Nghiên cứu động học các phân tử protein trong tế bào sống bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử.doc

Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149
Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN VŨ ÁNH NGUYỆT
NGHIÊN CỨU ĐỘNG HỌC CÁC PHÂN TỬ
PROTEIN TRONG TẾ BÀO SỐNG BẰNG
PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI ĐƠN PHÂN TỬ
LUẬN VĂN THẠC SĨ VẬT LÝ
Thái Nguyên, năm

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGHIÊN CỨU ĐỘNG HỌC CÁC PHÂN TỬ
PROTEIN TRONG TẾ BÀO SỐNG BẰNG
PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI ĐƠN PHÂN TỬ
Chuyên ngành: Quang học
Mã số: 8440110
LUẬN VĂN THẠC SĨ VẬT LÝ
Cán bộ hướng dẫn khoa học:
TS. VŨ XUÂN HÒA
Thái Nguyên, năm

Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy giáo, TS.
Vũ Xuân Hòa đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu Trường THPT Chuyên
Hưng Yên, nơi tôi công tác, tới Ban lãnh đạo trường Đại học khoa học thuộc Đại học
Thái Nguyên đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập.
Cuối cùng ,tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn bên
tôi, động viên và khích lệ tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu của mình.
Mặc dù em đã cố gắng để hoàn thành đề tài nhưng không tránh khỏi những
thiếu sót nhất định.
Em rất mong được sự đánh giá, nhận xét và đóng góp ý kiến của các thầy cô
giáo và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2018
Học viên
Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt

MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG………………………………………………………………….
DANH MỤC HÌNH…………………………………………………………………..
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT……………………………………………
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN............................................................................................................... 2
1.1. Phân tử Poly-glycoprotein 2
1.2. Chuyển động dịch chuyển ngẫu nhiên (Brownian) 5
1.3.Kính hiển vi quang học[7] 7
1.3.1.Khái niệm cơ bản về kính hiển vi quang học 7
1.3.2. Cấu tạo chung của kính hiển vi quang học............................................................... 7
1.3.3. Nguyên lý hoạt động chung của kính hiển vi quang học ................................... 8
1.3.3.1. Nguyên tắc phóng đại ảnh của kính hiển vi.................................................... 8
1.3.3.2.Khẩu độ số ....................................................................................................................12
1.4.2.3. Độ phóng đại ..............................................................................................................13
1.3.3.4.Độ phân giải.................................................................................................................14
1.3.4. Một số loại kính hiển vi quang học............................................................................16
1.3.4.1. Kính hiển vi tương phản pha (Phase Contrast Microscopy[9]..............16
1.3.4.2. Kính hiển vi huỳnh quang(Fluorescence microcope[10]........................17
1.3.4.3. Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần (total internal reflection
microcope - TIRM ) .................................................................................................................20
CHƯƠNG II..............................................................................................................................................22
THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI ĐƠN PHÂN TỬ...................22
2.1. Chuẩn bị mẫu 22
2.1.1. Nuôi cấy tế bào P-glycoprotein...................................................................................22
2.1.2. Tổng hợp P-glycoprotein trong màng tế bào.........................................................23
2.2. Cấu hình quang học kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần 24
2.3. Phương pháp theo dõi đơn phân tử P-glycoprotein trong tế bào MDCKII 24
2.3.1. Cách tiến cận........................................................................................................................25
2.3.2. Quy trình theo dõi một phân tử trong chất lỏng...................................................25
2.3.2.1. Ghi một video dưới kính hiển huỳnh quang phản xạ nội toàn phần
(TIRFM)........................................................................................................................................26
2.3.2.2. Xác định các vị trí các PGP trên ảnh ...............................................................27
2.3.2.3. Theo dõi sự dịch chuyển các phân tử protein...............................................27
2.3.2.4 Phân tích dữ liệu.........................................................................................................31
CHƯƠNG III............................................................................................................................................33

3.1. Kết quả về tổng hợp protein trong màng tế bào 33
3.2. Hình thái màng tế bào MDCKII 36
3.3. Đơn phân tử protein dưới kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần
(TIRFM) 38
3.4. Các thông số động học của protein PGP-GFP 39
3.4.1. Kết quả tế bào 1..................................................................................................................40
3.4.1.1. Hệ số khuếch tán.......................................................................................................40
3.4.1.2. Quãng đường dịch chuyển....................................................................................42
3.4.1.3. Vận tốc dịch chuyển................................................................................................44
3.4.2. Kết quả tế bào 2..................................................................................................................45
3.4.3. Kết quả tế bào 3..................................................................................................................47
KẾT LUẬN................................................................................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................................51

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Liệt kê sự kết hợp độ phóng đại và khẩu độ số của vật kính và thị kính cho
độ phóng đại nằm khoảng giới hạn cho phép………………………………………..13
Bảng 1.2. Sự liên quan giữa độ phân giải với khẩu độ số và độ phóng đại………...15
Bảng 2.1.Thời gian kích thích và nồng độ BS dung trong tổng hợp protein………..24

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh phân tử P-glycoprotein trong màng tế bào ................................... 4
Hình 1.2. Cấu trúc của P-glycoprotein ........................................................................ 4
Hình 1.3. Các thành phần cấu tạo bên trong kính hiển vi quang học .......................... 8
Hình 1.4.Sơđồ tạo ảnh của kính hiển vi ....................................................................... 8
Hình 1.5. Sơđồ kính hiển vi giới hạn chiều dài ống .................................................. 10
Hình 1.6. Cấu hình tia truyền trong kính hiển vi hiệu chỉnh vô cùng ....................... 10
Hình 17. Sơđồ của kiểu chiếu sáng Kohler................................................................ 12
Hình 1.8. Khẩu độ số của vật kính ............................................................................. 12
Hình 1. 9. Khẩu độ số phụ thuộc tiêu cự của vật kính ............................................... 13
Hình 1.10. Giới hạn phân giải .................................................................................... 15
Hình 1.11 Sự phụ thuộc của đĩa Airy vào khẩu độ số ............................................... 15
Hình 1.12.................................................................................................................... 16
Hình 1.13. Ảnh qua kính hiển vi trường sáng (trái) và tương phản pha (phải) ......... 17
Hình 1.14. Đường đi ánh sáng kính thích và phát xạ qua kính lọc lập phương trong
kính hiển vi huỳnh quang ........................................................................................... 18
Hình 1.15. Cấu tạo của kính hiển vi huỳnh quang ..................................................... 19
Hình 1.16.Ảnh tế bào qua kính hiển vi huỳnh quang ................................................ 19
Hình 1.16.1. Nguyên lý phản xạ nội toàn phần ......................................................... 20
Hình 1.16.2. Cấu hình của kính hiển vi phản xạ nội toàn phần ................................. 20
Hình 1.16.3. Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần ...................................................... 21
Hình 1.17. Hình ảnh bề mặt tế bào dưới kính hiển vi phản xạ nội toàn phần ........... 21
Hình 2.1. Ảnh chụp một số đĩa thủy tinh dung để nuôi cấy tế bào............................ 22
Hình 2.2. Cấu hình quang học của kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần
[10]. ............................................................................................................................. 24
Hình 2.3. Sơ đồ minh họa quy trình theo dõi đơn phân tử ........................................ 26
Hình 2.4. Video gồm 100 ảnh của 1 tế bào MDCKII dưới kính hiển vi huỳnh quang
phản xạ nội toàn phần. Các PGP là các đốm sáng trong ảnh ..................................... 26
Hình 2.5. Mở video .................................................................................................... 27
Hình 2.6. Ảnh PGP trong tế bào MDCKII dưới kính hiển vi huỳnh quang phản xạ
nội toàn phần với thông số: radius=3, cutoff=3, percentile=0,1 ............................... 28

nội toàn phần với thông số: radius=3, cutoff=3, nhưng với percentile=0,1(trái) và
percentile=0,4 (phải)................................................................................................................................28
Hình 2.8. Quan sát tất cả các quỹ đạo của PGP. Phần đóng khung mầu xanh được
phóng to đến hình bên phải để thấy rõ hơn các quỹ đạo dịch chuyển của PGP............29
Hình 2.9. Thông tin quỹ đạo xuất ra từ thuật toán của Mosaictrong không gian 2
chiều................................................................................................................................................................30
Hình 2.10. Các tọa độ x và y tạo thành các điểm ảnh ở mỗi khung hình (frame)cho 1
quỹ đạo của phân tử.................................................................................................................................31
Hình 2.11. Quỹ đạo chuyển động của 1 PGP theo thời gian ................................................31
Hình 3. 1. Một chuỗi các ảnh tế bào MDCKII được chụp cùng 1 vị trí (chồng nhau)
dưới kính hiển vi tương phản pha và huỳnh quang tương ứng với các thời điểm khác
nhau 1h; 12h; 18h và 23h40 cho 4 nồng độ BS khác nhau: a) 0,1 mM; b) 0,5 mM; c)
1mM và d) 2mM .......................................................................................................................................35
Hình 3. 2. Cường độ huỳnh quang của các tế bào MDCKII với các nồng độ BS
(0,1mM; 0,5mM; 1mM và 2mM) tại các thời điểm khác nhau..................................36
Hình 3. 3. Quy trình tổng hợp protein PGP-GFP trong màng tế bào MDCKII.........36
Hình 3. 4. Hình thái màng tế bào MDCKII. a) Ảnh chụp dưới kính hiển vi huỳnh
quang và b) là ảnh kính hiển vi tương phản giao thoa tương ứng, c) ảnh chụp dưới
kính hiển vi tương phản pha và d) là ảnh chụp dưới kính hiển vi trường sáng..........37
Hình 3. 5. Hình ảnh của một tế bào chồng khít dưới kính hiển vi huỳnh quang (trái)
và TIRFM (phải). Các hạt PGP-GFP được bộc lộ chi tiết trên bề mặt của tế bào, phần
phóng to bên phải cho thấy chi tiết hơn hơn về protein này. .....................................38
Hình 3. 6. Phân biệt một phân tử duy nhất protein PGP-GFP và nhóm phân tử. a) là
tín hiệu phát quang của 1 phân tử duy nhất và b) là tín hiệu một nhóm phân tử. c) và
d) là giản đồ mình họa cho hai loại phân tử này tương ứng.......................................39
Hình 3. 7. Theo dõi và phân tích một phân tử PGP-GFP (a). Quỹ đạo dịch chuyển
(x(t), y(t)) trong thời gian 1 giây (b) và cường độ tương ứng trong khoảng thời gian
đó là (c).......................................................................................................................40
Hình 3. 8. Bình phương dịch chuyển trung bình (MSD) của đơn phân tử PGP-GFP
theo thời gian ..............................................................................................................41

Hình 3. 9. Hai phân bố hệ số khuếch tán tương ứng với 2 loại phân tử: đơn phân tử
PGP-GFP (màu đỏ) và nhóm phân tử PGP-GFP (màu xanh) ....................................42
Hình 3. 10. Bình phương dịch chuyển trung bình (MSD) của nhóm phân tử PGP-
GFP theo thời gian. Sử dụng phương trình (2.2 ở chương 2) để làm khớp số liệu thực
nghiệm, ta thấy MSD gồm 2 phân đoạn tương ứng với các giá trị hệ số khuếch tán
1 = 0,057 ± 0,00628 2/ và 2 = 0,495 ± 0,0934 2/ ............................................................................................................................................................................................................................................................................................... 42
Hình 3. 11. Hai quỹ đạo chuyển động của PGP-GFP tương ứng một đơn phân tử duy
nhất (mầu đỏ) và nhóm phân tử (mầu xanh) chuyển động trong mặt phẳng (x,y) trong
thời gian t=1,05s. ........................................................................................................43
Hình 3. 12. Hai phân bố dịch chuyển tương ứng với hai loại phân tử trong cùng một
tế bào: đơn phân tử (mầu đỏ) và nhóm phân tử (mầu xanh) ......................................44
Hình 3. 13. Phân bố vận tốc của hai loại phân tử trong cùng một tế bào. Kết quả vận
tốc trung bình của các đơn phân tử bằng 1,33 và nhóm phân tử bằng 1,14 /
44
Hình 3. 14. Kết quả các thông số động học của các phân tử protein trong tế bào thứ
2đã xử lý.Các phân tử protein PGP-GFP phát huỳnh quang trong màng tế bào dưới
ảnh TIRFM với nhiễu nền rất thấp a).Các phân bố động học về hệ số khuếch tán và
quãng đường dịch chuyển được thể hiện trong hình b và c........................................46
Hình 3. 15. Kết quả các thông số động học của các phân tử protein trong tế bào thứ 3
đã xử lý.Các phân tử protein PGP-GFP phát huỳnh quang trong màng tế bào dưới
ảnh TIRFM với nhiễu nền rất thấp a).Các phân bốđộng học về hệ số khuếch tán và
quãng đường dịch chuyển được thể hiện trong hình b và c). d)-phân bố của vận tốc 47

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
STT Ký hiệu Tên đầy đủ Tên tiếng Việt
1 PGP P-glycoprotein
2 MDCKII Madin Darby Canine Kidney Tế bào ung thư thận chó
3 GFP Green fluorescent protein Protein phát sáng huỳnh quang
4
TIRFM Total internal reflection Kính hiển vi huỳnh quang
fluorescence microscopy phản xạ nội toàn phần
5
MSD Mearn square displacement Bình phương dịch chuyển
trung bình

MỞ ĐẦU
Chúng ta biết rằng, trong màng tế bào có rất nhiều các thành phần như;
glucide, glycolipid, protein…do đó cấu trúc màng là vô cùng phức tạp.Một trong các
thành phần quan trọng đó chính là protein mặc dù nó chiếm tỷ lệ nhỏ hơn so với các
lipid màng.Các protein màng có liên quan đến các quá trình tế bào gốc như; di truyền
sinh học hay truyền thông tin.Việc hiểu biết ở cấp độ phân tử là rất cần thiết cho thiết
kế các công cụ dược phẩm mới của các protein tế bào chất. Trong tế bào, ngoài vai
trò chính là thành phần trong cấu trúc của tế bào và mô, protein còn có nhiều chức
năng phong phú khác quyết định những đặc điểm cơ bản của sự sống như sự truyền
đạt thông tin di truyền, sự chuyển hoá các chất (các enzyme, các kháng thể chống lại
bệnh tật, các hormon dẫn truyền các tín hiệu trong tế bào), v.v... Bên cạnh đó, các
phân tử protein cũng đóng góp rất lớn trong việc gây ra các bệnh lý, điều này là do
các phân tử protein có những biến đổi bất thường về cả số lượng và chất lượng.Ngoài
ra, protein tham gia vào hệ thống miễn dịch của nhiều cơ quan, nhiều loại tế bào và
nhiều loại protein thực hiện các chức năng riêng biệt tạo nên các hiệu quả miễn dịch
đặc hiệu và không đặc hiệu. Đặc biệt, trong tế bào ung thư các phân tử protein còn
tham gia vào các quá trình kháng thuốc, đó là hiện tượng mà các nhà khoa học thuộc
lĩnh vực sinh-y học hiện đang rất trăn trở và rất quan tâm nghiên cứu. Đây là một
trong những hiện tượng rất nghiêm trọng khi người bị mắc bệnh ung thư dùng nhiều
lần cùng một loại thuốc sẽ bị mất tác dụng (nhờn thuốc). Các nghiên cứu trên thế giới
đã cho thấy một trong những protein cơ bản tham gia vào quá trình này chính là phân
tử poly-glycoprotein (PGP)-một loại đại phân tử trong màng tế bào ung thư. Tuy
nhiên, việc nghiên cứu chi tiết về động học của nó vẫn còn sơ sài và hiện nay đang là
vấn đề thời sự.
Để nghiên cứu các thông số động học protein tế bào, phương pháp theo dõi
đơn hạt hay đơn phân tử là ứng viên sáng giá cho lựa chọn này. Vì vậy trong luận văn
này tôi tập trung thực hiện: nghiên cứu động học các phân tử protein trong tế bào
sống bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử.
Ngoài phần mở đầu và kết luận, Báo cáo luận văn gồm 3 chương chính:
Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp theo dõi đơn phân tử
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Để giải mã sự tương tác phức tạp giữa vô số các phân tử khác nhau thể hiện
trong một môi trường (dung dịch hay tế bào) là một vấn đề đã và đang được tìm hiểu
trong nhiều thập kỷ gần đây [1]. Do đó, từ việc nghiên cứu kính hiển vi đã cho thấy
rằng trong màng tế bào có nhiều thành phần như: glucide, photpholipit, protein ..Một
trong các thành phần quan trọng đó là protein, ngoài vai trò chính là thành phần trong
cấu trúc của tế bào và mô thì protein còn nhiều chức năng khác như : truyền đạt
thông tin di truyền, vận chuyển các chất, tạo ra các kháng thể v.v… Do đó, các phân
tử protein đóng góp lớn trong việc gây ra các bệnh lý, điều này do các phân tử protein
biến đổi bất thường về cả số lượng và chất lượng.Ngoài ra, protein còn tham gia vào
hệ thống miễn dịch của nhiều cơ quan, nhiều loại tế bào và nhiều loại protein thực
hiện chức năng riêng biệt tạo nên các hiệu quả miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu.
Đặc biệt, trong tế bào ung thư các phân tửprotein còn tham gia vào quá trình kháng
thuốc, đây là hiện tượng mà các nhà khoa học thuộc lĩnh vực y-sinh rất quan tâm
nghiên cứu hiện nay. Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy một trong những
protein cơ bản tham gia vào quá trình này chính là phân tử P-glycoprotein (PGP),
một loại đại phân tử trong màng tế bào ung thư. Đáng chú ý là không chỉ các nhà sinh
họcđang có sự tiến bộ rất lớn trong việc làm sáng tỏ sự phức tạp của các tế bào, mà
còn có các nhà vật lý đang đóng một vai trò ngày càng quan trọng trong lĩnh vực này.
Do đó, khả năng theo dõi các phân tử đơn lẻ một cách tự nhiên trongtế bào sống cần
được mô tả một cách định lượng và chính xác hơn về các quá trình động học để kiểm
soát chức năng tế bào.
1.1. Phân tử Poly-glycoprotein
Poly-glycoprotein (P-glycoprotein) là một đại phân tử và là một trong các
protein vận chuyển, chúng quyết định vận chuyển thuốc vào (uptake) hoặc vận
chuyển ra (efflux) khỏi cơ thể. Quá trình vận chuyển thuốc ảnh hướng đến nồng độ
thuốc trong huyết tương và tại mô và cuối cùng ảnh hướng đến tác dụng của thuốc. P-
glycoprotein là một protein vận chuyển xuyên màng, nó vận chuyển các cơ chất từ
trong ra ngoài tế bào. Những thuốc ức chế hoặc cảm ứng P-glycoprotein có thể tương
tác với các thuốc khác được vận chuyển bởi protein này. P-glycoprotein được tìm
thấy lần đầu trong các tế bào ung thư. Những tế bào này có sự hiện diện quá mức của
P-glycoprotein, điều này làm giảm việc thâm nhập của các thuốc độc tế bào (điều trị
ung thư) vào trong cơ thể. Bởi vì điều này tạo cho các khối u khả năng kháng thuốc
trị ung thư, P-glycoprotein còn được biết đến như là protein gây đề kháng đa thuốc
(multidrug resistance protein)[1]. P-glycoprotein cũng hiện diện ở nhiều mô bình
thường, không phải ung thư, với chức năng bài tiết (như ruột non, gan, thận)[1] và tại

các hàng rào máu-mô (như hàng rào máu - não, hàng rào máu – tinh hoàn, hàng rào
nhau thai)[2].
Cùng với các enzyme cytochrome P450, sự hiện diện của P-glycoprotein
được tin là một bước tiến hóa thích hợp của cơ thể để chống lại các chất độc hại tiềm
tàng muốn thâm nhập vào cơ thể. Với vài trò là một kênh vận chuyển đẩy thuốc ra
khỏi cơ thể, nó làm giảm sinh khả dụng của các thuốc dùng đường uống bằng cách
bơm ngược thuốc trở lại lumen ruột. Điều này thúc đẩy bài tiết thuốc qua mật và
nước tiểu, qua đó bảo vệ một số mô như não, tinh hoàn, nhau thai và bạch cầu. Cơ
chất vận chuyển bởi P-glycoprotein có rất nhiều cấu trúc khác nhau.P-glycoprotein
tham gia thải trừ thuốc không nhiều. Nó chỉ hiện diện tại bề mặt của tế bào ống lượn
gần ở thận. P-glycoprotein tham gia vận chuyển thuốc ra nước tiểu.
P-glycoprotein đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa các tương tác
thuốc-thuốc[3]. Dược động học của thuốc có thể sẽ bị thay đổi khi được dùng cùng
với một chất gây ức chế hoặc cảm ứng P-glycoprotein[3,5,6]. Các chất ức chế bao
gồm clarithromycin, erythromycin, ritonavir và verapamil. Chất cảm ứng bao gồm
rifampicin và St John’s wort (một loại thảo dược).
Có nhiều cơ chất được vận chuyển bởi P-glycoprotein tương tự với CYP3A4.
Nó vận chuyển nhiều thuốc thuộc nhiều nhóm khác nhau, bao gồm:
+ Thuốc trị ung thư: docetaxel, etoposide, vincristine
+ Nhóm chẹn kênh calci: amlodipine
+ Nhóm ức chế calcineurin: cyclosporin, tacrolimus Digoxin
+ Kháng sinh nhóm macrolide: Clarithromycin
+ Nhóm ức chế men protease
Các cơ chất của P-glycoprotein có thể chia thành 2 loai: các thuốc không bị
chuyển hóa ở người, chẳng hạn như digoxin và những thuốc là cơ chất của cả P-
glycoprotein và enzym chuyển hóa thuốc, thông thường là CYP3A4[2,3]. Nhiều cơ
chất của P-glycoprotein cũng là cơ chất của CYP3A4 vì những chất ức chế P-
glycoprotein thì cũng ức chế CYP3A4, nhiều tương tác thuốc- thuốc có liên quan đến
sự ức chế hay cảm ứng cả P-glycoprotein và CYP3A4. Một số thuốc là tác nhân của
các tương tác trên như: cyclosporin, tacrolimus và rivaroxaban[3].

Hình 1.1. Hình ảnh phân tử P-glycoprotein trong màng tế bào
Hình 1.2. Cấu trúc của P-glycoprotein
Sự khác nhau về sinh khả dụng giữa các cá thể làm cho việc dự đoán một cách
chính xác các tương tác thuốc- thuốc tiềm tàng thông qua P-glycoprotein trở nên
phức tạp. Điều này cũng ảnh hưởng đến những thuốc không bị chuyển hóa ở người(
fexofennadine, dioxin). Cần có nhiều hơn nữa những kiến thức về vai trò của gen đối
với hoạt động và biểu lộ của protein vận chuyển sẽ góp phần giúp hiểu rõ hơn về sự
khác nhau về phân bố và tác dụng của thuốc giữa các cá thể và chủng tộc khác
nhau[2].
Tóm lại, P-glycoprotein là một protein vận chuyển đẩy thuốc ra khỏi cơ thể
,nó có mặt tại nhiều cơ quan đóng vai trò qua trọng trong việc vận chuyển thuốc và
có vai trò quan trọngtrong hấp thu , phân bố, chuyển hóa, thải trừ thuốc. Mặc dù các
tương tác với protein vận chuyển thuốc trên lâm sàng có thể không có nhiều ý nghĩa,
nhưng các cảnh báo về những nguy cơ xảy ra tương tác thuốc liên quan đến protein
vận chuyển thuốc vẫn rất quan trọng. Nếu tương tác xảy ra, hậu quả có thể là suy
nhược hệ thần kinh trung ương, giảm hiệu quả điều trị HIV, thải loại mảnh

ghép.Trang bị những kiến thức về những tương tác tiềm tàng này sẽ giúp đảm bảo
việc chăm sóc và điều trị hiệu quả trên nhóm các bệnh nhân nguy cơ.
1.2. Chuyển động dịch chuyển ngẫu nhiên (Brownian)
Khi một hạt rắn đặt trong dung dịch, ngoài việc chúng chuyển động quay
Brownian mà đồng thời chúng còn chuyển động dịch chuyển. Các quy luật cơ bản
của chuyển động dịch chuyển Browninan đã được thiết lập bởi Einstein và sau Perrin
là người phát triển sâu và đầy đủ hơn . Chuyển động Brownian của một hạt rắn trong
môi trường có độ nhớt η(T) được đặc trưng bởi một tập hợp các tham số bất thường
do kích động nhiệt. Các luật cơ bản của chuyển động Brownian của một quả cầu nhỏ
tự do đắm mình trong một chất lỏng cho phép xác định các vị trí dịch chuyển của một
hạt theo thời gian dài so với khoảng thời gian giữa hai "cú sốc". Chúng ta xét một hạt
nhỏ chuyển động Brownian mà trong quá trình di chuyển nó bị bắn phá từ mọi phía
bởi các phân tử của môi trường xung quanh do kích động của nhiệt.
Vấn đề đặt ra là: sau mỗi khoảng thời gian, khoảng cách trung bình của hạt tại
điểm tìm thấy nó là bao nhiêu?. Chúng ta thấy rằng bình phương dịch chuyển trung
bình tỷ lệ với thời gian. Điều này có thể viết theo công thức dưới đây trong n chiều.
〈 2〉 = 2 (1.1)
ở đó D là hệ số khuếch tán dịch chuyển, τ là thời giantrôi của hạt dạng cầu.
Để xác định D, chúng ta có thể viết các lực cân bằng tác dụng lên hạt bằng
cách xem hạt chịu tác dụng của ma sát nhớt tỷ lệ thuận với tốc độ. Sự cân bằng của
các lực đó có thể như sau (theo một chiều), được gọi là phương trình Langevin:
2
= − ( )+ ( ) (1.2)
2
Ở đó, ( ) là ngoại lực tác dụng lên hạt trong môi trường, ( ) là vận tốc theo trục , là hệ số ma
sát, giá trị của có thể được xác định trực tiếp từ thực nghiệm.
Nhân 2 vế của phương (3.2) với và lấy trung bình, ta nhận được :
〈
2
〉 = 〈− + ( )〉
2
⇔ 〈
2
〉 = 〈− 〉 + 〈 ( )〉 (1.3)
2
Với 〈 ( )〉 = 0 do tính chất đối xứng,
Vì vậy :
〈
2
〉 = −〈 ( )2〉 (1.4)
2

Ta nhận được:
− 〈 〉 = −〈 ( )2〉 ⟺ 2〈 〉 = 2 〈( )2〉 =
2
〈 2〉 (1.5)
Với 〈 2〉 vận tốc bình phương trung bình theo trục .
Chúng ta biết rằng, ở điều kiện cân bằng nhiệt động: 12 〈 2〉 = 12
Với là hằng số Boltzmann.
Ở đó
2〈 〉=2
⟺ 〈 2〉=2
⟹〈 2〉= 2 . (1.6)
Công thức này có thể tổng quát hóa cho n chiều, ta có :
〈 2〉=
(1.7)
Chúng ta có thể nhận được mối liên hệ theo hệ số khuếch tán dịch chuyển, hệ
số nhớt của môi trường và nhiệt độ từ các phương trình (1.3) và (1.9):
= (1.8)
Đối với các hạt hình cầu, có thể chứng minh được công thức liên hệ giữa hệ số
ma sát với bán kính R của hạt và độ nhớt chất lỏng theo:
= 6 (1.9)
Cuối cùng, đối với hạt hình cầu, chúng ta nhận được công thức Einstein-
Stokes:
= (1.10)
6
Trong công thức này, bán kính của hạt thực chất là bán thủy động lực học –là
bán kính hình học của hạt mà bị giới hạn bởi một lớp giới hạn của môi trường quay
quanh hạt.
Từ đây ta có thể viết lại công thức bình phương dịch chuyển trung bình theo
hệ số khuếch tán:
〈 2〉= (1.11)

- Xét trong không gian 3 chiều : 〈 2〉 = 6 .
- Xét trong không gian 2 chiều : 〈 2〉 = 4 . (1.12)
- Xét trong không gian 1 chiều : 〈 2〉 = 2 .
1.3.Kính hiển vi quang học[7]
1.3.1.Khái niệm cơ bản về kính hiển vi quang học
Kính hiển vi quang học là dụng cụ quang học dùng để tạo ra hình ảnh phóng
đại của các vật nhỏ mà không thể quan sát được bằng mắt thường. Một kính hiển vi
thực hiện các chức năng sau: tạo ra ảnh phóng đại của mẫu, phân giải các chi tiết của
ảnh, và làm cho các chi tiết đó quan sát được bằng mắt người hoặc camera. Bằng sự
kết hợp một số các thấu kính một cách chính xác, kính hiển vi có thể tạo ra giá hình
ảnh với độ phóng đại rất lớn.
1.3.2. Cấu tạo chung của kính hiển vi quang học
Cấu tạo của kính hiển vi quang học gồm ba phần chính:
• Nguồn chiếu sáng
• Hệ quang học phóng đại ảnh
• Hệ thu ảnh
Trong ba bộ phận chính của kính hiển vi, bộ phận quan trọng cũng như phức
tạp nhất chính là bộ quang học phóng đại ảnh, bộ phận này là bộ phận quyết định
nhiệm vụ phóng đại ảnh của kính hiển vi. Để hiểu nguyên lý hoạt động của kính hiển
vi, chúng ta cần biết cấu tạo cơ bản của hệ kính.
Hầu hết các kính hiển vi có một cơ cấu dịch chuyển cơ học gắn vào bàn soi
cho phép người dùng xác định đúng vị trí, hướng, và tập trung mẫu để tối ưu hoá việc
quan sát và ghi lại ảnh. Cường độ chiếu sáng và định hướng đường đi của ánh sáng
trong kính hiển vi có thể được điều khiển bởi một hệ thống gồm thấu kính, diaphram,
gương, lăng kính, các bộ phận tách chùm sáng và các thiết bị quang học khác để đạt
được ảnh có độ phân giải, độ phóng đại, độ chói và độ tương phản như ý muốn trong
mẫu.

Hình 1.3.Các thành phần cấu tạo bên trong kính hiển vi quang học
Hình 1.1 là cấu tạo của một kính hiển vi quang hiện đại. Hệ thống chiếu sáng
được cung cấp bởi đèn đặt trong buồng đèn. Ánh sáng phát ra từ đèn được truyền qua
một hệ thống thấu kính tạo chùm tia song song được dẫn truyền trong đế kính hiển vi.
Ngoài ra trong đế kính hiển vi có một số phin lọc đặt trước gương phản xạ, sau khi
ánh sáng phản xạ trên gương sẽ được truyền qua diapragm thị trường và tới buồng tụ
sáng . Bộ phận tụ sáng tạo ánh sáng có dạng nón chiếu vào mẫu (được định vị trên
bàn soi), ánh sáng truyền qua mẫu đi vào trong vật kính. Ánh sáng qua vật kính được
tách thành hai chùm tia bởi một lăng kính để đi vào thị kính và camera.
1.3.3. Nguyên lý hoạt động chung của kính hiển vi quang học
1.3.3.1. Nguyên tắc phóng đại ảnh của kính hiển vi
Khi nhìn vào kính hiển vi, ta không nhìn thấy mẫu mà nhìn thấy ảnh của mẫu.
Hình ảnh đó là đại diện của mẫu, chính xác đến từng chi tiết từ hình dáng tới màu
sắc.
Hình 1.4.Sơ đồ tạo ảnh của kính hiển vi

Để ảnh của vật được phóng đại lên thì cần đặt mẫu rất gần với tiêu cự của thấu
kính thứ nhất (còn gọi là vật kính). Theo tính chất của thấu kính hội tụ, khi vật đặt rất
gần ở tiêu cự thì cho ảnh là ảnh thật, ngược chiều vật, và được phóng đại lớn hơn
nhiều lần tùy vào khoảng cách đặt vật cũng như độ dài tiêu cự vật kính. Thấu kính
được sử dụng có độ dày đủ mỏng để độ dài đường đi của ánh sáng qua vật kính là
không đáng kể. Ảnh thật được tạo qua vật kính gọi là ảnh trung gian. Để quan sát
được ảnh này người ta phải dùng một thấu kính thứ hai đặt gần ảnh trung gian để tạo
ra ảnh ảo trên võng mạc của mắt, thấu kính thứ hai này còn được gọi là thị kính. Do
đó khi quan sát vật qua kính hiển vi ta luôn thấy được ảnh của nó nằm cùng chiều và
lớn hơn nhiều lần so với mẫu vật [8]
Đặt khoảng cách từ vật tới tâm của vật kính (vật kính trong trường hợp này là một
thấu kính đơn) là a theo hình1.2, khoảng cách từ tâm của vật kính tới ảnh là b, tiêu cự
của vật kính là f.Theo tính chất thấu kính lồi dùng làm vật kính ta có công thức sau:
1
+
1
a b
Suy ra
= 1
f
b =
a. f
a − f
h2 =
h1.b
a
Độ phóng đại của ảnh được xác định bởi:
(2.1)
M =
b
=
f
a a − f
(2.2)
Như vậy khi vật đặt rất gần tiêu cự của thấu kính thì độ phóng đại càng lớn.
Khi độ lớn của vật mẫu là h1 và h2 là độ lớn của ảnh thì:
ℎ2 = . ℎ1 (2.3)
Xác định được độ lớn của ảnh trung gian thì ta sẽ tính được độ lớn của ảnh khi
quan sát thị kính, lúc này ảnh trung gian lại đóng vai trò là vật cần quan sát.
a) Cấu hình quang học
Có hai loại cấu hình quang học của kính hiển vi: kính hiển vi có chiều dài ống
giới hạn và kính hiển vi hiệu chỉnh tia sáng vô cùng.

Hình 1.5. Sơ đồ kính hiển vi giới hạn chiều dài ống
Theo hình 1.2, một vật có chiều cao h1 đặt cách tâm vật kính một khoảng là a
cố định, ảnh trung gian được tạo ra bởi vật kính sẽ phụ thuộc vào tiêu cự và khoảng
cách a, giả sử khoảng cách từ ảnh trung gian tới tâm vật kính là b thì độ cao của ảnh
h2 được xác định là h2 =
h1.b
a
a. f
b = a. f
b = a − f
,a và f cố định nên
Theo công thức (2.1) thì a − f
khoảng cách b là cố định, dẫn đến chiều cao h2 của ảnh phụ thuộc vào khoảng cách a
và độ dài tiêu cự f của thấu kính. Mô hình kính hiển vi chiều dài ống ống giới hạn sẽ
cho độ phóng đại ảnh không đổi.
Hình 1.6. Cấu hình tia truyền trong kính hiển vi hiệu chỉnh vô cùng
Mô hình kính hiển vi hiệu chỉnh tia sáng vô cùng được thiết kế thêm thấu kính
đặt sau vật kính nhằm tạo tia sáng song song. Ảnh trung gian thu được lúc này phụ
thuộc vào vị trí đặt thấu kính phụ, khi thay đổi vị trí của thấu kính phụ ta sẽ lấy được
các vị trí khác nhau của ảnh trung gian. Ảnh của vật quan sát ngoài phụ thuộc vào vật
kính còn phụ thuộc vào khoảng cách từ ảnh trung gian tới thị kính, khi khoáng cách

từ ảnh trung gian tới tâm thị kính càng ngắn thì ảnh ảo quan sát được càng lớn nên
kính hiển vi hiệu chỉnh vô cùng của cấu hình kính hiển vi này cho người dùng có thể
điều chỉnh độ lớn của ảnh quan sát. Cấu hình kính hiển vi hiệu chỉnh tia sáng vô cùng
thường được ứng dụng trong hệ kính hiển vi hiện đại.
b) Kiểu chiếu sáng Kohler
Cách chiếu sáng của kính hiển vi đặc biệt quan trọng trong việc hình thành
chất lượng hình ảnh. Để nâng cao hiệu suất chiếu sáng, năm 1893 Kohler (làm việc
tại tập đoàn Carl Zeiss) đã giới thiệu cấu hình chiếu sáng để tối ưu hóa nguồn sáng
chiếu tới mẫu (Hình 1.5). Trong hình này, kính hiển vi được thiết kế với các
diaphragma đặt trên đường đi của ánh sáng nguồn và ánh sáng đi qua vật kính. Bằng
cách đóng mở các diaphragma này, người ta điều khiển được độ đóng mở của chùm
sáng kích thích (diaphragma 1) cũng như trường nhìn của thị kính (diaphragma 4) để
nâng cao chất lượng chiếu sáng mẫu cũng như chất lượng của ảnh thu được.
Hệ kính hiển vi hiện đại được thiết kế gồm tập hợp thấu kính và thành phần
quang học khác để điều khiển chùm tia sáng. Bộ dẫn chùm tia (condenser) trong kính
sẽ điều khiển đóng mở góc tia sáng chiếu tới mẫu theo những góc phương vị khác
nhau. Độ mở của bộ dẫn chùm tia kết hợp với độ mở của vật kính sẽ cho giá trị của
khẩu độ số của cả hệ thống kính hiển vi. Khi bộ dẫn chùm tia mở thì khẩu độ số của
kính hiển vi tăng lênnên dẫn đến hiệu suất phân giải ảnh sẽ cao hơn.

Hình 1.7. Sơ đồ của kiểu chiếu sáng Kohler
1.3.3.2.Khẩu độ số
Khẩu độ số của vật kính là đại lượng đặc trưng cho khả năng thu thập ánh
sáng và phân tích chi tiết mẫu. Khẩu độ số NA ảnh hưởng trực tiếp tới độ rõ nét của
ảnh, Rayleigh đã đưa ra công thức phụ thuộc giữa giá trị này với khoảng cách giữa
hai điểm gần nhất có thể quan sát được trên ảnh nhiễu xạ:
d = 1.22 ( /2NA) (2.4)
Hình 1.8. Khẩu độ số của vật kính
là bước sóng ánh sáng tới
Độ lớn của khẩu độ số NA được tính theo công thức sau:

NA= n.sin (2.5)
Với n là chiết suất môi trường nằm giữa mẫu vật và vật kính
- là ½ góc của chùm sáng hình nón mà vật kính thu được
Khẩu độ số phụ thuộc vào tiêu cự của kính vật, tiêu cự càng nhỏ thì góc càng lớn,
do đó khẩu độ số càng lớn. Nhưng lớn nhất max=900
, với môi trường là không khí thì giới
hạn của NA trong trường hợp này sẽ là 1. Trong thực tế của NA thường là <0,95.
Nếu tăng chiết suất n thì giá trị của NA sẽ tăng. Người ta chế tạo các kính vật
“ngâm trong dầu” (“immersion oil”) với n=1,51 cho NA=1,4, hoặc kính vật “ngâm
trong nước” với n=1,3 cho NA=1,2 để tăng độ phân giải của ảnh, vấn đề này được đề
cập ở phần sau
Hình 1.9. Khẩu độ số phụ thuộc tiêu cự của vật
kính 1.4.2.3. Độ phóng đại
Độ phóng đại là sự phóng ảnh của mẫu vật bằng hệ thống quang học của kính
hiển vi. Độ phóng đại là bội của độ phóng đại của vật kính (M1) và thị kính (M2):
M=M1 .M2
Độ phóng đại của kính hiển vi quang học thường là vài trăm lần.
Tổng độ phân giải của vật kính và thị kính phụ thuộc vào khẩu độ số của cả hệ
thống kính. Độ phóng đại nhỏ nhất cần thiết cho việc phân giải ảnh được tính xấp xỉ
bằng 500 x NA, còn độ phóng đại tối đa bằng 1000 x NA, nếu độ phóng đại vượt quá
giới hạn hữu ích này thì ảnh thu được không được mịn và khó thấy được rõ chi tiết
cần quan sát.
Bảng 2.1.Liệt kê sự kết hợp độ phóng đại và khẩu độ số của vật kính và thị kính
cho độ phóng đại nằm khoảng giới hạn cho phép.
Vật kính(NA) Thị kính
NA 10x 12.5x 15x 20x 25x
2.5x(0.08) --- --- --- x x
4x(0.12) --- --- x x x

10x(0.35) x x x x x
25x(0.55) x x x x ---
40x(0.70) x x x --- ---
60x(0.95) x x x --- ---
100x(1.40) x x --- --- ---
Bên cạnh đó, độ phóng đại còn phụ thuộc vào khoảng cách giữa mặt phẳng
tiêu sau của vật kính và mặt phẳng ảnh trung gian hay còn gọi là chiều dài của của
ống kính hiển vi (được xác định là khoảng cách từ mâm gắn vật kính đến điểm đầu
của thị kính). Hầu hết tiêu chuẩn chiều dài ống của vật kính thường là 160, 170, 200,
hoặc 210 millimet với 160 millimet là phổ biến nhất.
1.3.3.4.Độ phân giải
Độ phân giải xác định cấu trúc nhỏ nhất quan sát được hay là khoảng cách tối
thiểu giữa hai chi tiết có thể phân biệt được trên hình ảnh.
Giới hạn cơ bản của độ phân giải (được Abbe lập ra vào năm 1873) phụ thuộc
vào bước sóng ánh sáng được sử dụng và khẩu độ số NA. Như đã nêu trong phần 2.2,
khoảng cách tối thiểu giữa 2 điểm có thể phân biệt được là:
d =
0,61.
NA
( - bước sóng ánh sử dụng) (2.6)
Đối với kính vật có NA cao xấp xỉ hoặc lớn hơn 1, thì độ phân giải gần đúng
là /2. Như vậy, trong thực tế, giới hạn độ phân giải của kính hiển vi quang học sẽ là
150nm (khi 350nm, NA 1,4). Khẩu độ số càng cao thì độ phân giải ảnh càng tốt vì
lúc đó khoảng cách d càng nhỏ.
Mặt khác, độ phân giải còn bị giới hạn bởi nhiễu xạ (diffraction limit). Khi
một nguồn sáng điểm được hiện ảnh bằng một thấu kính thì ảnh nhận được là một
đốm sáng mờ với các vân giao thoa hay là ảnh nhiễu xạ - ảnh này được gọi là quầng
sáng Airy (Airy pattern). Đốm sáng trung tâm của ảnh nhiễu xạ được gọi là đĩa Airy.
Giới hạn của độ phân giải được định nghĩa là khoảng cách d (tâm tới tâm) bằng bán
kính của đĩa Airy (hình dưới).

Hình 1.10. Giới hạn phân giải
a) Quầng sáng Airy, đĩa Airy là điểm sáng trung tâm
b) d> rAiry
c) d= rAiry
Trong dải ánh sáng từ đỏ đến tím, kích thước của đĩa Airy giảm dần. Ánh sáng
màu đỏ (tương đương với = 700nm) có kích thước lớn nhất và ánh sáng màu tím (
= 400nm) có kích thước đĩa bé nhất. Kích thước của đĩa Airy phụ thuộc vào khẩu độ
số, với giá trị khẩu độ số bé thì kích thước của đĩa Airy lớn (Hình a), và ngược lại
(Hình b & Hình c).
Hình 1.11Sự phụ thuộc của đĩa Airy vào khẩu độ số
Do đó, với những loại vật kính có khẩu độ số khác nhau thì ở mỗi một giá trị
phóng đại sẽ cho độ phân giải khác nhau.
Bảng 2.2. Sự liên quan giữa độ phân giải với khẩu độ số và độ phóng đại
Độ phóng đại Khẩu độ số (NA) d(µm)
4x 0.10 2.75
10x 0.25 1.10
20x 0.40 0.69
40x 0.65 0.42
60x 0.75 0.37

100x 1.25 0.22
1.3.4. Một số loại kính hiển vi quang học
1.3.4.1. Kính hiển vi tương phản pha (Phase Contrast Microscopy[9]
a. Nguyên lý
Với những vật trong suốt và sự khác biệt về chiết suất so với môi trường là
không đáng kể thì rất khó phân biệt chúng với môi trường kể cả chụp ảnh hiển vi
truyền qua. Kính hiển vi tương phản pha hiện ảnh của sự khác biệt pha của sóng ánh
sáng đi qua môi trường và đi qua mẫu, vì vậy ta có thể quan sát được ảnh của mẫu
vật.
Hình 1.12.Cấu hình quang học của kính hiển vi tương phản pha
Kính hiển vi tương phản pha là kỹ thuật tạo ảnh sử dụng sự khác biệt về pha để tạo
nên sự biến đổi về cường độ ánh sáng trên thị kính hoặc phim chụp.
b. Cấu tạo
Ánh sáng từ nguồn (1) được phân cực rồi đi qua một tấm chắn sáng vành
khuyên (2) để tạo góc chiếu tới mẫu (4) lớn (chiếu từ góc ngoài), do đó tạo độ dịch
pha lớn. Phần ánh sáng không đi qua mẫu (dịch pha bằng 0) và đi qua mẫu đều được
vật kính thu nhận và truyền qua một tấm bản pha (7) thường là tấm λ/2. Ánh sáng
không đi qua mẫu sẽ được truyền qua tấm bản pha gần như 100%. Ánh sáng đi qua
mẫu sẽ bị lệch pha so với ánh sáng không qua mẫu và mất đi một phần cường độ khi
qua tấm bản pha. Tùy vào cấu trúc của mẫu mà độ lệch pha sẽ là lớn hay nhỏ và do
đó phần cường độ mất mát khi đi qua tấm bản pha sẽ là nhiều hay ít. Các ánh sáng
này sẽ tạo nên ảnh của vật trên mặt phẳng trung gian (8) với cường độ sáng tối khác

nhau tùy thuộc vào cấu trúc của vật và được đưa vào trường nhìn của thị kính (9)
hoặc vào camera.
Hình 1.13. Ảnh qua kính hiển vi trường sáng (trái) và tương phản pha (phải)[7 ]
c. Ứng dụng
Kính hiển vi tương phản xa ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu tế bào, vi khuẩn
y sinh...hoặc ứng dụng khi nghiên cứu những mẫu vật không thể quan sát được bởi
sự trong suốt của mẫu với môi trường.
1.3.4.2. Kính hiển vi huỳnh quang(Fluorescence microcope[10]
a. Nguyên lý
Ngoài loại kính hiển vi truyền qua thông thường, người ta chế ra loại kính hiển
vi huỳnh quang cho phép quan sát ảnh phóng đại của vật thể nhờ ánh sáng tự phát
quang của chúng hoặc nhờ bức xạ huỳnh quang thứ cấp do gắn vật thể được quan sát
với các chất đánh dấu phát quang.
Kính hiển vi quang thông thường sử dụng ánh sáng chiếu vào mẫu vật và tạo
hình ảnh phóng to của vật đó. Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng ánh sáng với cường
độ lớn hơn rất nhiều để chiếu vào mẫu vật. Ánh sáng này sẽ kích thích huỳnh quang
mẫu vật có bước sóng dài hơn. Kính hiển vi huỳnh quang cũng tạo ra hình ảnh phóng
to của vật, nhưng hình ảnh này được tạo trên cơ sở nguồn sáng thứ cấp - ánh sáng
huỳnh quang.

b. Cấu tạo
Hình 1.14. Đường đi ánh sáng kính thích và phát xạ qua kính lọc lập phương trong
kính hiển vi huỳnh quang
Trong kính hiển vi huỳnh quang, gương lưỡng chiết (dichroic mirror) được sử
dụng để phân tách đường đi của ánh sáng kích thích và ánh sáng phát xạ.
Gương lưỡng chiết có tính chất phản xạ đặc biệt cho phép phân tách đường đi
của hai chùm ánh sáng. Mỗi gương lưỡng chiết có một giá trị bước sóng giới hạn, gọi
là giá trị bước sóng chuyển pha, mà ở bước sóng đó 50% ánh sáng truyền qua. Gương
sẽ phản xạ những ánh sáng có bước sóng nhỏ hơn giá trị bước sóng chuyển pha và
truyền qua ánh sáng có bước sóng lớn hơn giá trị này. Chính vì tính chất này mà
gương có tên gọi là lưỡng sắc hay 2 màu (dichroic, two color). Trong điều kiện lý
tưởng, bước sóng chuyển pha của gương lưỡng sắc được chọn ở giữa bước sóng kích
thích và phát xạ. Ánh sáng kích thích có bước sóng nhỏ hơn giá trị bước sóng chuyển
pha nên sẽ phản xạ trên bề mặt gương lưỡng sắc và tới vật kính. Ánh sáng huỳnh
quang có bước sóng lớn hơn giá trị bước sóng chuyển pha nên sẽ truyền qua gương
lưỡng sắc và đi tới thị kính hoặc hệ thống đầu thu (hình 1.13).
Trong kính hiển vi huỳnh quang có hai kính lọc (filter) được sử dụng cùng với
gương lưỡng sắc là: kính lọc kích thích và phát xạ.
Kính lọc kích thích (excitation filter): dùng để chọn lọc bước sóng kích thích,
kính lọc kích thích được đặt trên đường đi của ánh sáng kích thích và trước gương
lưỡng sắc . Kính lọc phát xạ: dùng để lọc ánh sáng phát xạ từ mẫu vật và loại bỏ dấu
vết của ánh sáng kích thích, kính lọc phát xạ được đặt ở dưới gương lưỡng. Ở vị trí
này, filter thực hiện cả hai chức năng là lọc ánh sáng phát xạ và loại bỏ bất kỳ dấu vết
của ánh sáng sử dụng để kích thích.

Gương lưỡng sắc được gắn lên trên kính lọc lập phương (filter cube). Những
kính lọc kích thích và phát xạ cũng thường được gắn với kính lọc lập phương . Kính
lọc lập phương này tạo điều kiện thuận lợi cho sự thay đổi của gương lưỡng chiết
trong sự định hướng với các kính lọc.
Hình 1.15. Cấu tạo của kính hiển vi huỳnh
quang[7] c. Ứng dụng
Kính hiển vi huỳnh quang thường được sử dụng rộng rãi trong các thực hành và
nghiên cứu y-sinh bởi sự đa dạng của các chất đánh dấu phát quang và do đó là sự đa
dạng của các tính năng của chúng. Kính hiển vi huỳnh quang còn có ứng dụng quan
trọng trong nghiên cứu cấu trúc vật liệu, có thể cho ta thấy ảnh rõ nét của những cấu
trúc siêu nhỏ.
Hình 1.16.Ảnh tế bào qua kính hiển vi huỳnh quang

1.3.4.3. Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần (total internal reflection
microcope - TIRM )
a. Nguyên lý
Hình 1.16.1.Nguyên lý phản xạ nội toàn phần
Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần sử dụng sóng biến dần ( evanescent wave )
(được tạo ra do phản xạ nội toàn phần của ánh sáng ở hai môi trường có chiết suất
khác nhau) để kích thích các phân tử nằm gần bề mặt phân cách giữa hai môi trường.
b) Cấu tạo
Hình 1.16.1. Cấu hình của kính hiển vi phản xạ nội toàn phần
Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần có vật kính được chế tạo đặc biệt với khẩu
độ số lớn và độ phóng đại cao để dẫn chùm tia kích thích (cấu hình epi) và thu ánh
sáng phát ra từ mẫu (hình 4.7.2.1 phải) khẩu độ số của vật kính dùng cho TIRFM

thường phải là ≥ 1,4 (ngâm trong dầu). Ngoài ra TIRFM còn có cấu hình sử dụng một
lăng kính đặt trên mẫu để tạo phản xạ toàn phần . Ánh sáng biến dần sẽ kích thích các
phân tử bề mặt phân cách phát quang, kính vật đặt dưới mẫu sẽ thu ánh sáng huỳnh
quang. Kính hiển vi TIRFM tạo ảnh có độ phân giải < 200 nm do khẩu độ số của vật
kính > 1.4 và độ sâu của trường biến dần < 200nm.
Hình 1.16. 2. Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần
c. Ứng dụng
Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần ứng dụng rộng rãi trong y sinh để nghiên
cứu cấu tạo bề mặt của tế bào, nghiên cứu cấu trúc bề mặt của vật liệu cứng….
Hình 1.17. Hình ảnh bề mặt tế bào dưới kính hiển vi phản xạ nội toàn phần

CHƯƠNG II
THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI ĐƠN PHÂN TỬ
Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu động học của các hạt đơn phân tử P-
glycoprotein (PGP) trong tế bào MDCKII. Do đó, trong phần thực nghiệm này,
chúng tôi sẽ trình bày các vấn đề liên quan đến việc chuẩn bị mẫu, như: nuôi cấy tế
bào ung thư MDCKII, tổng hợp các protein trong màng tế bào, đo đạc và quan sát các
phân tử protein trong màng tế bào,…Các thông số động học mà chúng tôi quan tâm
đó là: hệ số khuếch tán dịch chuyển, quãng đường dịch chuyển và vận tốc dịch
chuyển của các phân tử P-glycoprotein.
2.1. Chuẩn bị mẫu
Hình 2.1. Ảnh chụp một số đĩa thủy tinh dung để nuôi cấy tế bào
Trong phần này sẽ trình bày quá trình chuẩn bị mẫu để quan sát dưới kính hiển
vi quang học ở các chế độ khác nhau. Các mẫu được chuẩn bị từ việc lựa chọn dòng
dòng tế bào, nuôi cái tế bào,..Trong đề tài này, các tế bào được nghiên cứu từ dòng
Madin Darby Canine Kidney (MDCK II)[11]. Dòng này có nguồn gốc từ tế bào ung
thư thận của chó Cocker Spaniel và được phát hiện vào năm 1958 bởi S. H. Madin và
N.B. Dòng này thường được sử dụng như một mô hình của các tế bào biểu mô.
Chúng được nuôi trong đĩa petri (petri dish) có đáy là thủy tinh (hình 2.1).
2.1.1. Nuôi cấy tế bào P-glycoprotein
Để nuôi cấy được tế bào in vitro phát triển bình thường thì môi trường nuôi
dưỡng là rất quan trọng. Trong thí nghiệm của tôi, hợp chất nuôi dưỡng tế bào gồm:

89% minimum essential media (MEM), 1% pentrep, 10% serum de veau foetal
(SVF), và cuối cùng them geneticien nồng độ 3mg/ml. Trong các hợp chất này, SVF
đóng vai trò rất quan trọng. Nó là nhân tố kích thích quá trình tăng trưởng và tăng
sinh tế bào, kích thích tố, protein, các yếu tố gắn kết.Cũng giống như fibronectine, nó
còn góp phần tế bào bám dính tốt, điều này cần thiết cho sự phân chia tế bào và đóng
vai trò bảo vệ. Tất cả thao tác thí nghiệm đều trong điều kiện vô trùng. Các tế bào
tăng trưởng trong lò ấp ở 37° C và được bổ sung 5% khí CO2 trong quá trình tăng
trưởng.
2.1.2. Tổng hợp P-glycoprotein trong màng tế bào
Để quan sát được các P-glycoprotein, cách tốt nhất là cần đánh dấu chúng
với phân tử protein phát quang xanh lá (green fluorescent protein-GFP). Dưới kính
hiển vi huỳnh quang dễ dàng quan sát và hiện ảnh được các phân tử PGP nhờ sự phát
huỳnh quang của GFP. Chính vì lý do đó, chúng tôi cần tổng hợp các protein này.
Số lượng tế bào được tính toán cẩn thận trong một thể tích đĩa nuôi cấy. Sau làm thử
nghiệm và hiệu chỉnh tối ưu, trong 1ml chứa 5000 tế bào/cm2
được chọn để làm thí
nghiệm tổng hợp. Để tổng hợp protein trong màng tế bào, sodium butyrate (BS-
Na(C3H7COO)) được bổ sung. Đó là muối natri của axit butyric. Nó có tác dụng khác
nhau đối với tế bào động vật có vú trong nuôi cấy, bao gồm sự ức chế sinh sôi nảy
nở, cảm ứng sự khác biệt và cảm ứng hoặc ức chế biểu hiện gen. Để có chất lượng tốt
trong tổng hợp protein cần tối ưu hóa lượng BS được sử dụng.Trong thí nghiệm này,
tôi đã khảo sát hai thông số quan trọng là thời gian kích thích(thời gian tính từ lúc
thêm BS vào tế bào đến khi quan sát chúng dưới kính hiển vi) và nồng độ BS. Các
nồng độ BS được thêm vào lượng tế bào trên lần lượt là 0.1 mM, 0.5 mM, 1mM và 2
mM tương ứng với các thời gian kích thích lần lượt cho từng nồng độ 1h, 12h, 18h,
và 23h40 (bảng 2.1). Sau các khoảng thời gian. Các đĩa tế bào sau khi được tổng hợp
với các thời gian trên đều được quan sát dưới kính hiển vi tương phản pha và kính
hiển vi huỳnh quang để kiểm tra hình thái màng và sự phát huỳnh quang của nó. Tuy
nhiên, để có thể quan sát tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang thì môi trường tế bào
được thay bằng môi trường không phát quang. Đây là môi trường gồm
94%DMEMgfp-2 (20mg/l), 6% SVF và 0,5 ml (10mM) hepes trong điều kiện vô
trùng.
Bảng 2.1: Thời gian kích thích và nồng độ BS dung trong tổng hợp protein
Thời gian 1h 12h 18h 23h40
Nồng độ 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 0,1; 0,5; 1,0; 2,0

BS (mM)
Các kết quả về hiện ảnh dưới kính hiển vi tương phản pha, kính hiển vi huỳnh quang
và cường độ phát quang của tế bào sẽ được thảo luận chi tiết trong chương 3.
2.2. Cấu hình quang học kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần
max
NA
= arcsin n
lamkinh
Đốivới NA = 1, 45 và lamkinh
=1,58
ta tìmđược max = 72,78
n o
(2.1)
Hình 2.2. Cấu hình quang học của kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn
phần[10].
Một gương M di động và thấu kính L1 cho phép hội tụ laser kích thích tại mặt
phẳng tiêu điểm củavật kính (BFP-back focal plane) để tạo ra chùm sáng song song
đi vào vật kính chiếu đến mẫu với góc chiếu θ. Bằng cách điều chỉnh góc quay α của
gương M sẽ thay đổi được góc θ phù hợp đến giá trị tới hạn mà cho hiện tượng phản
xạ nội toàn phần ở mặt phân cách thủy tinh/nước.
2.3. Phương pháp theo dõi đơn phân tử P-glycoprotein trong tế bào MDCKII
Để quan sát rõ thấy sự chuyển động của các PGP trong màng tế bào MDCK II,
kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần là ứng viên sáng giá nhất. Bằng cách

quan sát dưới kính hiển vi này, các video được ghi lại, tiếp đến là sử dụng phương
pháp theo dõi đơn phân tử để theo dõi và xác định vị trí các phân tử đơn nhất[12-
13].Từ đó dùng phần mềm mở ImageJ và matlab để xử lý số liệu đo đạc và tính toán
các thông số động học.
2.3.1. Cách tiến cận
Cách tiếp cận được dựa trên chuyển động dịch chuyển Brownian như đã trình
bày trong chương 1. Các phân tử PGP được coi như những vật rắn nhỏ chuyển động
trong môi trường phức hợp (hệ số nhớt η(T)) của màng tế bào. Các phân tử protein
này có dạng hình cầu nên chúng ta quan tâm đến chuyển động dịch chuyển ngẫu
nhiên là chủ yếu. Theo lý thuyết, bình phương trung bình dịch chuyển trong không
gian 2 chiều được xác định từ công thức (1.14) ở chương 1
〈 2( )〉 = 4 (2.1)
Trong thực nghiệm, chúng ta dễ dàng đo được giá trị 〈 2( )〉 theo
〈 2( )〉 = 〈 2( )〉 + 〈 2( )〉 (2.2)
ở nhiệt độ phòng nhờ vào thuật toán miễn phí của nhóm MOSAIC[12]. Trong
đó < 2( ) >và< 2( ) >là bình phương trung bình dịch chuyển theo phương x và phương y theo thời gian.
2.3.2. Quy trình theo dõi một phân tử trong chất lỏng
Theo dõi một phân tử duy nhất là một công nghệ theo dõi sự chuyển động của
từng phân tử phát quang dựa trên một hệ ghi ảnh nhanh. Chúng ta lưu lại các quỹ đạo
của từng hạt đã được đánh dấu, điều này cho phép nhận được tín hiệu/nhiễu rất tốt và
do đó xác định được vị trí của hạt cần theo dõi. Đây là một phương pháp rất mới đang
được phát triển để hiện ảnh các quỹ đạo từng phân tử huỳnh quang riêng lẻ có kích
thước rất bé (do đó khuếch tán rất nhanh) hoặc là hiện ảnh quỹ đạo các phân tử có
nồng độ lớn [14]. Công nghệ này được đánh giá rất cao trong lĩnh vực nghiên cứu
động học các phân tử protein trong màng tế bào sinh học. Như đã trình bày trong
phần trên, kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần là ứng viên sáng giá nhất
cho hiển ảnh protein trong màng tế bào với tín hiệu/nhiễu cao. Để thuận lợi, chúng tôi
ghi một video gồm 100 ảnh nhờ một camera rất nhanh và nhạy EM-CCD. Khoảng
thời gian giữa 2 ảnh là 0,05s. Quy trình của công nghệ theo dõi đơn phân tử thông
thường bao gồm 4 bước (hình 2.2):

Hình 2.3.Sơ đồ minh họa quy trình theo dõi đơn phân tử
a) Ghi các video chuyển động của các PGP dưới kính hiển vi huỳnh quang
phản xạ nội toàn phần
b) Xác định vị trí của các protein
c) Theo dõi sự di chuyển của protein
d) Phân tích số liệu
Dưới đây sẽ trình bày chi tiết từng bước của phương pháp theo dõi đơn phân tử
2.3.2.1. Ghi một video dưới kính hiển huỳnh quang phản xạ nội
toàn phần (TIRFM)
Hình 2.4.Video gồm 100 ảnh của 1 tế bào MDCKII dưới kính hiển vi huỳnh
quang phản xạ nội toàn phần. Các PGP là các đốm sáng trong ảnh
Như phần trên đã trình bày, để quan sát các PGP thì chính là quan sát các phân
tử GFP đã được liên kết với PGP. Chúng ta biết rằng, các phân tử GFP cho tín hiệu
nhấp nháy và bị dập tắt huỳnh quang rất nhanh (trong vài giây).. do đó trong các phép
thí nghiệm tôi đã làm với các thời gian thu (acquisition time) của camera 0,01s; 0,03s
và 0,05s. Tuy nhiên, thời gian thu camera 0,01s và 0,03s là không đủ để xác

định vị trí của các phân tử. Vì vậy thời gian 0,05s được chọn để ghi nhận các video
chuyển động của phân tử PGP.
2.3.2.2. Xác định các vị trí các PGP trên ảnh
Vị trí của mỗi đốm sáng huỳnh quang trên ảnh sẽ là tương ứng với một vị trí
của phân tử PGP. Một chuỗi các ảnh được ghi lại bởi camera và được phân tích bởi
phần mềm ImageJ bằng cách sử dụng công cụ plug-in de MOSAIC [15]. Có một số
thông số của phần mềm ImageJ plugin cần được lựa chọn phù hợp để phát hiện ra các
hạt, như: radius of particle (pixel) – đây là bán kính của vết sáng trên ảnh chứ không
phải bán kính thực của hạt nano; cutoff- số điểm để phân biệt các hạt; percentile- để
xác định các điểm ảnh sáng được coi như là hạt.
2.3.2.3. Theo dõi sự dịch chuyển các phân tử protein
Để xác định vị trí và theo dõi các phân tử (hay các hạt) trong một video, phần
mềm mã nguồn mở ImageJ Pluginđã được sử dụng. Bằng phần mềm này dễ dàng tìm
quỹ đạo chuyển động của từng phân tửtheo thời gian. Dưới đây là trình bày tóm tắt
cách sử dụng plugin/Mosaic/Particles Tracker in 2D/3D trong ImageJ:
➢
Tải và mở phim trong ImageJ
Một quỹ đạo của hạt được xác định khi liên kết các điểm trong từng ảnh. Trong
báo cáo này, chúng tôi xử lý video (phim) có số lượng là 100 ảnh ứng với khoảng
thời gian giữa 2 ảnh là 0,05 giây. Khoảng thời gian giữa các ảnh tiếp theo cũng sẽ
tăng dần theo số lượng các ảnh: ∆tn ảnh=0,05 x (số ảnh tiếp theo). Thời gian đó, gọi là
thời gian trôi của phân tử. Ký hiệu là , đơn vị giây (s).
Mở video/Import -> Image Sequence, ... từ các tập tin.
Hình 2.5. Mở video
➢
Chọn các thông số phát hiện các hạt và xem trước (preview detected)
Lựa chọn Plugins
→
Mosaic
→
Particle Tracker 2D/3D

nội toàn phần với thông số: radius=3, cutoff=3, percentile=0,1
Hình 2.7.Ảnh PGP trong tế bào MDCKII dưới kính hiển vi huỳnh quang phản xạ
nội toàn phần với thông số: radius=3, cutoff=3, nhưng với percentile=0,1(trái) và
percentile=0,4 (phải)
Bằng cách thay đổi các thông số radius, cutoff, percentile và xem trước để lựa
chọn các giá trị thích hợp, từ đó cho kết quả phát hiện tối đa các đốm sáng (phân tử).
➢
Xem kết quả
Sau khi hoàn thành việc theo dõi hạt, cửa sổ kết quả sẽ được hiển thị Nhấp vào
Visualize all Trajectories (quan sát tất cả các qũy đạo).

Hình 2.8.Quan sát tất cả các quỹ đạo của PGP. Phần đóng khung mầu
xanh được phóng to đến hình bên phải để thấy rõ hơn các quỹ đạo dịch
chuyển của PGP
Từ đây chúng ta có thể lấy ra được các thông tin chi tiết cho từng quỹ đạo. Ví
dụ dưới đây là hiển thị chi tiết cho quỹ đạo 1(trajectory 1) của PGP được quan sát

Hình 2.9. Thông tin quỹ đạo xuất ra từ thuật toán của Mosaic[15]trong không gian 2
chiều
Từ bảng kết quả này cho ta những thông tin quan trọng để xác định các thông số
động học cần khai thác. Trên hình 2.10, cột trajectory là chỉ các quỹ đạo tương ứng
với mỗi phân tử được phát hiện. Cột Frame bao gồm các hàng số liệu đại diện cho
các khung hình của quỹ đạo đó và chính là tương ứng với các ảnh trong video, nó bắt
đầu từ 0-nghĩa là nếu ta chọn trục z dọc theo thứ tự các ảnh thì Frame 0 sẽ là gốc tọa
độ (xem hình 2.2). Cột x và y là tọa độ phụ thuộc vào thời gian (t) tương ứng của
phân tử (khung hình) tại các ảnh theo hai trục x và y trong mặt phẳng (x,y).Như vậy,
ứng với mỗi vị trí (hay mỗi Frame hoặc mỗi ảnh) sẽ xác định được tọa độ x(t) và y(t)
(có đơn vị là pixel) của phân tử (trên ảnh là đốm sáng), từ đó dễ dàng tính được bình
phương trung bình dịch chuyển theo phương x và phương y. Hình 2.11 thể hiện các
tọa độ x và y tạo thành các điểm ảnh ở mỗi khung hình (frame) cho 1 quỹ đạo của
phân tử.

Hình 2.10. Các tọa độ x và y tạo thành các điểm ảnh ở mỗi khung hình (frame)cho 1
quỹ đạo của phân tử
➢
Nối liên kết quỹ đạo của các phân tử
Hình 2.11.Quỹ đạo chuyển động của 1 PGP theo thời gian
Bước này sẽ thực hiện việc liên kết (hay nối) các điểm tương ứng các ảnh với
khoảng cách giữa các ảnh theo thời gian (t). Từ đó, xác định được quỹ đạo chuyển
động của hạt (hình 2.12).
2.3.2.4 Phân tích dữ liệu
Từ các bước đã thực hiện ở trên, chúng ta có một cơ sở dữ liệu để phân tích và tính
toán các đại lượng cần thiết.Từ đó tính được bình phương trung bình dịch chuyển từ số
liệu thực nghiệm trong không gian 2 chiều ( r 2
(t ) = x 2
(t ) + y 2
(t ) ) theo tất cả các
Frame nhờ vào phần mềm matlab (chương trình code được trình bày

trong phần phụ lục).Trong đề tài này, tôi đã thực hiện đo đạc và phân tích thống kê
trên một số tế bào và mỗi tế bào phân tích hàng chục phân tử riêng lẻ. Sau đó kết hợp
với lý thuyết (phương trình 1.14) để xác định hệ số khuếch tán của từng phân tử PGP.

CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong chương này sẽ trình bày về kết quả tính toán các thông số động học như:
hệ số khuếch tán, vận tốc dịch chuyển, quãng đường dịch chuyển và cường độ phát
quang của đơn hạt protein. Trước tiên, các kết quả về điều kiện tối ưu để tổng hợp
protein và hình thái về màng tế bào được thảo luận.
3.1. Kết quả về tổng hợp protein trong màng tế bào
Như chương 2 đã trình bày, các tế bào MDCKII được nuôi cấy và tổng hợp
protein PGP-GFP (GFP đánh dấu trên bề mặt của PGP) trong màng với các thông số
thay đổi là thời gian kích thích và nồng độ BS ( bảng 2.1) đã được khảo sát dưới kính
hiển vi tương phản pha và kính hiển vi huỳnh quang. Đây là các quan sát sơ bộ để
đánh giá cường độ phát quang phụ thuộc vào các nồng độ BS khác nhau (0,1; 0;5; 1;
và 2mM) và thời gian kích thích khác nhau (1h, 12h, 18h và 23h40) như thế nào. Từ
đó tìm ra các điều kiện và quy trình tối ưu cho tổng hợp protein PGP-GFP. Hình 3.1
là ảnh tế bào MDCKII dưới kính hiển vi tương phản pha và kính hiển vi huỳnh quang
ở các thời gian kích thích và nồng độ BS khác nhau.

Hình 3. 1. Một chuỗi các ảnh tế bào MDCKII được chụp cùng 1 vị trí (chồng nhau)
dưới kính hiển vi tương phản pha và huỳnh quang tương ứng với các thời điểm khác
nhau 1h; 12h; 18h và 23h40 cho 4 nồng độ BS khác nhau: a) 0,1 mM; b) 0,5 mM;
c) 1mM và d) 2mM
Từ những kết quả thể hiện trên hình ảnh này, chúng ta có thể dễ dàng tính toán
cường độ tương ứng được thể hiện trong hình 3.2. Trong hình này, chúng ta có thể
thấy cường độ huỳnh quang của hai nồng độ sodium butyrate (BS) là 1mM và 2mM
lớn hơn hơn hai nồng độ 0,1mM và 0,5mM, nhưng hầu hết các tế bào của chúng
đang lan rộng. Nghĩa là chúng không khỏe mạnh. Vì vậy, tôi đã chọn nồng độ BS là
0,5 mM để nghiên cứu với thời gian kích thích là 18h (thời gian tính từ lúc thêm BS
và môi trường tế bào).Sau 18h ở nồng độ này của BS, tế bào cũng có hiện tượng lan
rộng.

Hình 3. 2. Cường độ huỳnh quang của các tế bào MDCKII với các nồng
độ BS (0,1mM; 0,5mM; 1mM và 2mM) tại các thời điểm khác nhau
Trong thực tế, các tế bào MDCKII cần khoảng 4h để BS xâm nhập vào màng tế bào
và kích thích để tham gia vào quá trình tổng hợp protein. Vì vậy, chúng tôi đã tìm
thấy một quy trình tối ưu cho chuẩn bị mẫu như trong hình 3.3.
Hình 3. 3. Quy trình tổng hợp protein PGP-GFP trong màng tế bào MDCKII
3.2. Hình thái màng tế bào MDCKII
Với các điều kiện nuôi cấy tế bào và quy trình tổng hợp protein như trên, nhìn chung
các tế bào khi nghiên cứu có sức khỏe tốt. Các quan sát dưới kính hiển vi tương phản
pha, kính hiển vi tương phản giao thoa và kính hiển vi huỳnh quang cho thấy rõ điều
này.

Hình 3. 4. Hình thái màng tế bào MDCKII. a) Ảnh chụp dưới kính hiển vi huỳnh
quang và b) là ảnh kính hiển vi tương phản giao thoa tương ứng, c) ảnh chụp
dưới kính hiển vi tương phản pha và d) là ảnh chụp dưới kính hiển vi trường sáng.
Trong hình 3.4, chúng ta thấy rằng các tế bào khỏe mạnh bình thường và
chúng bám dính tốt trên bề mặt đĩa thủy tinh (hình c và d). Trong ảnh tương phản pha
(hình c), các đối tượng trong suốt (các tế bào và vi sinh vật,..) tạo ra sự thay đổi pha
trong điện trường (trong xấp xỉ đầu tiên và không hấp thụ). Ở các ảnh này, chúng ta
thấy rõ đường bao của tế bào, tuy nhiên cấu trúc bên trong ít được bộc lộ. Các chi tiết
về hình thái màng tế bào được hiển thị rõ nét hơn trong ảnh tương phản giao thoa
(hình 3.4b). Đây là một phương pháp để phát hiện các gradient pha để chuyển đổi
chúng thành các biến thể cường độ. Do đó chúng ta có thể quan sát hình thái tế bào
chi tiết hơn. Sự phát quang của tế bào còn thể hiện rõ nét trong ảnh huỳnh quang ở
hình 3.4a tương ứng chồng khít ảnh trong hình 3.4b. Trên cùng một kính hiển vi
huỳnh quang này có thể tích hợp các chế độ quan sát ở các điều kiện khác nhau giúp
cho việc quan sát tế bào được chi tiết hơn.

3.3. Đơn phân tử protein dưới kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn
phần (TIRFM)

Nghiên cứu động học các phân tử protein trong tế bào sống bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử.doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên cứu động học các phân tử protein trong tế bào sống bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử.doc

Similar to Nghiên cứu động học các phân tử protein trong tế bào sống bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử.doc (13)

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói ☎☎☎ Liên hệ ZALO/TELE: 0973.287.149 👍👍

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói ☎☎☎ Liên hệ ZALO/TELE: 0973.287.149 👍👍 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên cứu động học các phân tử protein trong tế bào sống bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử.doc