
biến thể trong một vài gen. Gen APOE chứa đến hai SNP trong ba alen của
nó: E2, E3, E4. Mỗi allele khác nhau bởi một base DNA, và các sản phẩm
protein của mỗi gen sẽ khác bởi một amino axit. Nghiên cứu cho thấy rằng
một người được thừa hưởng ít nhất một E4 allele sẽ có một khả năng lớn để
phát triển bệnh Alzheimer. Rõ ràng, sự thay đổi của một amino acid trong các
protein E4 làm thay đổi cấu trúc và chức năng của protein và tạo điều kiện
cho sự phát triển của bệnh. Còn nếu một người kế thừa allele E2 thì có ít khả
năng phát triển bệnh Alzheimer. Tất nhiên, SNP không phải là chỉ số tuyệt

5
đối của sự phát triển của bệnh. Cụ thể, đối với bệnh Alzheimer nếu một người
được thừa hưởng hai alen E4 sẽ không bao giờ có thể phát triển bệnh, trong
khi một người đã được thừa hưởng hai alen E2 thì có thể [1, 14].
Trong chuẩn đoán bệnh, các SNP còn được sử dụng như các dấu hiệu
sinh học để xác định chính xác một căn bệnh trên bản đồ hệ gen của con
người, bởi chúng thường nằm gần một gen được tìm thấy có liên quan đến
một căn bệnh nào đó. Thỉnh thoảng, một SNP thực sự có thể gây ra một căn
bệnh,và do đó, cũng có thể được sử dụng để tìm kiếm và cô lập các gen gây
bệnh. Cụ thể, để tiến hành nghiên cứu liên hệ giữa SNP và một căn bệnh, các
nhà khoa học sẽ thu thập mẫu máu từ một nhóm các bệnh nhân và phân tích
DNA của họ để cho ra các mẫu SNP. Tiếp theo, các nhà nghiên cứu tiếp tục
phân tích DNA từ một nhóm các cá nhân không bị ảnh hưởng bởi căn bệnh
này và tiến hành so sánh các mẫu thu được. Nhờ các so sánh này (còn gọi là
"association study") các nhà khoa học có thể phát hiện sự khác biệt giữa các
mô hình SNP của hai nhóm, thông qua đó xác định sự liên quan của SNP với
gen gây bệnh. Và cuối cùng, hồ sơ SNP đặc trưng của nhiều loại bệnh khác
nhau sẽ được thành lập. Sau đó, chỉ là vấn đề thời gian, các bác sĩ có thể xác
định một người có thể nhạy cảm với một căn bệnh nào đó chỉ bằng cách phân
tích các mẫu DNA của họ cho mô hình SNP cụ thể.
Ngoài ra các đa hình DNA như SNP cũng rất hữu ích trong việc giúp các
nhà nghiên cứu xác định và hiểu lý do tại sao các cá nhân khác nhau trong khả
năng của mình có thể hấp thụ các loại thuốc nhất định, cũng như xác định lý
do tại sao một cá nhân có thể chịu một tác dụng phụ bất lợi cho một loại thuốc
cụ thể.
Vì vậy, các nghiên cứu về SNP hứa hẹn sẽ mang đến một cuộc cách
mạng lớn trong quá trình phát hiện, phòng ngừa và chữa bệnh.
1.1.2.3. Phát triển SNP và dược phẩm
Thuốc trị bệnh đã được con người sử dụng từ hàng ngàn năm trước. Một
số loại thuốc vẫn được sử dụng cho đến ngày nay như các chế phẩm làm từ
anh túc để giảm đau, tiền thân cho thuốc phiện tổng hợp được sử dụng cho
mục đích tương tự bởi các bác sĩ hiện đại. Ngày nay chúng vẫn được được

6
phát triển liên tục không ngừng, bao gồm các chế phẩm sinh học và tổng hợp
để điều trị các bệnh mới. Tuy nhiên cho đến hiện tại, việc xác định một bệnh
nhân sẽ đáp ứng với một loại thuốc cụ thể hay không vẫn là một vấn đề nan
giải. Cụ thể một loại thuốc được chứng minh có hiệu quả trong các bệnh nhân
“thông thường” nhưng lại không hiệu quả ở một số người khác hoặc tệ hơn
nữa nó có thể đem lại các tác dụng phụ tương đối nặng nề. Do đó các công ty
dược phẩm mới chỉ phát triển các sản phẩm đáp ứng các bệnh nhân "thông
thường" và loại thuốc dành cho số ít bệnh nhân “bất thường” vẫn chưa được
sản xuất.
Như đã đề cập ở trên, các đa hình SNP rất hữu ích cho việc nghiên cứu
sự hấp thu và thanh thải cũng như tác dụng phụ của thuốc. Do đó các nhà
khoa học rất kì vọng, bằng cách phân tích hồ sơ SNP của sẽ tạo ra các loại
thuốc thích hợp cho từng cá nhân và phù hợp với cấu trúc di truyền của riêng
từng người. Nhờ vậy sẽ cho phép các công ty dược phẩm cung ứng nhiều loại
thuốc hơn cho thị trường và giúp các bác sĩ kê toa điều trị một cách hiệu quả.
Các nhà khoa học dự kiến chỉ tính riêng ở Hoa Kỳ, "thuốc cá nhân hoá” sẽ có
khả năng làm giảm khoảng 100.000 trường hợp tử vong và 2 triệu ca nhập
viện do phản ứng phụ với thuốc xảy ra mỗi năm.
1.2 HỆ GEN TY THỂ
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể
1.2.1.1. Cấu trúc hệ gen ty thể
Khác với hệ gen nhân, hệ gene ty thể là một phân tử DNA dạng vòng,
mạch kép, có kích thước nhỏ (khoảng 16569 bp) và không liên kết với protein
histon. Hai sợi của DNA ty thể (mtDNA) được chia thành chuỗi nặng (H) và
nhẹ (L) dựa trên độ nổi của chúng trong trong các gradient celsium clorua .
Chuỗi nặng nằm phía ngoài, rất giàu guanine và có chứa điểm khởi đầu
sao chép OH. Bắt đầu từ điểm này, quá trình sao chép DNA ty thể được tiến
hành tuần tự cho đến điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ (OL), nằm giữa
một cụm gen tRNA. Khi điểm OL nằm ở dạng sợi đơn, quá trình tổng hợp
mtDNA mới bắt đầu theo hướng ngược lại. Ngoài ra, trên phân tử mtDNA
chứa 3 vùng trình tự khởi đầu phiên mã (promoter) khác nhau, bao gồm 2
điểm H1 và H2 trên chuỗi nặng và L trên chuỗi nhẹ.

7
Hình 1.2. Vị trí các gen trên DNA ty thể
Có tổng cộng 37 gene mã hóa nằm trên DNA ty thể, bao gồm: 2 gen mã
hóa rRNA (12S và 16S), 22 gen mã hóa tRNA và 13 gen mã hóa chuỗi
polypeptide (Hình 1.2). Tất cả các chuỗi polypeptide được mã hóa đều là
thành phần của phức hệ hô hấp OXPHOS (Oxidative phosphorylation):
- Bảy gene MTND1, MTND2, MTND3, MTND4L, MTND4, MTND5,
MTND6 mã hóa cho 7 tiểu phần (1, 2, 3, 4L, 4, 5, 6 của phức hệ I (NADH:
ubiquinone oxyoreductase) [15].
- Gen MTCYB mã hóa cho tiểu phần Cytochrome b của phức hệ III
(ubiquinol: cytochrom coxyoreductase) [16].
- Ba gene MT-COI, MT-COII, MT-COIII mã hóa cho 3 chuỗi
polypeptide Cytochrom c oxyase I, II, III của phức hợp IV (cytochrom c
oxyase).
- Hai gene MT-ATP6, MT-ATP8 mã hóa cho 2 tiểu phần (ATP
synthase Fo tiểu phần 6 và 8) của phức hợp V (ATP synthase).
Các gen DNA ty thể không chứa intron và có rất ít các đoạn intergenic
(đoạn trình tự nằm giữa các gen). Ngoài ra, ở DNA ty thể còn có hiện tượng
các gen nằm gối lên nhau (overlapping genes), tương tự như ở một số virus.

8
Một số các gen kết thúc bằng T hoặc TA mà không có một codon kết thúc
đúng nghĩa. Ở các gen này, codon kết thúc chỉ được hình thành sau quá trình
polyadenyl hóa của các mRNA tương ứng.
Các gen mã hóa tRNA trên ty thể thường nằm giữa mỗi hai gen mã hóa
rRNA hoặc protein, thuận lợi cho quá trình xử lý RNA sau đó. Chỉ có 22 loại
tRNA (tất cả được mã hóa trong mtDNA) tham gia vào quá trình tổng hợp
protein của ty thể, ít hơn nhiều so với ở tế bào chất (từ 31-61 loại khác nhau).
Ngoài ra, so với các tRNA tương ứng trong tế bào chất, cấu trúc của tRNA
này có những sai khác nhất định. Ví dụ, phân tử tRNASer(AGY)
trong ty thể
thiếu hoàn toàn một cánh so với tế bào chất.
Ngoài ra, so với hệ gen nhân, mã di truyền ty thể cũng có những khác
biệt. Cụ thể, mã di truyền trên DNA ty thể chỉ sử dụng 2 codon mở đầu
‘AUA’ và ‘AUU’ và 2 codon kết thúc 'AGA' và 'AGG', trong khi DNA nhân
sử dụng 1 codon mở đầu AUG và 3 codon kết thúc 'UAA', 'UGA' và 'UAG'.
Một số các codon cũng mã hóa những acid amin khác nhau như AUA mã hóa
cho isoleucin ở nhân nhưng lại xác định methionin ở ty thể.
1.2.1.2. Đặc điểm di truyền hệ gen ty thể
Mặc dù có kích thước rất nhỏ (chỉ bằng 0,0005% kích thước bộ gene
trong nhân) nhưng hệ gen ty thể có nhiều đặc điểm quan trọng, thuận lợi cho
nghiên cứu di truyền quần thể và lịch sử tiến hóa.
Đầu tiên, DNA ty thể có đặc tính di truyền theo dòng mẹ, chỉ được
truyền từ mẹ sang con [17]. Điều này có thể được giải thích bởi ty thể trong
tinh trùng sớm biến mất trong phôi bởi sự phá hủy có chọn lọc, sự bất hoạt,
hoặc đơn giản bởi số lượng áp đảo của ty thể của noãn. Như vậy, mtDNA sẽ
được kế thừa theo một dòng duy nhất, không có sự tái tổ hợp. Điều này cho
phép loại bỏ các ảnh hưởng gây nhiễu, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình
nghiên cứu lịch sử di truyền theo mẫu hệ.
Các đột biến trên DNA ty thể cũng được xác định xảy ra với tốc độ
nhanh hơn 5 đến 10 lần so với DNA nhân, khoảng 2% đến 4% trong một triệu
năm [18]. Tốc độ đột biến này có thể do sự thiếu sót các cơ chế sửa chữa các
sai hỏng DNA như ở nhân của ty thể. Mặt khác, ty thể cũng là nơi diễn ra

9
nhiều quá trình oxy hóa và do đó sản sinh ra nhiều chất oxy hóa mạnh như
các gốc tự do, gây tác động và phát sinh các đột biến đến ở hệ gen ty thể.
Ngoài ra, trong tế bào cũng có thể chứa hàng trăm đến hàng ngàn ty
thể. Do đó, số lượng các phân tử mtDNA trong 1 tế bào lớn gấp nhiều lần so
với DNA nhân [19]. Mặt khác, DNA ty thể có kích thước bé, tồn tại ở dạng
mạch vòng nên rất bền theo thời gian. Hai đặc điểm làm cho việc phân tích
DNA ty thể đặc biệt có ý nghĩa trong việc phân tích các mẫu sinh phẩm cổ
hoặc đã xuống cấp,
1.2.2. Đặc điểm vùng điều khiển (D-loop) trên ty thể
Vùng điều khiển D-loop có kích thước 1121 bp, nằm từ vị trí 16024-
16569/0-576 và nằm giữa hai gene tRNA vận chuyển cho Phenyanalin và
Prolin, chiếm 7% tổng lượng DNA ty thể (Hình 1.3). Vùng này chứa các trình
tự khởi đầu cho quá trình tái bản DNA ty thể và chứa các đoạn điều khiển cho
quá trình phiên mã của các gen chức năng trong vùng được mã hóa .
Vùng D-Loop ty thể được đặc trưng bởi tỉ lệ xuất hiện các đa hình cao
hơn hẳn so với các khu vực khác trên DNA ty thể (khoảng 10 lần) [20, 21].
Điều này có thể được giải thích do các đột biến nằm ở các vùng mã hóa
thường chịu ảnh hưởng mạnh của quy luật chọn lọc tự nhiên. Trong khi đó,
vùng D-Loop ty thể là vùng không mã hóa, chỉ chịu trách nhiệm điều khiển
quá trình tái bản và phiên mã DNA và do đó tích lũy nhiều đột biến hơn. Tuy
nhiên, các đột biến này này phân bố không đồng đều trên khắp D-loop và chỉ
tập trung chủ yếu ở 2 vùng siêu biến HVS-I (có kích thước 359 bp, nằm ở vị
trí 16024 –16365) và HVS-II (kích thước 325 bp, nằm ở vị trí 57 –372) [22].
Hai vùng siêu biến này đã được Greenberg và các cộng sự xác định lần đầu
tiên vào năm 1983 [23]. Ngoài ra, trên ty thể còn xuất hiện một vùng siêu biến
khác, được gọi là HVS-III với tổng chiều dài 137 bp (438 - 574), chứa nhiều
các đoạn trình tự lặp lại 2 nucleotide CA [19].

10
Hình 1.3. Cấu trúc vùng điều khiển (D-loop) DNA ty thể. CSB domain
(Conserved Sequences Block domain): vùng các khối trình tự bảo thủ liên
quan đến quá trình khởi đầu sao chép và phiên mã; Central conserved domain:
Vùng trung tâm; ETAS domain (Extended Termination-associated Sequences
domain): vùng trình tự liên quan đến kết thúc sao chép.
Cho đến nay, đã có nhiều trình tự hoàn chỉnh vùng D-loop của các dân
tộc trên thế giới được công bố trong ngân hàng dữ liệu gen quốc tế về DNA ty
thể [24]. Tổng cộng đã có hơn vài nghìn trình tự vùng D-loop được công bố -
trong đó có 349 trình tự hoàn chỉnh của hệ gen ty thể người thuộc các chủng
tộc khác nhau được nghiên cứu và đăng ký [23]. Số lượng các trình tự D-loop
cũng như toàn bộ hệ gen ty thể của các cá thể người thuộc các dân tộc khác
nhau trên thế giới được giải mã vẫn tăng lên không ngừng. Tuy nhiên với tần
số đột biến cao, nhiều điểm đa hình nên hai vùng siêu biến HVS-I và HVS-II
trên DNA ty thể vẫn được tập trung nghiên cứu nhiều hơn, đặc biệt đối với
HVS-I. Các đa hình trên 2 khu vực này được sử dụng trong nghiên cứu với
các bệnh di truyền, ung thư hoặc các hội chứng bất thường về cơ, thần kinh...
Chúng cũng được sử dụng để xác định cá thể và quan hệ huyết thống, trong
giám định hài cốt liệt sỹ, giám định pháp y, điều tra tội phạm... Ngoài ra, các
đa hình trên mtDNA cũng được sử dụng trong các nghiên cứu nhân chủng học
tiến hóa. Bằng cách sử dụng kết hợp 2 nguồn dữ liệu mtDNA (đặc trưng theo
mẫu hệ) và MSY (đặc trưng cho phụ hệ), các nhà khoa học đã mở ra một bức
tranh tổng thể về lịch sử tiến hóa của loài người cũng như mối liên hệ giữa
các dân tộc trên toàn thế giới.

11
1.2.3. Tình hình nghiên cứu hệ gen ty thể trên thế giới và ở Việt
Nam
1.2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay, phân tích biến thể hệ gen ty thể được sử dụng rộng rãi để
nghiên cứu quan hệ tiến hóa của các cá nhân và quần thể, cả trong phạm vi và
giữa các loài. Các nghiên cứu nhân chủng học tiến hóa gần đây về hệ gen ty
thể tập trung chủ yếu vào các nhóm đơn bội (haplogroup) ty thể, được xác
định dựa trên các nhóm đa hình mtDNA đặc trưng. Dựa trên việc phân loại và
sắp xếp các nhóm haplogroup, cây phả hệ tiến hóa và con đường di cư theo
DNA ty thể của các nhóm người sẽ được định hình. Cụ thể, nghiên cứu nhân
chủng học phân tử của Li và Durbin năm 2011 cho thấy, người hiện đại bắt
đầu xuất hiện ở châu Phi cách đây khoảng 200.000 năm (Hình 1.4) [25].
Nghiên cứu hoàn chỉnh trình tự hệ gen ty thể đã hỗ trợ cho việc xác
định lịch sử nhân chủng học tiến hóa của loài người ở các châu lục trên thế
giới. Người châu Phi đặc trưng bởi Macro-haplogroup L và 7 haplogroup (L0,
L1, L2, L3, L4, L5 và L6) phân bố khắp các lục địa châu Phi. Khoảng 85.000
năm trước, haplogroup L3 di cư ra khỏi vùng Đông Phi tới các lục địa châu Á
và châu Âu, các vùng rất đa dạng về môi trường, các dân tộc, các nền văn hóa
và ngôn ngữ. Hai dòng ADN ty thể M và N xuất hiện từ L3 là tổ tiên của tất
cả các dòng ADN ty thể trên lục địa Á, Âu. Các haplogroup phát sinh từ
Macro-haplogroup M xuất hiện tại các lục địa Ấn Độ và Đông Nam Á, điều
này chứng tỏ đã có một quá trình thực dân hóa rất nhanh dọc theo bờ biển
phía nam châu Á vào khoảng 60.000 năm trước [26, 27]. Một sự mở rộng
khác của Macro-haplogroup M theo hướng Bắc châu Á vào khoảng 45.000
năm trước đã tạo ra hơn 30 haplogroup khác. Với quần thể người châu Âu,
haplogroup L3 và Macro-haplogroup N tạo nên 9 Macro-haplogroup (H, I, J,
K, T, U, V, W và X), xuất hiện phổ biến rộng khắp châu lục cách đây khoảng
45.000 năm [27].Trong khi với người châu Mỹ, các nghiên cứu nhân chủng
học phân tử chỉ ra họ là con cháu của người châu Á, đặc trưng bởi các Macro-
haplogroup: A, B, C, D và X vào khoảng 18.000 năm trước [28].

12
Hình 1.4. Sơ đồ mô tả quá trình di cư của các nhóm đơn bội DNA ty thể
người [29]
Tại châu Á, Đông Nam Á là vùng rất đa dạng về môi trường, các dân
tộc, các nền văn hóa và ngôn ngữ. Các nhà khoa học hiện đang tập trung
nghiên cứu về một sô vấn đề như: các dân tộc cư trú ban đầu ở khu vực Đông
Á, hướng di cư giữa Đông Nam Á và Bắc Á, các mối quan hệ di truyền của
Đông Á, và tác động di truyền của thực tiễn xã hội khác nhau trên dân cư
Đông Á. Những hiểu biết bắt nguồn từ ADN ty thể và/hoặc dữ liệu nhiễm sắc
thể Y, nghiên cứu các SNP hoặc nhiều locus dữ liệu trong tái sắp xếp toàn bộ
gen, kết hợp với việc sử dụng các mô phỏng, phương pháp dựa trên mô hình
để suy ra các thông số về nhân chủng học chắc chắn sẽ cung cấp thêm vào
lịch sử dân số của khu vực Đông Á [28, 30].
1.2.3.2. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể tại Việt Nam
Trước năm 2003, các nghiên cứu về DNA ty thể nói chung và trình tự
vùng D-Loop nói riêng của các dân tộc Việt còn rất ít ỏi. Năm 1999, bằng
phương pháp PCR –RFLP và lai phân tử, nhóm các nhà khoa học Pháp kết
hợp với trường Đại học Y Hà Nội lần đầu tiên tiến hành nghiên cứu về sự đa
hình DNA ty thể của 50 cá thể người Kinh sống tại Hà Nội [31]. Các tác giả
đưa ra kết luận ủng hộ giả thuyết cho rằng người Kinh có nguồn gốc kép từ
Trung Quốc và các nhóm quần thể Thái –Indonesia [31]. Tiếp đó, nghiên cứu

13
đầu tiên về đoạn HVS-I thuộc vùng D-loop ty thể của 35 cá thể người Việt
định cư tại Mỹ đã được Oota công bố vào năm 2002 [32]. Đây là nghiên cứu
nằm trong nghiên cứu đánh giá về di truyền quần thể của người Châu Á. Các
nghiên cứu này đều sử dụng phương pháp PCR –RFLP để phân tích do đó các
kết quả thu được vẫn còn rất nhiều hạn chế.
Từ năm 2004 trở lại đây, số lượng các nghiên cứu về đa hình vùng D-
loop ty thể ở các dân tộc Việt đã tăng lên đáng kể. Năm 2005, Huỳnh Thị Thu
Huệ đã công bố công trình đầu tiên phân tích trình tự vùng D-loop của 5 cá
thể người Việt Nam thuộc 3 dân tộc Kinh, Tày và H’Mông [33]. Năm 2008,
Nguyễn Đăng Tôn và các đồng tác giả đã phát hiện 73 đa hình mới xuất hiện
khi nghiên cứu khảo sát tần số các nhóm đơn bội (haplogroup) ty thể ở 78
mẫu nghiên cứu các cá thể thuộc 3 dân tộc Kinh, Tày và Mường [4]. Năm
2016, Đỗ Mạnh Hưng đã phát hiện được 79 nhóm đơn bội khi phân tích trình
tự đoạn HVS-II của 169 cá thể người Việt Nam thuộc 3 dân tộc Kinh, Mường,
Jarai và Ê đê [34]. Đến năm 2017, nhóm nghiên cứu của Trần Thị Thúy Hằng
cũng đã giải trình tự đoạn HVS-I và HVS-II của 100 cá thể thuộc hai dân tộc
Kinh và Mường và phát hiện được 12 điểm đa hình phổ biến ở cả hai dân tộc
này [3]. Cùng năm, một nghiên cứu khác về đa hình vùng D-loop của 622 cá
thể người Việt Nam thuộc 6 dân tộc (Kinh, Tày, Nùng, Mông, Khơ me và
Thái) đã phát hiện rất nhiều điểm tương đồng giữa hệ gen ty thể người Việt
với các dân tộc láng giềng [35]. Gần đây nhất, năm 2019 nhóm nghiên cứu
của tiến sĩ Nguyễn Thùy Dương đã tiến hành giải trình tự toàn bộ mtDNA của
tổng cộng 609 cá thể thuộc 17 dân tộc thuộc 5 nhóm ngữ hệ ở Việt Nam bằng
phương pháp giải trình tự thế hệ mới NGS [36]. Nghiên cứu này đã chỉ ra sự
phức tạp của hệ gen DNA ty thể ở Việt Nam, xác định được tổng cộng 111
dòng đơn bội mtDNA mới ở Việt Nam. Đồng thời xác định được, sự phân hóa
các nhóm đơn bội DNA ty thể đặc trưng của Việt Nam (đạt đỉnh vào khoảng
2,5-3 kya) có thể liên quan đến sự mở rộng văn minh lúa nước của nền văn
hoá Đông Sơn đặc trưng của người Việt [36].
Có thể thấy, mặc dù số lượng các nghiên cứu về DNA ty thể nói chung
và vùng D-Loop nói riêng ở Việt Nam đã có sự tăng lên nhưng vẫn chưa đáng
kể. Các nghiên cứu này phần lớn được thực hiện với cỡ mẫu nhỏ và trên một

14
số lượng dân tộc hạn chế. Do đó, cần có nhiều hơn các nghiên cứu với cỡ mẫu
lớn hơn và trên một nhóm đa dạng các dân tộc hơn nhằm bổ sung đầy đủ
nguồn dữ liệu di truyền cho cộng đồng các dân tộc Việt Nam.
1.3. ĐẶC ĐIỂM DÂN TỘC HỌC CỦA CÁC DÂN TỘC TRONG NGHIÊN
CỨU
1.3.1. Người Kinh
Người Kinh là cộng đồng dân tộc hình thành tại khu vực địa lý mà ngày
nay là miền Bắc Việt Nam và miền Nam Trung Quốc. Dân tộc Kinh chiếm đa
số ở Việt Nam (khoảng 86,2% dân số), sử dụng ngôn ngữ chính là tiếng Việt
(thuộc nhóm ngữ hệ Việt-Mường).
Người Kinh sinh sống trên khắp lãnh thổ Việt Nam và nhiều nước khác
như Mỹ, Úc…, tập trung đông nhất tại các vùng đồng bằng và thành thị trong
nước. Trước đây, người Kinh sống chủ yếu bằng nghề trồng lúa nước. Lịch sử
đã ghi lại nhiều hệ thống đê điều, kênh rạch phục vụ cho nông nghiệp. Ngoài
ra, người Việt còn có nhiều ngành nghề khác như làm vườn, trồng dâu nuôi
tằm, dệt vải, chăn nuôi. Dân cư ở khu vực duyên hải hoặc các khu vực nhiều
sông ngòi còn có thêm nghề đánh bắt và nuôi trồng thủy hải sản.
Người Kinh sống theo hình thức cộng đồng, quần tụ trong các làng xã.
Mỗi làng xã lại có những nét sinh hoạt cộng đồng riêng. Trong hôn nhân và
gia đình, người đàn ông được coi là người chủ gia đình, là trụ cột quan trọng
nhất. Người Kinh đặt tên con theo họ cha. Văn hóa của người Kinh rất đa
dạng. Mỗi vùng có những nét đặc trưng riêng nhưng vẫn có những điểm
chung nhất định mang đậm bản sắc của dân tộc. Về nguồn gốc của dân tộc,
người Kinh cho rằng họ là con cháu của Lạc Long Quân và Âu Cơ trong
truyền thuyết. Theo đó, hai người lấy nhau và sinh ra một bọc 100 trứng và nở
thành 100 người con. Những người con sinh ra cùng một bọc gọi là "cùng
bọc" (hay còn gọi là Đồng bào) và "đồng bào" là cách gọi của người Việt để
nói rằng tất cả người Việt Nam đều cùng có chung một nguồn gốc.
Hiện nay, dưới góc nhìn khoa học, có hai luồng quan điểm về nguồn
gốc người Việt. Một số nhà khoa học tin rằng những người Việt đầu tiên dịch
chuyển từ quần đảo Indonesia thông qua bán đảo Mã Lai và Thái Lan cho đến

15
khi họ định cư trên vùng sông Hồng ở Đồng bằng Bắc Bộ [37] bằng cách lần
theo con đường của các công cụ đá từ cuối Thế Pleistocen (600,000-12,000
trước Công nguyên) trên bán đảo Java, Malaysia, Thái Lan và phía bắc Miến
Điện. Những công cụ bằng đá được cho là các công cụ con người đầu tiên
được sử dụng trong khu vực Đông Nam Á. Các nhà khảo cổ tin rằng vào thời
điểm này dãy Himalaya - một dãy núi ở miền bắc Miến Điện và Trung Quốc,
tạo ra một rào cản cô lập người dân Đông Nam Á. Các nhà khoa học khác cho
rằng người Việt đầu tiên vốn là một bộ tộc gốc Mông Cổ ở Tây Tạng, di cư
xuống phía nam từ thời đồ đá cũ [38]. Nhóm dân tộc này định cư tại vùng Bắc
Bộ, thượng nguồn sông Hồng ngày nay và tạo nên nền văn minh Đông Sơn.
Nhóm bộ tộc này cũng có sự tương đồng rất lớn về nhân chủng, văn hóa với
các tộc người ở phía Nam Trung Quốc - mà sử Trung Quốc còn gọi là cộng
đồng Bách Việt.
1.3.2. Người Cờ Lao
Dân tộc Cờ Lao là một trong 4 dân tộc sử dụng ngôn ngữ Ka – Đai,
thuộc nhóm ngữ hệ Thái – Kađai ở Việt Nam. Người Cờ Lao định cư ở Hà
Giang từ thế kỷ 18 và được gọi bằng các tên khác nhau như: Tứ Đứ, Ho Ki,
Voa Đề. Dân tộc này được chia làm 3 nhóm chính: Cờ Lao Trắng, Cờ Lao
Xanh và Cờ Lao Đỏ, với tổng dân số hơn 2.600 người (năm 2009).
Người Cờ Lao cư trú ở vùng núi đá chủ yếu làm nương, canh tác theo
kiểu "thổ canh hốc đá". Những người sống ở các vùng núi đất canh tác ruộng
bậc thang, với lúa là cây lương thực chính. Người Cờ Lao có nhiều nghề thủ
công như đan lát, làm đồ gỗ; nhiều bản có thợ rèn làm và sửa chữa nông cụ.
Trang phục phụ nữ được xem là điểm dễ nhận biết về dân tộc Cờ Lao. Phụ nữ
Cờ Lao mặc áo cùng loại với áo người Nùng, Giáy nhưng dài quá gối. Áo
được trang trí bằng những miếng vải đáp trên hò áo, ngực, tay áo. Trước đây,
người Cờ Lao Trắng, Cờ Lao Xanh còn mặc thêm chiếc áo ngắn tay ra ngoài
áo dài để phô những miếng vải mầu đắp trên tay áo trong, chân cuốn xà cạp..
Các bản của người Cờ Lao thường có khoảng từ 15 đến 20 gia đình,
theo truyền thống phụ hệ. Nhà của người Cờ Lao thường là nhà ba gian hai
chái, mái được lợp bằng cỏ gianh hoặc vầu, nứa. Kiểu nhà của người Cờ Lao
Ðỏ tương tự kiểu nhà của người Pu Péo, có tường nhà bằng đất sét đập mịn.

16
Trong hôn nhân của người Cờ Lao, con của chị/em gái được phép lấy
con của anh/em trai. Người Cờ Lao thờ Tổ tiên 3-4 đời. Trong đời sống tâm
linh người Cờ Lao có nhiều nghi lễ như: lễ đặt tên, lễ trưởng thành, lễ cưới, lễ
tang. Văn hóa của người Cờ Lao tiếp thu nhiều yếu tố văn hóa của người
Hmông và người Dao cộng cư.
1.3.3. Người Phù Lá
Ngôn ngữ Phù Lá thuộc nhóm Tạng – Miến (ngữ hệ Hán – Tạng). Ở
Việt Nam, dân tộc Phù Lá có gần 11.000 người (năm 2009), phân bố ở 4 tỉnh:
Hà Giang, Lào Cai, Yên Bái và Lai Châu. Trong đó, nhóm Phù Lá cư trú ở tả
ngạn sông Hồng, còn nhóm Xá Phó (Lao Va Xơ, Bồ Khô Pạ) ở hữu ngạn. Tổ
tiên của họ từ Nam Trung Quốc đến Việt Nam vào khoảng 300 - 400 năm
trước. Ngoài ra một bộ phận (Phù Lá Hán) mới tới trong những năm 40 của
thế kỷ 20.
Người Xá Phó thường ở nhà sàn. Người nhóm Phù Lá ở nhà trệt, kiểu
nhà hai mái, tường trình. Y phục nữ đặc sắc và có sự khác nhau giữa hai
nhóm. Phụ nữ Xá Phó mặc váy dài, xòe rộng, có 4 mảng hoa văn phân bố từ
trên xuống; thắt lưng vải nhuộm chàm, thêu chỉ đỏ ; áo ngắn, mặc chui đầu,
cổ vuông, thêu nhiều hoa văn và đính hạt thực vật; trên đầu vấn khăn dài hoặc
khăn vuông thêu hoa văn. Phụ nữ nhóm Phù Lá mặc quần "chân què - lá tọa";
áo ngắn có chiết eo, cài cúc ở bên nách phải, thân sau và ống tay ghép vải
màu để trang trí; đeo tạp dề hình lưỡi rìu ở trước ngực...
Trước thập niên 60 của thế kỷ 20, người Xá Phó chỉ làm nương du
canh, theo lối phát, đốt, chọc lỗ tra hạt; còn ở vùng người Phù Lá đã phổ biến
loại nương định canh, họ dùng cuốc và cày trong canh tác. Tùy nơi, ngô hay
lúa là cây lương thực chủ đạo, bên cạnh đó còn có sắn, kê, ý dĩ, khoai sọ...
Người Xá Phó và Phù Lá đều theo chế độ phụ hệ, coi trọng thờ cúng tổ
tiên. Trên cơ sở tín ngưỡng vạn vật hữu linh, họ thực hành nhiều nghi lễ nông
nghiệp, để cầu mùa màng tốt tươi, vật nuôi phát triển, người khỏe mạnh.
Nhóm Phù Lá tiếp thu ảnh hưởng của Đạo giáo.

17
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT TƯ, THIẾT BỊ
2.1.1. Nguyên vật liệu
Đối tượng của nghiên cứu là 120 mẫu máu nam giới khỏe mạnh được
lấy ở 3 dân tộc cư trú tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam, bao gồm 51 mẫu dân
tộc Kinh, 34 mẫu Cờ Lao và 35 mẫu Phù Lá (Bảng 2.1). Các nam giới được
lựa chọn phải có có ông bà nội ngoại thuộc cùng một dân tộc.
Sau khi được cung cấp thông tin và giải thích về nội dung nghiên cứu,
các đối tượng cho mẫu sẽ điền các thông tin xác nhận vào “Phiếu đồng ý tự
nguyện tham gia nghiên cứu”. Chỉ khi có chữ ký xác nhận của người cho mẫu
hoặc người được uỷ quyền, việc lấy mẫu mới được phép tiến hành.
Bảng 2.1. Danh sách mẫu nghiên cứu của mỗi dân tộc Kinh
Dân Khu vực Mã số mẫu Tổng
tộc lấy mẫu số
Kinh Hà Nội Kinh01, Kinh02, Kinh03, Kinh04, Kinh05, 51
(Ngôn Kinh06, Kinh07, Kinh08, Kinh09, Kinh10,
Kinh11, Kinh12, Kinh13, Kinh14, Kinh15,
ngữ:
Việt –
Mường)
Kinh51
Cờ Lao Hà Giang CoLao01, CoLao02, CoLao03, CoLao04, 34
(Ngôn CoLao05, CoLao06, CoLao07, CoLao08,
CoLao09, CoLao10, CoLao11, CoLao12,
ngữ:
Tày –

18
Thái) CoLao17, CoLao18, CoLao19, CoLao20,
CoLao33, CoLao34
Phù Lá Hà Giang PhuLa01, PhuLa02, PhuLa03, PhuLa04, 35
(Ngôn PhuLa05, PhuLa06, PhuLa07, PhuLa08,
ngữ: PhuLa09, PhuLa10, PhuLa11, PhuLa12,
Hán – PhuLa13, PhuLa14, PhuLa15, PhuLa16,
Tạng) PhuLa17, PhuLa18, PhuLa19, PhuLa20,
PhuLa21, PhuLa22, PhuLa23, PhuLa24,
PhuLa33, PhuLa34, PhuLa35
Tổng số mẫu nghiên cứu 120
Vấn đề đạo đức trong Nghiên cứu Y sinh học:
Công trình này đã được Hội đồng đạo đức trong Nghiên cứu Y sinh học của
Viện Nghiên cứu hệ gen thông qua và đồng ý cho phép tiến hành lấy mẫu,
nghiên cứu trên người theo quyết định số 4-2015/NCHG-HDDD.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng cho nghiên cứu bao gồm:
- H2O, Ethanol, ATP, dNTPs,
- Các loại buffer như AL, AW1,AW2, AE, Buffer Tango, Thermopol
buffer, Herculase Buffer , T4 DNA ligase buffer…
- Primer
- Các enzyme như proteinase K, T4 polynucleotide kinase, T4 DNA
polymerase, T4 DNA ligase, Bst polymerase, Herculase Pol…
- Các dung dịch TE, dung dịch SureSect Binding, Bead “Dynabeads
MyOne Streptavidin T1”, SureSelect Wash 2, SureSelect Wash, EBT…
- Hạt bead SPRT

19
- Adapter…
- Bộ Kit DNeasy Blood & Tissue (QUIAGEN)
- Kit “DNF-474 High Sensitivity NGS Fragment Analysis”
2.1.3. Thiết bị
Nghiên cứu sử dụng các thiết bị tại Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, bao gồm: tủ lạnh sâu, bể ổn nhiệt,
máy voltex, hệ thống điện di Mupid- exu, máy chụp ảnh GEL-DOC, máy ly
tâm Eppendorf 5424R, máy GeneAmp PCR System 9700 (ABI, Mỹ), máy
giải trình tự tự động ABI PRISM 3500.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách chiết từ mẫu máu đông lạnh, sử dụng Kit
GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification (Thermo Fisher Scientific
Inc., Vilnius, Lithuania). Các bước thực hiện bao gồm:
- Mẫu máu lưu trữ ở -20o
C được lấy ra và để vào tủ ấm 37 o
C cho đến
khi máu tan hoàn toàn.
- Thêm 20 µl Proteinase K vào 200 µl máu, mix đều bằng vortex. Thêm
400 µl dung dịch Lysis, tiếp tục mix đều dung dịch bằng vortex hoặc pipet.
- Ủ mẫu ở 56o
C trong 30 phút và thỉnh thoảng vortex hoặc sử dụng bể lắc
đến dung dịch mẫu tan hoàn toàn.
- Thêm 200 µl ethanol (96-100%) và mix đều bằng pipet.
- Chuyển dung dịch mẫu vào cột ly tâm. Ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút
trong vòng 1 phút.
Loại bỏ dịch sau khi ly tâm. Chuyển cột vào một ống 2ml mới.
- Thêm 500 µl Wash Buffer I (đã thêm ethanol). Ly tâm 10.000
vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch sau khi ly tâm.
- Thêm 500 µl Wash Buffer II vào cột. Ly tâm ở tốc độ tối đa trong 3
phút (12.000 – 14.000 vòng/phút). Loại bỏ dịch sau khi ly tâm. Chuyển cột
vào ống 1,5ml mới.

20
- Thêm 200µl Elution Buffer. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút và ly tâm
10.000 vòng/phút trong 1 phút.
- Bỏ cột. Thu dung dịch DNA.
Các mẫu DNA sau đó được tiến hành điện di kiểm tra chất lượng trên
gel agarose 1% và bảo quản ở -20o
C.
2.2.2. Phương pháp điện di kiểm tra trên gel agarose
Phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các axit nucleic.
ADN là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt (ở độ pH ~7),
nên khi chịu tác động của một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp
chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường.
- 0,8g agarose được hòa trong 100ml TAE 1X, hỗn hợp được đun sôi
trong lò vi sóng cho tan hoàn toàn. Hỗn hợp được làm nguội đến nhiệt độ
khoảng 50 o
C được đổ vào khuôn có đặt sẵn răng lược thích hợp. Thạch được
đông và ổn định trong vòng 1 giờ. Sau đó, răng lược được bỏ ra và gel được
đặt vào hộp điện di. Đệm TAE 1X được đổ sao cho mức đệm cao hơn mặt gel
từ 1 - 2mm;
- Một lượng mẫu thích hợp được trộn với đệm tra mẫu (glycerol 20%;
Tris-Cl 0,1M pH 8; EDTA 0,01M pH 8; bromophenol blue 0,25%). Mẫu được
hút và chuyển vào giếng điện di với điều kiện dòng điện một chiều có hiệu
điện thế 100V, dòng 60 - 80mA, trong thời gian khoảng 30 phút;
- Gel được nhuộm bằng ethidium bromide 10 g/ml trong khoảng 10 phút
trên máy lắc, sau đó mẫu được rửa sạch;
Kết quả được quan sát và chụp ảnh trên máy GEL - DOC.
2.2.3. Phương pháp khuếch đại 2 vùng siêu biến DNA HVS–I và
HVS–II bằng phản ứng PCR
Hai vùng siêu biến trên ty thể HVS–I và HVS–II được khuếch đại bằng
phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) sử dụng 2
cặp mồi đặc hiệu:
HVSI-F: 5’- CTC CAC CAT TAG CAC CCA AAG C -3’
HVSI-R: 5’- CCT GAA GTA GGA ACC AGA TG -3’

21
HVSII-F: 5’- GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C -3’
HVSII-R: 5’- CTG TTA AAA GTG CAT ACC GCC A -3
Thành phần của phản ứng PCR bao gồm: 3µl buffer PCR 10X; 1,5 µl
dNTP 2,5mM; 0,45 µl mồi xuôi và ngược (10pmol); 0,15 µl Taq polymerase;
6 µl tDNA (và H2O, tổng thể tích 30µl. Chu trình nhiệt của phản ứng: 95o
C/5
phút, 95o
C/30 giây, 58o
C/30 giây, 72o
C/30 giây, 72o
C/5 phút (40 chu kì).
2.2.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR nhân 2 vùng gen được tinh sạch bằng kit GeneJET PCR
Purification của Thermo Fisher nhằm loại bỏ mồi, dNTPs và các thành phần
dư thừa khác. Các bước thực hiện bao gồm:
Bước 1: Chuyển toàn bộ thể tích sản phẩm PCR sang ống eppendorf 1,5
ml. Bổ sung Binding Buffer với tỉ lệ thể tích 1:1. Mix đều bằng pipet.
Chú thích: kiểm tra màu của dung dịch. Màu vàng biểu thị độ pH tối ưu
cho DNA. Nếu màu của dung dịch là màu cam hoặc tím, thêm 10 µl dung
dịch natri axetat 3 M, dung dịch pH 5,2 và mix đều.
Bước 2: Chuyển toàn bộ dung dịch thu được lên cột và ly tâm 10.000
vòng/phút trong 1phút ở nhiệt độ phòng. Đổ bỏ dịch trong ống thu sau ly tâm
và đặt lại cột vào ống thu.
Bước 3: Bổ sung 700 µl dung dịch Wash buffer và ly tâm với tốc độ
10.000 vòng/phút trong thời gian 2 phút ở nhiệt độ phòng. Đổ bỏ dịch trong
ống thu sau ly tâm và đặt lại cột vào ống thu.
Bước 4: Tiếp tục ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hết
buffer. Bỏ ống thu.
Bước 5: Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml mới và bổ sung 10µl
elution buffer vào trung tâm của màng cột, ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng và ly
tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ cột, thu dịch DNA ở ống
eppendorf 1,5ml.
Điện di kiểm tra 2µl sản phẩm thu được trên gel agarose 1%.
2.2.5. Phương pháp giải trình tự DNA

22
Trình tự nucleotide quan tâm được xác định trên nguyên tắc của
phương pháp Sanger: tạo ra các đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một
nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra
các đoạn kết thúc bằng các ddNTP khác nhau, các mẫu được tiến hành giải
trình tự trên máy đọc trình tự tự động_ABI PRISM 3500 Avant Genetic
Analyzer - sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có sẵn
các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để xác định trình tự như dNTP,
ddNTPs, DNA polymerase... Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản
phẩm PCR) và mồi phù hợp. Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại
ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau.
Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi
1,6 pM, DNA plasmid 200 ng, BigDye và đệm tương ứng với tổng thể tích
10μl.
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR trong máy GenAmp® PCR System
9700 như sau: 96o
C – 1 phút; (96o
C – 10 giây; 50o
C – 5 giây; 60o
C – 4 phút) x
25 chu kỳ. Sau đó giữ sản phẩm ở 4o
C.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng phương pháp EtOH/EDTA. Sau
đó, nguyên liệu được đưa vào máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3500
Avant Genetic Analyzer . Các ống được điện di trong ống vi mao quản 80 cm
x 50 μl. Kết quả được thu nhận và xử lý bằng phần mềm 3500 Series Data
Collection Software và DNA Sequencing Analysis.
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu thống kê và so sánh
Trình tự các đoạn gen mang các đa hình sau khi được xác định trên máy
giải trình tự tự động ABI PRISM 3500 Avant Genetic Analyzer sẽ được kiểm
tra, xử lý thô và so sánh với trình tự chuẩn rCRS bằng BioEdit nhằm xác định
các đa hình ở 2 vùng siêu biến HVS-I và HVS-II ở 3 dân tộc. Đây là trình tự
DNA ty thể chuẩn được sửa đổi từ trình tự gốc được công bố vào năm 1981
của Anderson.
Các đa hình xuất hiện với tần suất ít nhất 10% ở 1 trong 3 dân tộc sẽ
được lựa chọn để thực hiện các phân tích thống kê nhằm đánh giá sự khác biệt
di truyền. Các phân tích thống kê được thực hiên trên phần mềm SPSS bản

23
23.0 và phần mềm excel bản Office 2010, sử dụng kiểm định Fisher-exact (2
phía). Mức ý nghĩa được lấy với α = 0,05. Ngoài ra, trình tự vùng siêu biến
của các cá thể cũng được sử dụng để ước tính khoảng cách di truyền bằng
phần mềm MEGA X. Nhóm đơn bội của các cá thể được xác định bằng
Haplogrep2 và PhyloTree Build 17.

24
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ CÁC MẪU MÁU
Sau khi tách chiết bằng kit, DNA tổng số từ 120 mẫu máu của 3 dân tộc
Kinh, Cờ Lao và Phù Lá được điện di trên gel agarose 1% nhằm kiểm tra chất
lượng. Kết quả điện di của tất cả các mẫu DNA đều cho một băng sáng, rõ nét
và không xuất hiện smear (Hình 3.1, 3.2 và 3.3). Ngoàı ra, các mẫu đều được
đo nồng độ bằng máy Nanodrop, thu được nồng độ trong khoảng từ 15-20
ng/µl. Như vậy, 120 mẫu DNA tổng số của 3 dân tộc đều đã được tách chiết
tốt, đảm bảo đủ chất lượng và nồng độ để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số 51 mẫu dân tộc Kinh; K01 – K51:
mẫu Kinh01 - Kinh51
Hình 3.2. Kết quả điện di DNA tổng số 34 mẫu dân tộc Cờ Lao; C01 - C34:
mẫu Colao01 – Colao34

25
Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số 35 mẫu dân tộc Phù Lá; P01 - P35:
mẫu Phula01 – Phula35
3.2. KHUẾCH ĐẠI 2 VÙNG SIÊU BIẾN HVS-I VÀ HVS-II BẰNG PHẢN
ỨNG PCR

Nghiên cứu đặc điểm đa hình nucleotide đơn ở hai vùng siêu biến hvs-i và hvs-ii trên d-loop ty thể của một số dân tộc Việt Nam.doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên cứu đặc điểm đa hình nucleotide đơn ở hai vùng siêu biến hvs-i và hvs-ii trên d-loop ty thể của một số dân tộc Việt Nam.doc

Similar to Nghiên cứu đặc điểm đa hình nucleotide đơn ở hai vùng siêu biến hvs-i và hvs-ii trên d-loop ty thể của một số dân tộc Việt Nam.doc (16)

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói ☎☎☎ Liên hệ ZALO/TELE: 0973.287.149 👍👍

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói ☎☎☎ Liên hệ ZALO/TELE: 0973.287.149 👍👍 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên cứu đặc điểm đa hình nucleotide đơn ở hai vùng siêu biến hvs-i và hvs-ii trên d-loop ty thể của một số dân tộc Việt Nam.doc