2. األسس المستخدمة في تعريف البكتيريا
أهم األسس المستخدمة في تعريف وتصنيف البكتيريا هي:
Macroscopic النظرية الظاهرية 1-الصفات
morphology
ومنها: الشكل العام للمستعمرة البكتيرية (الحجم – القوام-
الصبغات- سرعة وطبيعة النمو في البيئة).
Microscopic 2- الصفات الظاهرية المجهرية
morphology
ومنها - الشكل العام للخلية البكتيرية (عصوية، كروية،
حلزونية...الخ)
•صبغة جرام.
•صبغة مقاومة لألحماض.
•باإلضافة الى وجود األسواط وموضعها، األهداب، سمك الجدار
3. 3- الخصائص البيوكيميائية والفسيولوجية: •
وتشمل الخصائص اإلنزيمية مثل: •
تحليل السكريات •
القدرة على تحليل بعض المركبات الكيميائية و البروتينات. •
اإلستجابة لتأثير المضادات الحيوية (حساسة، مقاومة). •
4- التحليل الكيميائي: كتحليل مكونات الجدار الخلوي والغشاء •
الخلوي.
5- التحليل المصلي (السيرولوجي): التفاعل بين األجسام المضادة •
Antibodiesواألنتجين Antigensلتعريف األنواع البكتيرية.
6- تحليل الحامض النووي: دراسة تعاقب وترتيب النيوكليوتيدات •
في الحمض النووي.
4. • تقسيم البكتيريا
الهدف من التقسيم: •
لتسهيل الدراسة. •
للتعريف والتمييز بين األنواع واألجناس. •
لإلستفادة منها في المجاالت التطبيقية. •
تقسيم (نظام بيرجي) وهو مفتاح تقسيمي...(شكل البكتيريا الظاهري، صبغة •
جرام، األهداب....الخ).
النظام المبني على تقسيم البكتيريا الى مجموعات اعتماداً على مقارنة •
وترتيب القواعد النيتروجينية للحمض النووي RNAوفي هذا التقسيم فقد تم
تقسيم البكتيريا الى احدى عشر فرع مستقل في شجرة Eubacteriaومنها:
أ- البكتيريا الحقيقية الموجبة لصبغة جرام ,(Bacillus •
)Actinomycetes
ب- البكتيريا الحقيقية السالبة لصبغة جرام )(Pseudomonous •
جـ - البكتيريا التمثيلية المحتوية على صبغة الكلوروفيل أ •
Cyanobacteria
د- البكتيريا الحلزونية Spirochetes •
هـ ـ البكتيريا المتبرعمة. •
5. التقسيم المبني على تحليل الحامض النووي الريبوسومي •
rRNAحيث تم تقسيم البكتيريا الى ثالث مجموعات هي:
البكتيريا القادرة على تصنيع الميثان. •
البكتيريا المحبة للملوحة. •
البكتيريا المحبة للحرارة العالية. •
6. • نمو وتكاثر البكتيريا
• بيئة النمو:- زيادة عدد الخاليا
• زمن الجيلي : - زمن انقسام الخاليا البكتيريا إلى الضعف.
7. • االنقسام الثنائي البسيط
• تبدأ خلية البكتيريا في النمو بالدالة اآلسية Exponentially
(جدول 1)،
جدول( 1 ) تكاثر الخاليا البكتيرية عن طريق التقسيم الثنائي
عدد الخاليا بدالة اآلسية عددددددددددددددددددد قوة الدالة
اآلسية الخاليا
* 20 1
** 21 2
**** 22 4
******** 23 8
**************** 24 61
******************************** 25 23
8. • وتنقسم كل خلية بطريقة االنقسام الثنائي البسيط، بمجرد
نقلها على بيئة مغذية الشكل التالي
9. مراحل النمو البكتيريا
تنقسم مرحلة نمو البكتيريا إلى أربعة مراحل التالية
1. مرحلة التأقلم
2. مرحلة النمو
3. مرحلة الثبات أو األزمة
4. مرحلة الموت
10. • مرحلة التأقلم Lag Phaseويتميز بـالتالي:
1. مرحلة األقلمة على الظروف الجديدة
2. بداية التغذية
3. ال يوجد تكاثر الخاليا وإن وجد فهو قليل جدا
11. ( Exponential (Log) Phaseومن أهم مميزاتها: • مرحلة النمو
أنشط المراحل •
توفر الغذاء والبكتيريا متأقلمة على الظروف وفي قمة النشاط والتكاثر. •
المنحنى تصاعدي رأسي بسرعة تزايدية. •
عدد الخاليا الجديدة أكثر بكثير من عدد الخاليا الميته. •
12. مرحلة الثبات Stationary Phaseويتميز بـالتالي : •
1. عدد الخاليا الميتة = عدد الخاليا الجديدة.
2. المنحنى يأخذ الشكل األفقي الثابت
3. تدهور الظروف في المستعمرة نتيجة :
قلة الغذاء نتيجة المنافسة •
انخفاض األكسجين •
تراكم االمخلفات •
تغيير في درجة pH •
13. Decline (Death) Phaseويتميز • مرحلة الموت
هذا الطور بـالتلي :
• المنحنى يتجه الى أسفل.
• زيادة عدد الخاليا البكتيرية الميته في المستعمرة.
• زيادة سوء الظروف وقلة الغذاء.
14. • أهمية دراسة منحنى النمو:
تفيد دراسة منحنى النمو البكتيري في التعامل مع البكتيريا ومعرف
أوج نشاطها وأطوار نموها المختلفة حيث يفيد ذلك في
1. مجاالت المقاومة و/ أو المكافحة
2. اإلصابات المرضية
3. فساد األغذية الميكروبي والتسمم.
• عامة مرحلة النمو هي أكثر المراحل حساسية وعرضه للموت
بفعل الحرارة أو المواد الكيميائية.
15. يمكن حساب عدد خاليا البكتيريا في أي مرحلة من مراحل •
النمو المختلفة باستخدام المعادلة التالية:
1(N2)2n=N •
1 =Nالعدد الكلي للخاليا في نقطة ما من المنحنى. •
2 =Nالعدد المبدئي للخاليا البكتيرية. •
= nعدد األجيال •
=2nعدد الخاليا في الجيل الواحد. •
16. • مثال: تقدير عدد خاليا بكتيريا النامية في طبق بتري الذي
يحتوى على بيئة مالئمة للنمو، حيث ترك الطبق لمدة 4
(4×06 =042) ساعات في ظروف مناسبة (حرارة، رطوبة
وغيرها) للتكاثر وكان العدد المبدئي لها هو 01 خاليا والزمن
الجيلي لها هو 02 دقيقة للجيل الواحد.
• عدد الخاليا الكلي لخلية واحدة بعد 4 ساعات = 4096 = 212 =2n
خلية.
• عدد الخاليا الكلي للعشر خاليا = 01 40960 = 4096 Xخلية
بكتيرية.
17. طرق عد البكتيريا
ENUMERATION OF BACTERIA
يعتبر التعداد الكمي للنمو البكتيري أساسا للكثير من الدراسات األساسية
والتطبيقية ومن أهمها :
1. الخاصة بتحضير اللقاحات البكتيرية
2. قياس مدي تلوث وصالحية مياه اآلبار بالمجاري
3. تقيم صالحية وخلو المواد الغذائية من التلوث البكتيري .
• هناك العديد من الطرق التي بواسطتها يمكن تعداد النمو البكتيري
فهناك
• التعداد الكلي للبكتيريا التعداد الكلي للبكتيريا الحية والميتة في
العينة المراد دراستها .
• أو تعداد البكتيريا الحية فقط Viable Countوالتي لها قدرة علي
االنقسام والتكاثر .
18. • التعداد المباشر للخاليا باستخدام الشرائح :
• يمكن تعداد الخاليا البكتيرية بلطخة مصبوغة كما في طريقة بريد
Breedالمستخدمة لتعداد البكتيريا بعينات الحليب .
1. يتم فرد 10.0 مل من العينة في مساحة 1سم مربع علي
شريحة زجاجية
2. وتصبغ اللطاخة
3. ويتم تعداد البكتيريا تحت المجهر بناء علي المعادلة
التالية:
4. عدد الخاليا في 1مل = عدد المجاالت المجهرية في 1سم
مربع xمتوسط عدد الخاليا في كل مجال . 100 x
5. قد تم عملية الضرب في 001 ألنه تم فرد فقط 10.0 مل
من العينة بالشريحة .
6. ومن عيوب هذه الطريقة عدم التوزيع المتجانس للخاليا
أثناء عملية الفرد والمسح علي الشريحة
19. • طريقة تحضير اللطخة البكتيرية
الهدف من تحضير اللطخة:- هو تحضير غشاء رقيق •
متجانس من البكتيريا النامية على شريحة زجاجية، ثم
إضافة صباغات معينة لصبغها والكشف عليها تحت
المجهر.
ومن المعروف بأن البكتيريا عديمة اللون، ولتحديد نوعية •
خالياها، يجب إجراء عملية صبغها بأحد الطريقة التالية:-
تحضير اللطخة البكتيرية. •
إضافة بعض األصباغ إلى اللطخة لتحديد نوعيتها من ناحية •
سالبة أو موجبة لصبغة الجرام.
20. طريقة التحضير
تنظف الشريحة الزجاجية جيدا ، بالماء والصابون، وتجفف.
1. تمسك الشريحة من إحدى طرفيها؛ وترسم دائرة قطرها
5.1 سم، على الوجه األسفل من الشريحة.
2. توضع قطرة من الماء على وجه الشريحة المرسوم عليها
الدائرة بداخلها، لغرض عمل لطخه بكتيرية.
3. تعقم عقدة الحلقية( اللوبي) ، في نهاية اإلبرة الناقلة ،على
لهب موقد بنزن،حتى درجة االحمرار،وتبرد لمدة 01
ثواني.
4. تؤخذ كشطة من البيئة البكتيرية، بعقدة اإلبرة المعقمة.
21. 6. خلط الكشطة بالماء، داخل الدائرة على سطح.
7. بعد ذلك تعقم العقدة المعدنية، مرة أخرى.
8. تعمل لطخه بكتيرية من البيئة السائلة، على شريحة
أخرى،
9. بحيث يكون حجمها حجم العقدة المعدنية مرتين إلى ثالثة
مرات( وفي كل مرة يجب تعقيم العقدة وسلكها)، وتنقل
إلى داخل الدائرة، مع توزيعها فيها توزيعا جيدا.
01. تعقم الحلقة مرة أخرى.
11. تترك اللطخة لتجف، عند درجة حرارة الغرفة، دون نفخ
أو إمرار الهواء عليها.
21. تثبت اللطخة بإمرار الشريحة على اللهب مرتين أو ثالثة
مرات.
22. • صبغ اللطخة البكتيرية:
تعتبر الصباغات Dyesالتي تصبغ البكتيريا مواد كيميائية، أما أن تكون •
1. حامضية مثل :- ِ Fuchsinو Eosinالتي تتفاعل مع المكونات
القاعدية في الخلية مثل:- سيتوبالزم،
2. أو قاعدية مثل سفرانين أو البلورات البنفسجية Crystal violetالتي
تتفاعل مع مكونات الخلية الحامضية.
يتم تحضير اللطخة كما هو موضح في الشكل •
وضع الشريحة على حامل الصبغ (أو تمسك بملقاط معدني). •
تغمر اللطخة بأزرق المثيلين، لمدة 03 – 06 ثانية. •
تغسل الشريحة بالماء المقطر، بعناية إلزالة الصبغة الزائدة، بواسطة أنبوب •
قنينة الماء المقطر.
تجفف اللطخة برفق، بورق ماص للرطوبة، وتترك لتجف. •
23. • فحص اللطخة تحت المجهر
تفحص اللطخة المصبوغة، تحت المجهر بواسطة عدسة •
قوتها 01 ، Xوبعدها تفحص بالعدسة الزيتية التي قوتها
001.X
عند الفحص بالعدسة الشيئية (الزيتية)؛ يوضع الزيت •
مباشرة على اللطخة، دون غطاء زجاجي رقيق.
تسجل المالحظات مع الرسم أو التصوير، لكل ما يشاهد •
تحت المجهر.
يجفف الزيت من العدسة الشيئية، بأوراق خاصة بذلك. •
يرجع المجهر داخل صندوقه، أو المكان المناسب له. •
تنظف الشرائح جيدا، ويتخلص الموجود الزيت من عليها، •
وتحفظ في الصندوق المخصص لحفظها.
24. • صبغ البكتريا بصبغة جرام
• اكتشف هذه الطريقة هانس جرام في 4881، عندما الحظ أن
البكتيريا تفقد لون الصبغة، عند التخلص من الزائد منها.
• وتستعمل هذه الطريقة في تشخيص وتصنيف البكتيريا، وتقسيمها
إلى مجموعتين، سالبة ، وموجبة لصبغة الجرام. ويرجع الفرق بين
الصفتين الموجبة والسالبة، لمكونات الجدار الخلوي البكتيري.
1. وتعتمد هذه الطريقة على أربعة خطوات هي:-
2. استخدام الصبغة الرئيسية ( ،)Crystal violetلصبغ جميع
البكتيريا باللون البنفسجي.
3. يستخدم األيودين ،Iodineلزيادة الروابط األيونية بين الصبغة
الرئيسية والبكتيريا.
4. يستخدم الكحول األثيلي، أو األسيتون كمادة مزيلة للصبغة من بعض
البكتيريا، بينما تحتفظ البعض منها بلونها.
5. تستخدم مادة السفرانين ،Safraninفي صبغ البكتيريا التي فقدت
صبغتها بالكحول أو األسيتون، باللون األحمر.
25. • نظرية آلية صبغة الجرام :
تعتمد هذه النظرية على النقاط التالية:- •
تختلف البكتيريا لتقبلها الصبغة الرئيسية والصبغة الثانوية. •
جدار الخلية الموجبة لصبغة الجرام؛ أكثر سمكا من جدار •
خلية البكتيريا السالبة لصبغة الجرام ، من حيث التركيب
الكيميائي.
يحتوي جدار البكتيريا الموجبة لصبغة الجرام ،على طبقة •
ً
سميكة من بيبتدوجلوكان ، أكثر سماكة من جدار البكتيريا
السالبة لصبغة الجرام .
26. وبناء على النظرية، يمكن تفسير آلية الصبغة السالبة أو الموجبة •
لصبغة الجرام كالتالي:-
يحتوي جدار البكتيريا الموجبة لصبغة الجرام، على طبقة سميكة من •
بيبتيدوجلوكان ( متعدد السكريات مرتبطة مع البيبتيدات)، التي يسبب
لها الكحول إزالة وانكماش جدارها،
بحيث يخفض من معدل فقد الصبغة الرئيسية، ومن ثم تصبغ باللون •
األساسي البنفسجي.
يحتوي الغشاء الخارجي، لجدار بكتيريا السالبة لصبغة الجرام، على •
طبقات محتوية على البروتين، ومتعدد السكريات ودهون مرتبطة بعديد
السكريات، وطبقة غير سميكة من بيبتيدوجلوكان، محاطة بغشاء
خارجي، ومن تم يقوم الكحول بإزالة، أو إذابة الدهون، مما يزيد من
فقد الصبغة األساسية ،
ويتلون جدارها بلون الصبغة الثانوية (األحمر). •
27. طريقة العمل
• يجب تحضير اللطخة البكتيرية من بيئة حديثة عمرها أقل
من 42 ساعة.
– تنظف ثالث شرائح تنظيفا جيداً.
– يرسم دائرة على السطح السفلي، على كل شريحة من الشرائح
الثالثة ،مع كتابة أسماء البيئات على كل منها.
– تحضر لطخة لكل من البيئات، بالطريقة التي سبق شرحها.
28. طريقة الصبغ وهي كالتالي:- •
تغمر اللطخة بصبغة ،Crystal violetوتتركها لمدة نصف •
دقيقة.
تغسل الشريحة بعناية بالماء المقطر، لمدة 2 ثانية، بطريقة غير •
المباشرة فوق اللطخة ( عدم تسليط الماء مباشرة على اللطخة).
بدون تجفيف الشريحة، تغمر •
اللطخة بمحلول اليود لمدة دقيقة. •
بدون غسيل الشريحة، يضاف 59% كحول إثيلي إلى الشريحة، •
ويترك لينساب على اللطخة، لمدة ما بين 01- 02 ثانية، إلى حين •
توقف خروج كميات كبيرة من الصبغة األساسية (غالبا بعد بضع
ثوان)،
وتعتمد مدة إزالة الكحول على العوامل كثيرة، أهمها سمك •
اللطخة، والخبرة العملية في تحضير اللطخة وصبغها.
29. تغسل الشريحة مباشرة بالماء المقطر، لمدة دقيقتين. •
تضاف الصبغة الثانوية السفرانين، وتترك لمدة 02 ثانية. •
تغسل الصبغة الزائدة بالماء المقطر، لمدة 2 ثانية، وتجفف •
بورق نشاف.
تترك لتجف. •
تفحص الشريحة بالمجهر تحت العدسات المختلفة، وتسجل •
المالحظات
31. يمكن كذلك تعداد الخاليا البكتيرية باستخدام شرائح مجهرية •
متخصصة مثل شريحة بتروف هوسر Petroff Hausser
أو شريحة هلبر. Helber
استخدام هذه الشرائح يعد من أدق الطرق المستخدمة •
للتعداد الكلي للخاليا البكتيرية , وتمتاز بأنها سريعة
وسهلة ويستخدم المجهر ذو األطوار المتباينة أو ذو الحقل
المظلم
أو بتخفيف نسبة الضوء بالمجهر الضوئي في عملية •
التعداد
تحتوي هذه الشرائح علي 52 مربع كبير وكل مربع مقسم •
إلى 61 مربع
ويتم هذه صغيرة مساحة كل منها 004/1 مم مربع •
تغطيتها بشريحة زجاجية رقيقة coverslip
تبعد 05/1 مم من سطح الشريحة وبالتالي يصبح حجم •
المربع الواحد :
32. • 1 /004 1/20000 = 1/50 xمم مكعب
= 1/ 00000002 سم مكعب .
• التعداد الكلي للخاليا في كل 1 مل من العينة =
متوسط عدد الخاليا x 20000000 xمقلوب عامل
التخفيف .
33. • من عيوب هذه الطريقة عدم تمييز الخاليا الحية من
الميتة .
• التعداد البكتيري باستخدام األجهزة اإللكترونية
: Electronic Countersمثل عداد المستعمرات
اإللكتروني electronic colony counterالذي
يقوم بعملية التعداد للمستعمرات البكتيرية بطبق
االستنبات ,
• وجهاز نفلومتري nephlometryلتعداد الخاليا
البكتيرية بالبيئات السائلة .
34. لسهولة التعداد يتم عد المستعمرات البكتيرية بواسطة عداد •
المستعمرات في األطباق التي تنتج ما بين 52- 052 مستعمرة .
التعداد بطريقة ميلز وميزرا : Miles and Misra Method •
طريقة التوزيع الطبقي.
قياس درجة التعكير Turbidityتعتمد افتراضية هذه الطريقة علي •
أن زيادة درجة التعكير تدل علي زيادة كمية النمو ( انخفاض كثافة
األشعة الضوئية النافذة خالل تلك النمو ) .
وتقاس درجة التعكير باستخدام مقياس ضوئي طيفي •
spectrophotometerإال إن هذه الطريقة يصعب إتباعها في حالة
الخاليا البكتيرية التي تفرز صبغات بالبيئة بدرجة واضحة .
وكذلك يمكن قياس درجة التعكير باستخدام رسم بياني أو جداول •
معينة Browns Standardsوالتي توضح عدد البكتيريا بالنسبة
لكل درجة من درجات التعكير .
35. التعداد بتقدير الوزن الجاف للخاليا البكتيرية : والتي •
تستخدم في أغراض البحوث والدراسات , ويتم فيها غسل
الخاليا البكتيرية النامية بكميات كبيرة من أثار وبقايا
المستنبت باستخدام الماء المقطر المعقم وتجفف وبذلك تفقد
المكون الرئيسي وهو الماء .
تقدير النيتروجين الكلي بالخاليا : حيث يعتبر النيتروجين •
هو أهم مكونات البروتين واألحماض النووية ولذا تقدير
النيتروجين الكلي بالعينة يكون متالزما مع كمية النمو .
متوسط نسبة النيتروجين في الوزن الجاف للخاليا البكتيرية •
يتراوح حوالي 41% وتختلف هذه النسبة باختالف أنواع
وأجناس البكتيريا وكذلك تختلف بالنسبة للنوع الواحد من
البكتيريا تحث ظروف استنباتية مختلفة .
تستخدم هذه الطريقة أيضا في األبحاث . •
36. قياس النشاط الكيميائي الحيوي للبكتيريا : وتعتبر طريقة •
غير مباشرة والتي يتم فيها قياس متغير معين بالبيئة مثل
تخمر سكر الجلوكوز بواسطة بكتيريا معينة بمستنبت
معين وفي زمن معين .
كمية الحامض التي تنتج من تخمر الجلوكوز تتناسب مع •
كمية النمو البكتيري .
37. • عد البكتيريا الكلية في عينةالحليب بطريقة التخفيفات :
• طريقة اخذ عينة الحليب:
• طريقة العمل:
1. ترج عينة الحليب جيدا 52 مرة (وذلك لضمان توزيع البكتيريا في
العينة)
2. ينقل بماصة معقمة 1 مل من عينة الحليب إلى أنبوبة محتوية على 9
مل ماء مقطر معقم فيصبح التخفيف 1/01
3. يرج التخفيف1/01 جيدا وبواسطة ماصة معقمة جديدة ينقل 1 مل
إلى 2 طبق بتري معقم يمثل التخفيف01/ 1 وبنفس الماصة ينقل
1مل أخرى من األنبوبة 1/01 إلى أنبوبة ماء مقطر معقم 9مل
لنحصل على التخفيف 1/001
4. يرج التخفيف 1/001 جيدا وبواسطة ماصة معشقة جديدة ينقل 1
مل إلى 2 طبق بتري معقم يمثل التخفيف 1/001 وبنفس الماصة
ينقل 1 مل أخرى من األنبوبة 1/001 إلى أنبوبة ماء مقطر فيها 9
مل لنحصل على التخفيف 1/001
38. رج األنبوبة جيدا ثم انقل 1 مل بواسطة ماصة معقمة جديدة 5.
من التخفيف 1/001 إلى 2 طبق بتري معقم لتمثل التخفيف
1/001
توزع عينة الحليب في االجار المغذي وتترك حتى تتصلب 6.
تحضن اإلطباق مقلوبة في الحضان على درجة حرارة 73م 7.
لمدة 84ساعة
تحسب عدد المستعمرات في الطبق الواحد لكل تخفيف"تعتمد 8.
الخفيفات التي تتراوح عدد المستعمرات فيها مابين 52 –
052 مستعمرة" ومنه احسب عدد الخاليا الحية في 1 مل من
عينة الحليب األصلية، وذلك بضرب متوسط عدد المستعمرات
في الطبق في مقلوب التخفيف المستخدم
39. • يستخدم القانون التالي :
• عدد الخاليا الحية في 1مل من عينة المياه األصلية =
متوسط عدد المستعمرات في الطبق×مقلوب التخفيف
المستخدم
• مثال:-
• عدد المستعمرات في الطبق = 45
• عامل التخفيف 00001:1 =
• عدد البكتيريا / مل = 45 × 00001 = 000045
مالحظة
• تعد المستعمرة قي الطبق ما بين 52 مستعمرة 052
44. • قياس درجة التعكير Turbidity
• تعتمد افتراضية هذه الطريقة علي أن زيادة درجة التعكير تدل
علي زيادة كمية النمو ( انخفاض كثافة األشعة الضوئية النافذة
خالل تلك النمو ) .
• وتقاس درجة التعكير باستخدام مقياس ضوئي طيفي
spectrophotometer
• إال إن هذه الطريقة يصعب إتباعها في حالة الخاليا البكتيرية
التي تفرز صبغات بالبيئة بدرجة واضحة .
• وكذلك يمكن قياس درجة التعكير باستخدام رسم بياني أو
جداول معينة Browns Standardsوالتي توضح عدد
البكتيريا بالنسبة لكل درجة من درجات التعكير .
45. التعداد بتقدير الوزن الجاف للخاليا البكتيرية •
تستخدم في أغراض البحوث والدراسات , ويتم فيها غسل •
الخاليا البكتيرية النامية بكميات كبيرة من أثار وبقايا
المستنبت باستخدام الماء المقطر المعقم وتجفف وبذلك تفقد
المكون الرئيسي وهو الماء .
•
46. • تقدير النيتروجين الكلي بالخاليا :
حيث يعتبر النيتروجين هو أهم مكونات البروتين •
واألحماض النووية ولذا تقدير النيتروجين الكلي بالعينة
يكون متالزما مع كمية النمو .
متوسط نسبة النيتروجين في الوزن الجاف للخاليا •
البكتيرية يتراوح حوالي 41% وتختلف هذه النسبة
باختالف أنواع وأجناس البكتيريا وكذلك تختلف بالنسبة
للنوع الواحد من البكتيريا تحث ظروف استنباتية مختلفة .
تستخدم هذه الطريقة أيضا في األبحاث . •
47. • قياس النشاط الكيميائي الحيوي للبكتيريا :
• تعتبر طريقة غير مباشرة والتي يتم فيها قياس متغير معين
بالبيئة مثل تخمر سكر الجلوكوز بواسطة بكتيريا معينة
بمستنبت معين وفي زمن معين .
• كمية الحامض التي تنتج من تخمر الجلوكوز تتناسب مع
كمية النمو البكتيري .
48. • قياس النشاط الكيميائي الحيوي للبكتيريا :
• تعتبر طريقة غير مباشرة والتي يتم فيها قياس متغير معين
بالبيئة مثل تخمر سكر الجلوكوز بواسطة بكتيريا معينة
بمستنبت معين وفي زمن معين .
• كمية الحمض التي تنتج من تخمر الجلوكوز تتناسب مع
كمية النمو البكتيري .
49. التحليل القياسي للمياه •
يعتبر الماء من أساسيات الحياة للكائن الحي، ونظراً لتطور •
المجتمع اإلنساني أدى إلى تلوثه بالمخلفات الصناعة، والقاء
مياه الجاري غير المعاملة في البحار واألنهار والبحيرات ، مما
سبب انتشار األمراض ، وخفض كمية األكسجين الحيوي فيه،
ويستعمل تقدير العدد الكلي للبكتيريا التي يتناسب طرديا ً مع
كمية المادة العضوية الموجودة في المياه.
وتستعمل بكتيريا القولون للكشف عن مدى تلوث الماء بالمياه •
المجاري.
وللكشف عن بكتيريا القولون تجرى ثالثة اختبارات وهي •
كاآلتي:
االحتمالي .Presumptive test •
والتأكيدي . Confirmed test •
.Completed test التكميلي •
50. اختبار االحتمالي -:Presumptive test •
تلقح ثالث أنابيب كبيرة تحتوي كل منها على 01 مل مرق •
الالكتوز 01 مل من عينة ماء المجاري، لتحضير ضعف
التركيز العادي للبيئة (ثالثة مجموعات).
بواسطة ماصة أخرى معقمة تلقح ثالث أنابيب كبيرة تحتوي •
كل منها على 01 مل مرق الالكتوز بـ 0.1 مل من عينة
ماء لبركة، لتحضير تركيز األحادي للبيئة(ثالثة مجموعات).
بواسطة ماصة أخرى معقمة تلقح ثالث أنابيب كبيرة تحتوي •
كل منها على 01 مل مرق الالكتوز بـ 1.0 مل من عينة
ماء الصنبور، لتحضير تركيز الحادي للبيئة(ثالثة
مجموعات).
51. جدول () مجموعات عدد كل أنبوبة في كل مجموعة
وتركيز كل عينة
نوعية تركيز العينة مجموعة نوع الماء
3 أنابيب ضعف التركيز العادي للبيئدة- 01 مجموعة (1) مياه المجاري
مل
3 أنابيب لتركيز األحادي للبيئة – 0.1 مل
3 أنابيب مرق الالكتوز 1.0 مل
3 أنابيب ضعف التركيز العادي للبيئدة- 01
مل مجموعة (2) مياه البركة
3 أنابيب لتركيز األحادي للبيئة – 0.1 مل
3 أنابيب مرق الالكتوز 1.0 مل
3 أنابيب ضعف التركيز العادي للبيئدة- 01
مل مجموعة (3) مياه الصنبور
3 أنابيب لتركيز األحادي للبيئة – 0.1 مل
3 أنابيب مرق الالكتوز 1.0 مل
52. تكتب جميع البيانات المناسبة على كل أنبوبة في جميع •
المجموعات.
تحضن جميع المجموعات عند درجة حرارة 73° م لمدة 84 •
ساعة.
وجود غاز بعد 42 ساعة في أي أنبوبة بعد 42 ساعة، يعني •
االختبار موجب.
إذا تكون الغاز خالل 42 ساعة التالية، بعني االختبار مشكوك •
فيه.
عدم تكون الغاز بعد 84 ساعة، تكون النتيجة سالبة، وأن العينة •
ال تحتوي على بكتيريا القولون ( شكل98 ).
53. تختبر جميع األنابيب من حيث تكوين الغاز بتجمع الغاز داخل •
أنابيب درهام بنسبة ال تقل عن 01% من حجم كل األنبوبة
والحامض بتغير لون دليل البيئة.
تسجل عدد األنابيب الموجبة لتكون الغاز من كل تركيز. •
إيجاد العدد األكثر احتماال لبكتيريا القولون إلى جدول الذي •
يسمى جدول أكثر احتماال Most Probable Number
).(MPN
جدول ( 61 ) و ( 71 ) يوضحان نتيجة النهائية لالختبار •
الموجبة والسالبة وعدد بكتيريا القولون في العينة.
•
54. جدول ( 61 )نتائج االختبار ) (MPNلتركيزات العينة في ثالثة مجموعات من األنابيب وكل
مجموعة تحتوي على خمسة أنابيب المحتوية على بيئة المغذية السائلة
مجموعددددددات مددددددن األنابيددددددب كميددددة العينددددة المضددددافة إلددددى عدد األنابيب الموجبة
المحتوية على البيئة المغذية البيئة المغذية
01 مل 5
1 مل 3
1.0 مل 1
55. جدول ( 71 ) العدد األكثر احتماال لخمس أنابيب من ثالثة تخفيفات المتتالية
56. االختبار التأكيدي: •
يجرى االختبار التأكيدي ، لجميع العينات التي أعطت نتائج •
موجبة ، أو المشكوك فيها في االختبار االحتمالي ، بالخطوات
التالية:
تخطط بينة آجار األيوسين أزرق المثيلين من أنبوبة مرق •
الالكتوز الموجبة لالختبار االحتمالي ألقل كمية لقاح من عينة
الماء.
تحضن عند 73° م لمدة 84 ساعة. •
يعتبر االختبار موجبا ً عند تكوين مستعمرات نموذجية علي •
سطح الطبق خالل فترة التحضين ( الشكل 09 ).
57. االختبار التكميلي: •
تختار مستعمرتان من بيئة آجار األيوسين أزرق المثيلين ( •
التي يعتقد أنهما لبكتيريا القولون)، وينقل كل منهما على
سطح آجار مائل، وإلى بيئة مرق الالكتوز.
تحضن عند 73° م لمدة 84 ساعة. •
تحضر شرائح من اآلجار المائل، وتصبغ بصبغة جرام. •
تكون غاز في مرق الالكتوز، وتصبغ بصبغة جرام. •
