Membuat rancangan pabrikasi untuk memproduksi Gen VEGF121 di Indonesia, sesuai dengan aturan yang berlaku di Indonesia, yang mana Gen VEGF121 berbentuk cairan injeksi dengan partikel pembawa yaitu adenovirus dan dengan eksipien yang telah ditentukan

1. OBAT JANTUNG DENGAN GEN VEGF121
GROUP 3
P E M I C U 2
Anggota:
1. Farha Kamila
2. Fildzah Khalisah A
3. Muslimah
4. Olivia Cesarah
5. Rahmalia Puspita

2. PENDAHULUAN
LATAR BELAKANG
• Di Indonesia, pengobatan
penyakit kelainan pembuluh
darah jantung atau Iskemia
Miokardium yaitu dengan
operasi, intervensi gawat
darurat, pengobatan
berdasarkan penyebab utama
dan juga terapi.
• Gen VEGF121 dinilai mampu
digunakan dalam pengobatan
penyakit Iskemia Miokardium.
TUJUAN
• Membuat rancangan pabrikasi
untuk memproduksi Gen
VEGF121 di Indonesia, sesuai
dengan aturan yang berlaku di
Indonesia, yang mana Gen
VEGF121 berbentuk cairan injeksi
dengan partikel pembawa yaitu
adenovirus dan dengan eksipien
yang telah ditentukan
University of Indonesia

3. LAYOUT PABRIK
University of Indonesia

4. University of Indonesia
PREPARASI GEN
REKOMBINAN
AD/PEG/VEGF121

5. Vektor Adenovirus
Dapat digunakan vektor Adenovirus dengan ligan ataupun tanpa
ligan. Penggunaan adenovirus dengan ligan akan mempermudah
pengenalan pada permukaan sel target dan meningkatkan
afinitas pengikatannya pada sel targer
Gambar 1. Struktur Adenovirus a. Tanpa ligan, b. Dengan ligan
(Sumber: Curtis A Machida (2003))
University of Indonesia

6. Preparasi Rekombinasi Gen VEGF121 dengan Vektor Adenovirus
• Larutan dan bahan-bahan yang digunakan:
1. 130 mM sodium phosphate, pH 7.0, steril.
2. 5% sukrosa steril.
3. Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.0,
steril.
4. 0.5 M Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
(EDTA), steril.
5. Galacto-Star β-galactosidase detection kid
(Tropix/Applied Biosystems, Foster City,
CA).
6. Dithiothreitol (DTT) (Boehringer-
Mannheim Roche Diagnostics).
7. BCA assay reagents (Pierce, Rockford, IL).
8. Tresyl-MPEG-maleimide PEG, MW 5000
(Shearwater Polymers, Huntsville, AL).
9. VEGF121
10.Traut’s reagent, 2-iminothiolane (Pierce):
disimpan pada ruang gelap dengan suhu
40C. Stabil selama 4 minggu setelah dibuka.
• Larutan dan bahan-bahan yang digunakan:
11. OPD peroxidase substrate (Sigma, St. Louis,
MO cat. no. P9187): dilarutkan dalam 20mL
air.
12. PD-10 (Sephadex G-25 M) column
(Pharmacia, Piscataway, NJ).
13. Thiol & Sulfide quantitation kit (Molecular
Probes, Eugene, OR, cat. no. T-6060).
14. Slide-a-lyzer cassette, 10,000MW (Pierce).
15. Fractogel BioSec size exclusion resin (EM
Sciences, Gibbstown, NJ) 150 mL (2.6×30
cm) in a XK 26/60 column (Pharmacia).
16. Fractogel DEAE resin, 40–90µm (EM
Sciences).
17. Superdex 200 16/60 column (Pharmacia).
18. Ad2/CMVβ-gal 4 virus in PBS pH 7.0, 5%
sucrose. Merupakan Adenovirus serotip 2
yaitu vektir adenovirus yang sudah
dihilangkan area E1 nyadan digantikan
dengan β-galactosidase trasgen, dan masih
mengandung area E4.
University of Indonesia

7. • Sel dan Media yang digunakan:
1. Media F-12K Kaighn yang
sudah dimodifikasi
(Invitrogen, Carlsbad, CA).
2. Fetal bovine serum (FBS) (JRH
Biosciences, Lenexa, KS).
3. Penicillin G sodium
(Invitrogen).
4. Streptomycin sulfate
(Invitrogen).
5. 293 sel ginjal embrio
manusia.
Preparasi Rekombinasi Gen VEGF121 dengan Vektor Adenovirus
• Taqman Reagens:
1. Zirconia beads (Biospec Products,
Bartlesville, OK): diautoklave di gelas
vial ukuran kecil.
2. DNA lysis buffer: 100 mM pH 8.0 Tris
HCl, 5 mM EDTA, 0.4% sodium
dodecyl sulfate, 200 mMNaCl.
3. 2-mL sterile screw cap tubes (Axygen,
Union City, CA).
4. DEPC water (water treated with
diethylpyrocarbonate to eliminate
RNase/DNase).
5. Primers and probe (IDT, Coralville, IA)
University of Indonesia

8. Metode Rekombinasi gen VEGF121 dengan vektor Adenovirus
Penentuan
konsentrasi partikel
virus (Maizel et al.
1968 (Ref.62))
Preparasi Ad/PEG
Kompleks.
Menghilangkan
ikatan TMPEG dan
purifikasi Ad/PEG
dengan Size
Exclution
Chromatography
Generation of an
Ad/PEG/VEGF121Co
njugate
Purifikasi
Ad/PEG/VEGF121
dengan Ion
Exchange
Chromatography
Kultur rekombinan
Ad/PEG/VEGF121
University of Indonesia

9. Penentuan konsentrasi partikel
virus (Maizel et al. 1968
(Ref.62))
1. Memasukkan 1μL 10% SDS ke
dalam 100μL virus. Tahap ini
akan membuat DNA virus keluar
dari kapsidnya.
2. Menyiapkan sample dengan
jumlah yang setara dalam PBS
5% sucrose sebagai blank.
3. Inkubasi dalam suhu ruang
selama 30 menit.
4. Vortex.
5. Melakukan spektroskopi pada
panjang gelombang absorbansi
A260, gunakan koefisien
kematian partikel 1 O.D. = 1,1 ×
1012partikel/mL.
6. 1M larutan akan mengandung
6,02 ×1023 partikel/L.
Preparasi Ad/PEG Kompleks.
1. Mencairkan Ad2/CMVβ-gal4 vektor murni
(1x1012 partikel/mL dalam PBS yang
mengandung 5% sukrosa), 1:1 (vol:vol)
dengan 130 mM sodium phosphate pH 7,0,
5% sukrosa.
2. Memasukkan 1.0, 5.0, atau 10% (wt/vol)
tambahan Tresyl-MPEG-maleimide (TMPEG-
mal) dalam larutan virus. Untuk 10% reaksi
TMPEG tambahkan 5% TMPEG kembali pada
setiap selang waktu 30 menit. Langkah ini
bertujuan untuk mempresipitasi virus.
3. Inkubasi campuran pada suhu ruang, untuk
setiap 1% reaksi PEGylation inkubasi selama
45 menit, 5% PEGylation selama 30 menit dan
10% TMPEG, penambahan 2 x 5% TMPEG
setiap 30 menit.
4. Letakkan campuran dalam bak es untuk
menghentikan reaksi. Tresyl group pada
TMPEG tidak akan bereaksi pada suhu
dibawah 40C.
University of Indonesia

10. Menghilangkan ikatan TMPEG
dan purifikasi Ad/PEG dengan
Size Exclution Chromatography
1. Menyeimbangkan 150mL BioSec
resin (2.6 × 30 cm) dengan PBS, pH
7,0 pada laju alir 2,0 mL/min,
sebelum sample dialirkan.
2. Injeksikan sample ke dalam kolom.
Volume sample tidak lebih dari 4.0
mL untuk hasil separasi yang baik.
3. Pantau pada panjang gelombang
A260/A280
4. Tambahkan sukrosa untuk
mencampai konsentrasi akhir 5%.
1. Asumsikan 1000PEG/virion untuk
1% Ad/PEG, [PEG] = 1000 x[virus],
dengan kalkulasi molekular.
2. Dialisis VEGF121 dengan Slide-A-
Lyzer cassette secara berlawanan
dengan menggunakan 0,1 M
sodium phosphate, 0,1M sodium
chlorida, 1mM EDTA, pada pH7,5.
3. Menambahkan 1000 molar berlebih
VEGF121 kemudian diinkubasi
selama 6 jam pada suhu 40C.
Generation of an
Ad/PEG/VEGF121Conjugate
University of Indonesia

11. Purifikasi Ad/PEG/VEGF121 dengan
Ion Exchange Chromatography
1. Menyiapkan 10 mL Fractogel DEAE
dalam kolom XK16/60.
2. Menyiapkan DEAE Buffer A: 10mM
potasium phosphate, pH 7,5 (1M = 15
gram dibasic, 2 gram monobasic per 1L)
yang mengandung 0,15M NaCl, 0,01%
Tween-80 (sterile fi ltered).
3. Menyiapkan DEAE Buffer B: 10mM
potasium chloride, pH 7,5 yang
mengandunga 1M KCl, 1M NaCl, 0,01%
Tween-80 (sterile fi ltered).
4. Menyeimbangkan DEAE resin dengan
buffer A 2mL/min.
5. Setelah mengalirkan sampel, cuci kolom
dengan 1CV buffer A.
6. Gradien dinaikkan untuk 2CV adalah
12.5% buffer B dan 100% buffer B untuk
diatas 4CV.
7. Ad/PEG/VEGF121 akan diilusi engan 25%
buffer B, setara dengan 0,5M garam.
8. Monitor kolom pada panjang gelombang
A260/A280.
9. Terakhir tambahakan 50% sukrosa untuk
memperoleh konsentrasi akhir dari fraksi
hasil pemisahan sebesar 5%.
1. Ad/PEG/VEGF121 dikultur dalam 293
sel (sel ginjal embrio manusia),
dengan penambahan medium nutrisi.
2. Kemudian dimurnikan dengan CsCl
berdasarkan prinsip gradien densitas.
3. Kemudian didialisis.
4. Lalu disimpan pada suhu -700C.
5. Tepat sebelum digunakan, vektor itu
dicairkan atau diencerkan dalam
larutan sukrosa 3%.
Kultur rekombinan Ad/PEG/VEGF121
University of Indonesia

12. University of Indonesia
TAHAP
PENCAMPURAN

13. didefinisikan sebagai proses di mana
dua atau lebih komponen dalam kondisi
campuran terpisah atau kasar
diperlakukan sedemikian rupa sehingga
setiap partikel dari salah satu bahan
terletak sedekat mungkin dengan partikel
bahan atau komponen lain
University of Indonesia

14. Tujuan pencampuran:
• Untuk memastikan bahwa ada keseragaman bentuk
• Untuk memulai atau meningkatkan reaksi fisika atau kimia seperti
difusi, disolusi, dll
• untuk memperoleh jenis produk berikut.
– Ketika dua atau lebih cairan misibel dicampur bersama-sama,
hasilnya dikenal sebagai larutan nyata.
– Ketika dua cairan imisibel dicampur dengan agen pengemulsi,
hasilnya dikenal sebagai emulsi.
– Ketika padatan dilarutkan dalam suatu pembawa, hasilnya dikenal
sebagai larutan.
– Ketika padat tidak larut dilarutkan dalam suatu pembawa, hasilnya
dikenal sebagai suspensi.
– Ketika padatan atau cairan dicampur dengan basis semi padat,
hasilnya dikenal sebagai salep atau supositoria.
– Ketika dua atau lebih bahan padat bersama, diperoleh serbuk yang
bila diisi ke dalam kapsul dikenal sebagai kapsul dan ketika
dikompresi di bawah tekanan tinggi disebut tablet
University of Indonesia

15. Klasifikasi Campuran
Positif
• dua atau lebih gas atau cairan misibel dicampur bersama-sama melalui proses
difusi
• Jenis bahan ini tidak memberikan masalah dalam pencampuran
Negatif
• ketika padatan tidak terlarut dicampur dengan pembawa untuk membentuk
suspensi atau ketika dua cairan tidak saling larut yang dicampur untuk
membentuk emulsi
• lebih sulit disiapkan dan memerlukan tingkat pencampuran yang lebih tinggi
Netral
• Banyak produk farmasi seperti pasta, salep, dan serbuk tercampur
• Produk tersebut statis dan komponennya tidak memiliki kecenderungan
bercampur secara spontan
University of Indonesia

16. Mekanisme campuran
Convective
mixing
Shear
mixing
Diffusive
mixing
• perpindahan sekelompok partikel
dalam jumlah besar terjadi dari satu
bagian powder bed ke bagian yang
lain
• gaya geser terbentuk dalam massa
bahan dengan menggunakan
agitator arm atau blast of air.
• bahan-bahan miring sehingga gaya
gravitasi menyebabkan lapisan atas
tergelincir dan difusi partikel
individu berlangsung di atas
permukaan yang baru
dikembangkan
University of Indonesia

17. Mixing Guidelines
 Gunakan waktu yang cukup dalam pencampuran untuk memastikan
bahwa polimer benar-benar terhidrasi sebelum menambahkan komponen
formulasi tambahan.
 Pencampuran yang berlebihan atau tidak tepat selama dispersi dapat
menyebabkan udara terperangkap, variasi viskositas, dan/atau
ketidakstabilan formulasi. Udara terperangkap dapat diminimalkan dengan
menggunakan variable drive motor. Setelah polimer terdispersi, udara
terperangkap dapat diminimalkan dengan reposisi impeller dan
mengurangi kecepatan pencampuran. Biarkan dispersi asam untuk
melepaskan gelembung udara terperangkap.
 Dianjurkan melakukan pengadukan sedang.
University of Indonesia

18. Con’t
Setiap pencampuran intensitas tinggi yang diperlukan
harus diselesaikan sebelum netralisasi.
Hindari pencampuran high shear dengan Waring
blender atau rotor-stator homogenizers. Pencampuran
seperti itu dapat menggeser polimer dan menghasilkan
kehilangan fungsionalitas permanen.
Jika busa persisten dihasilkan, busa tersebut dapat
hilang dengan merusak polimer secara parsial dengan
penambahan asam dengan kadar yang sangat rendah
sebelum menetralisir dispersi dengan basis yang cocok.
Asam klorida atau fosfat memiliki efektivitas sebesar
0,5% dari berat polimer yang digunakan.
University of Indonesia

19. Efektifitas penghomogenannya bisa berlainan
tergantung dari jenis alat yang digunakan.
Pengaduk (Mixer)
 Jenis pengaduk ini bermacam ragamnya tergantung dari banyak volume
cairan, kekentalan dsb.
 Alat ini mempunyai sifat menghomogenkan dan sekaligus memperkecil
ukuran partikel walaupun efek menghomogenkan cairan lebih dominan.
Homogenizer
 Alat ini mempunyai karakteristik memperkecil ukuran partikel
 Pengecilan partikel terjadi karena cara kerja alat ini yaitu dengan
menekan cairan, dipaksa melalui celah yang sempit kemudian
dibenturkan ke suatu dinding atau ditumbukkan pada peniti-peniti
metal yang ada dalam celah tersebut.
 Cara sangat sensititf sehingga bisa didapat diameter pertikel rata-rata
kurang dari 1 mikron.
University of Indonesia

20. University of Indonesia
FILLING &
SEALING

21. Filling dan Sealing dengan Filler/Stopper
Machine for Vials
• Digunakan untuk
pengisisan, pemasangan
sumbat, dan crimp
capping.
• Pengisian berlangsung
otomatis sesuai volum yang
sudah ditentukan.
• Setelah dilakukan
pengisisan selanjutnya
dilakukan pemasangan
sumbat dan crimp capping.
University of Indonesia

22. University of Indonesia
STERILISASI

23. Sterilisasi
• Metode pembuatan sediaan injeksi terdapat dua
cara, yaitu cara aseptik dan sterilisasi akhir.
Proses aseptis
dilakukan apabila
bahan-bahan yang
digunakan tidak
tahan terhadap
pemanasan.
Teknik aseptik
sediaan injeksi yang berbahan
gen VEGF121
University of Indonesia

24. Sterilisasi vial
• Seluruh peralatan dan material tahan panas
disterilisasi dengan pemanasan.
Sterilisasi autoklaf
suhu 230 0C
selama satu
jam
mampu membunuh
secara cepat semua
bentuk vegetatif
mikroorganisme dalam 1
atau 2 menit
University of Indonesia

25. University of Indonesia
QUALITY
CONTROL

26. University of Indonesia
INCOMING
STOCK
•Routine Work Testing
MANUFACTURING
• Conductivity Measurement
• Volume Filled
• Temperature of Sterility
• Environmental Control Test
• Visual Inspection
FINISHED
PRODUC
T
•Leaker Test
•Pyrogen Test
•Particulate Test
•Sterility Test
•Uniformity of Content

27. LEAKER TEST
Filled and Sealed
Ampoules ditaruh dalam
ruang vakum
Dicelupkan pada larutan
1% Methylene Blue
Diberikan negative
pressure
Jika terjadi kebocoran,
warna biru akan masuk
karena perbedaan tekanan
University of Indonesia
Leakage (kebocoran) adalah hal yang
sering terjadi dalam proses
manufaktur kemasan obat
Dikarenakan perbedaan temperatur
dan tekanan di tiap unit atau ruangan,
maka kemasan mengekspansi
Test dilakukan pada ampoules, karena
bahannya dari kaca

28. PYROGEN TEST
PYROGEN
TEST
LAL
Test
Rabbit
Test
University of Indonesia

29. LAL BACTERIAL TEST
(Limulus Amebocyte Lysate Test)
• Test yang digunakan untuk
mendeteksi keberadaan dan
konsentrasi endotoksin bakteri
dalam obat-obatan dan produk
yang berkonsep biologi.
• Endotoksin adalah sejenis pyrogen
yang keberadaannya ada pada
dinding sel dari bakteri negative.
• LAL Test yang dilakukan berbentuk
gel formation test.
• reagen LAL yaitu Limulus
Polyphemus pada inkubasi selama
60 menit pada 37 derajat celcius.
• tes ini adalah hanya dapat
mendekteksi bakteri gram negative
dan tidak dapat mengukur tingkat
endotoksinnya (tes semi-kualitatif).
University of Indonesia

30. RABBIT TEST
• Mempunyai objek
percobaan kelinci
• Produk manufaktur obat
dicobakan pada sekelompok
kelinci (5-10 ekor)
• Prosedur tes sebagai berikut:
1. Pada sekelompok kelinci yang akan
dicobakan, tidak boleh diberikan
makanan pada hari percobaan
2. Kelinci-kelinci diukur temperature nya
sebelum percobaan, dicatat.
3. Obat yang ingin diujikan disuntikkan
pada pembuluh dekat telinga.
4. Melakukan pengamatan reaksi obat
terhadap kelinci setiap 30 menit, 1 jam,
2 jam, dan 3 jam.
5. Jika ternyata memang ada kandungan
bakteri di obat tersebut, dimana terjadi
kenaikan temperature pada kelinci
tersebut.
6. Jika kondisi dari kelinci 80% mengalami
kenaikan temperature pada tubuhnya,
dapat dipastikan ada kontaminasi
bakteri dalam obat
University of Indonesia

31. PARTICULATE TEST
• Tes ini dilakukan untuk
mendeteksi adanya partikel
lain dengan metode
pencahayaan yang sangat
terang dengan background
hitam putih
• Jika adanya partikel lain,
maka produk harus dibuang
• Dapat dilakukan oleh
human resources maupun
device
University of Indonesia

32. STERILITY TEST
• Tujuan untuk mendeteksi adanya kontaminasi
bakteri pada batch proses sebuah manufaktur
• Metode dibagi menjadi 2 cara:
– Membrane Filtration Method
Menggunakan media yaitu fluid thioglycollate medium
dan soya-bean casein digest medium.
– Direct Menoculation Method
Karena mikroorganismenya tidak dapat tersaring, maka
samoel langsung dideteksi melalui media atau device
• Dapat dilakukan secara product sampling atau
keseluruhan manufaktur
University of Indonesia

33. University of Indonesia
PACKAGING &
LABELING

34. PACKAGING DAN LABELING
Packaging &
Labeling
Primer Sekunder Tersier
• Packaging primer injeksi cair yang
dipiilih berbentuk VIALS
• Berbahan dasar kaca dan
penggunaannya harus diambil
menggunakan syringe yang akan
disuntikkan
University of Indonesia

35. PACKAGING DAN LABELING
Primer
• Packaging primer berbentuk
ampoules yang telah diisi pada
proses filling
• Proses primer labeling dilakukan
pada ampoules oleh unit operasi
Shrink Labeler atau Ampoule Labeler
Sekunder
• Pemprosesan packaging
sekunder lebih dikenal dengan
nama pengepakan. Digunakan
packaging boks-boks karton
• Digunakan mesin blister atau
cartoning machine (mesin
pengepakan otomatis). Mesin
jenis ini bisa sekalian
melakukan proses labeling.
• Labeling yang dilakukan
biasanya nama, tanggal dan
kode produksi , dll
University of Indonesia

36. PACKAGING DAN LABELING
Tersier
• Digunakan unit operasi
Cardboard Case Packager
• Penting untuk melindungi
produk obat pada saat
pengiriman jarak jauh.
• Pengemasan tersier ke
dalam kardus dilakukan
secara manual.
University of Indonesia

37. KESIMPULAN
• Secara garis besar, tahapan – tahapan pembuatan
obat terapi gen VEGF121 ini adalah persiapan 
mixing  sterilisasi  filling/sealing  inspeksi 
labeling dan packaging.
• Untuk sterilisasi bahan gen VEGF121 menggunakan
proses aseptic.
• Untuk sterilisasi wadah menggunakan autoklaf.
• Kemasan yang digunakan adalah VIALS.
University of Indonesia

38. THANK YOU !
F O R Y O U R AT T E N T I O N
GROUP 3
P e m i c u 2