Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ
: https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
HOẶC
https://www.facebook.com/garmentspace/
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Web & Social Media Analytics Previous Year Question Paper.pdf
Nghiên cứu khử khoáng trong thu nhận chitin bằng lên men lactic từ vỏ đầu tôm sú
1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU KHỬ KHOÁNG TRONG THU NHẬN
CHITIN BẰNG LÊN MEN LACTIC
TỪ VỎ ĐẦU TÔM SÚ
Ngành: Công nghệ sinh học
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Ngọc Thu
MSSV: 0851110242 Lớp: 08DSH2
TP. Hồ Chí Minh, 2012.
2. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Với hiện trạng các nhà máy sản xuất thuỷ sản, đặc biệt là tôm lột vỏ, đã thải ra
môi trường hàng tấn vỏ tôm như là nguồn chất thải đã gây ô nhiễm môi trường trầm
trọng. Hơn thế nữa, vỏ tôm là một nguồn tài nguyên quý nếu ta biết cách sử dụng.
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tái sủ dụng vỏ tôm như làm thức ăn
gia súc, gia cầm và đặc biệt là thu nhận các hợp chất quý trong vỏ tôm như chitin,
carotenoid. Các hợp chất này có rất nhiều ứng dụng trong cuộc sống. Vì vậy, em
nhận thấy vấn đề thu nhận chitin từ vỏ tôm là việc vô cùng quan trọng hiện nay. Nó
vừa giúp cải thiện môi trường mà còn đem lại một nguồn lợi vô cùng lớn cho con
người.
Tuy nhiên, các quy trình sản xuất chitin trước đây thường dùng công nghệ hoá
học, vì vậy nó không những không góp phần bảo vệ môi trường mà còn gây hại
thêm bởi một lượng lớn các chất hoá học với nồng độ cao thải ra ngoài môi trường
trong quá trình chế biến.
Trước thực tiễn trên, em nhận thấy cần phải nghiên cứu thêm về các quy trình
thu nhận chitin bằng phương pháp sinh học để tránh các thiệt hại cho môi trường
đồng thời thu về nguồn lợi quý từ chitin. Do đó, em đã thực hiện đề tài “Nghiên
cứu khử khoáng trong thu nhận chitin bằng lên men lactic từ vỏ đầu tôm sú”.
2. Tình hình nghiên cứu
Có rất nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này trên thế giới, đặc biệt là ở
Ấn Độ, Nhật Bản, Anh, Pháp… đều tìm được điểm chung là phương pháp lên men
lactic vỏ tôm sẽ thu được nguồn chitin dễ dàng tinh sạch và hiệu suất cao hơn.
3. Mục đích nghiên cứu
Xác định các thành phần trong quy trình thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng
phương pháp lên men lactic với chủng L. acidophilus. Acid lactic sinh ra trong quá
trình lên men sẽ loại các ion khoáng trong nguyên liệu vỏ tôm như: Ca2+
, Mg2+
,
đồng thời các vi khuẩn lactic sẽ phân huỷ một phần protein trong vỏ tôm.
3. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
Tìm ra tỉ lệ nước và đường D – glucose thích hợp cho quá trình lên men.
So sánh phương pháp xử lý vỏ tôm bằng hoá học và bằng sinh học.
5. Phương pháp nghiên cứu
a. Phương pháp luận
Trước khi thực hiện đề tài này, em đã được biết qua rất nhiều các ứng dụng
của chitin – chitosan được ứng dụng trong cuộc sống và đã tham khảo nhiều quy
trình thu nhận chitin của các tác giả trong và ngoài nước. Em nhận thấy quy trình
thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp lên men lactic vừa an toàn đối với môi
trường vửa dễ dàng áp dụng vào cuộc sống. Vì vậy em đã chọn vi khuẩn
Lactobacillus acidophilus, một chủng vi khuẩn sản sinh nhiều vi khuẩn lactic vừa
thân thiện với con người để lên men vỏ tôm thu nhận chitin.
b. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị.
Sử dụng phần mềm Statghraphics để xử lý số liệu.
6. Các kết quả đạt được của đề tài
Xác định tỉ lệ nước:vỏ tôm và tỉ lệ đường:vỏ tôm thích hợp cho quy trình lên
men, từ đó hoàn thiện đề nghị quy trình khử khoáng vỏ đầu tôm sú để sản xuất
chitin với Lactobacillus acidophilus.
7. Kết cấu của ĐATN
Đồ án gồm có 4 chương:
Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Vật liệu và phương pháp
Chương 3: Kết quả và biện luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
4. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Lactobacillus
1.1.1. Giới thiệu về Lactobacillus acidophilus
1.1.1.1. Phân loại
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillilales
Họ: Lactobacillaceae
Chi: Lactobacillus
Loài: Lactobacillus acidophilus.
Vi khuẩn này được mô tả lần đầu tiên do công của một bác sĩ là Bruno Oppler
và một nhà nghiên cứu dạ dày ruột là Ismar Isidor Boas. Tên gọi Lactobacillus
acidophilus bắt nguồn từ lacto có nghĩa là sữa, bacillus chỉ hình dáng giống cây gậy
và acidophilus nghĩa là một “acid đằm thắm” (acid loving).
L. acidophilus là vi khuẩn Gram (+), hình que, không sinh bào tử. Nó có khả
năng lên men cả hiếu khí lẫn kỵ khí. Trong trường hợp lên men đồng hình, glucose
được sử dụng để tạo acid lactic, hoặc tạo thành nhiều sản phẩm khác nhau như acid
acetic, ethanol, CO2…trong trường hợp lên men dị hình.
5. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
4
1.1.1.2. Hình thái
L. acidophilus là trực khuẩn, có kích thước rộng 0,6 - 0,9 µm, dài 1,5 – 6 µm,
lên men đồng hình, nhiệt độ phát triển tối ưu là 37 - 42 o
C. Trong tự nhiên, chúng
tồn tại riêng lẻ, đôi khi tạo thành chuỗi ngắn có khả năng chuyển động.
Lên men cellobiose, galactose, lactose, maltose và sucrose. Không lên men
được mannitol, melezitose, rhamnose, sorbitol, và xylose.
a. b.
c.
Hình 1.1. Hình thái L. acidophilus
a. Hình thái khuẩn lạc L. acidophilus nằm nghiêng
b. Hình thái khuẩn lạc L. acidophilus
c. Hình thái tế bào L. acidophilus khi nhuộm Gram
6. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
5
1.1.1.3. Đặc điểm sinh lý sinh hóa
L. acidophilus có thể phát triển ở nhiệt độ cao như 45 o
C nhưng tối ưu là 35 –
40 o
C. Tính chịu acid của nó từ 0,3 - 1,9 % chuẩn độ acid, với pH tối ưu từ 5,5 - 6.
Chúng có những yêu cầu phát triển phức tạp như: áp lực oxygen thấp, có thể lên
men carbohydrate, protein và các phần tử bị phá vỡ từ các chất này, một số vitamin
và khoáng như B-complex, acid nucleic, Mg, Mn, Fe cần cho sự phát triển.
L. acidophilus phát triển ở pH thấp < 3,5 và lên men trong điều kiện yếm khí.
L. acidophilus sử dụng đường như một cơ chất cho sự lên men và sống được ở môi
trường phong phú đường. Mỗi phân tử glucose trải qua sự lên men trong L.
acidophilus tạo ra năng lượng là 2 ATPs. Ngoài glucose, L. acidophilus còn sử
dụng aesculin, cellobiose, galactose, lactose, maltose, salicin, sucrose và trehalose
cho sự lên men.
1.1.1.4. Đặc điểm sinh thái.
L. acidophilus được biết như một loài có vai trò probiotic. Sự bám dính và khả
năng liên kết với nhau tạo thành một tập đoàn của vi khuẩn lactic là cơ chế hữu hiệu
để hạn chế vi khuẩn có hại. Khi vi khuẩn lactic vào trong cơ thể, định cư ở đường
ruột, chúng cạnh tranh vị trí gắn kết trên thành ruột với vi sinh vật có hại, làm hạn
chế số lượng tế bào vi sinh vật có hại trong đường ruột. L. acidophilus có khả năng
sinh tổng hợp một số chất có khả năng kháng khuẩn như acid lactic, hydrogen
peroxide, diacetyl và bacteriocin làm hạn chế sự phát triển của vi khuẩn có hại.
Ngoài ra, L. acidophilus còn có vai trò như một chất bổ trợ cho những người không
chịu được lactose. Chúng tập hợp ở đường tiêu hóa, góp phần chuyển hóa và phân
giải lactose trong quá trình tiêu hóa thức ăn ở dạ dày và ruột.
1.1.1.5. Cơ chế kháng khuẩn của L. acidophilus
Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng vi khuẩn sinh acid lactic có khả năng ức
chế sự phát triển của vi sinh vật truyền nhiễm ở gia cầm. Chateau et al (1993) phân
lập được 103 chủng Lactobacillus ssp từ hai sản phẩm DFM (cho ăn trực tiếp)
thương mại và kiểm tra khả năng ức chế hai chủng Salmonella. Khoảng 47 %
7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
6
Lactobacillus của sản phẩm A và 70 % của sản phẩm B có thể ức chế tất cả 6
serotype E. coli.
Ozayabal và Coner (1995) báo cáo rằng 3 chủng thương mại (L. acidophilus,
L. casei vàL. faecium) có thể ức chế sự phát triển của của 6 serotype Salmonella. Jin
et al (1996) phát hiện ra rằng tất cả 12 chủng Lactobacillus có thể ức chế sự phát
triển của 5 chủng Salmonella và 3 chủng E. coli.
Các sản phẩm vi sinh từ Lactobacillus có Bacteriocin, acid hữu cơ và
hydroperoxyd. Bacteriocin là hỗn hợp của các sản phẩm vi sinh vật có các thành
phần protein sinh học chủ động và hoạt động vi sinh (Tag et al, 1976). Các chủng
Lactobacillus có ở đường ruột của người và một số động vật thí nghiệm khác cũng
sản xuất các chất giống Bacteriocin được gọi là Lactocidin (Vincent et al., 1995).
Chất này họat động ở pH 5 - 7,8 và không mẫn cảm với các hoạt động xúc tác.
Lactocidin thô có các hoạt động ức chế nhiều loại vi khuẩn bao gồm Proteus spp,
Salmonelle spp, E.coli và Staphylococcus spp vì Lactocidin có phổ kháng khuẩn rất
rộng.
Cơ chế hoạt động cơ bản của bacteriocin chủ yếu tạo nên những lỗ trên màng
tế bào chất và enzyme được tiết ra gây trở ngại cho quá trình trao đổi chất của vi
khuẩn khác.
Hoạt tính kháng vi sinh vật nhờ cơ chế biểu diễn trên hình 1.2 (Cotter et al.,
2005). Trong đó Bacteriocin class I (đại diện: Nisin của Lactococcus lactics) gắn
vào lớp lipid II, ngăn sự vận chuyển các tiểu đơn vị peptidglycan từ tế bào chất đến
vách tế bào, do đó ngăn tổng hợp vách tế bào hoặc do bám được vào lớp lipid II,
các phân tử nisin tạo lỗ xuyên màng tế bào dẫn đến tiêu bào; Bacteriocin class II
(đại diện: Sakacin của Lactobacillus sakei) là các peptid lưỡng tính có khả năng
xuyên màng tế bào tạo kênh trên lỗ trên màng. Lớp III (còn gọi là bacteriolysin như
lysostaphin) – protein bền nhiệt, tác động trực tiếp lên vách tế bào đích.
8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
7
Hình 1.2. Cơ chế kháng vi sinh vật nhờ khả năng sinh bacteriocin.
Hoạt động đối kháng bởi vi khuẩn lactic có liên quan chặt chẽ với sản phẩm
cuối của quá trình trao đổi chất. Hàng loạt các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi
do Lactobacillus có khả năng có hoạt động đối kháng (trong phòng thí nghiệm).
Các sản phẩm phụ được biết tới nhiều nhất là các acid hữu cơ như acid lactic,
acid acetic (Trammer, 1966; Sorrel và speck, 1970) và hydro peroxid (Wheater et
al, 1952; Dahiafa và Speck, 1968; Price và Lee, 1970). Các acid acetic, lactic ức chế
sự phát triển của nhiều vi sinh vật gây bệnh Gram âm (Sorrel và Speck, 1970;
Herrick, 1972; Adams và Hall, 1988) phát hiện ra các hoạt động của các acid này
phụ thuộc vào độ pH. Nếu độ pH thấp sẽ tăng mức độ acid ở dạng không hòa tan.
Khả năng đối kháng các vi sinh vật gây bệnh ở chủng L. acidophilus rất quan
trọng trong đề tài này. Vì phải lên men trong môi trường vỏ tôm chứa nhiều dinh
dưỡng, nếu L. acidophilus có khả năng đối kháng cao sẽ ức chế các VSV cây mùi
hôi thối trong quá trình lên men, đồng thời ngăn các VSV có thể gây hại cho sức
khoẻ con người.
1.2. Tổng quan về tôm sú và nghề nuôi tôm sú tại Việt Nam
1.2.1. Vị trí phân loại
Tôm sú được định loại là:
Ngành: Arthropoda
9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
8
Lớp: Crustacea
Bộ: Decapoda
Họ chung: Penaeidea
Họ: Penaeus Fabricius
Giống: Penaeus
Loài: monodon
Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius
1.2.2. Vùng phân bố của tôm sú trên thế giới
Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, từ Án Độ Dương qua hướng Nhật Bản,
Đài Loan, phía đông Tahiti, phía nam châu Úc và phía tây châu Phi (Racek, 1955;
Holthuis và Rosa, 1965; Motoh, 1981, 1985).
Nhìn chung, tôm sú phân bố từ kinh độ 30 o
E đến 155 o
E, từ vĩ độ 35 o
N đến
35 o
N xung quanh các nước vùng xích đạo, đặc biệt là Indonesia, Malaysia,
Philippines và Việt Nam.
Tôm bột, tôm giống và tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển và
vùng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành, chúng di chuyển xa bờ vì thích sống
ở vùng nước sâu hơn.
1.2.3. Các vùng nuôi tôm chủ yếu tại Việt Nam
Theo Tổng cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông thôn), năm 2011,
cả nước thả nuôi được 656.425 ha tôm nước lợ, với sản lượng đạt 495.657 tấn, tăng
2,71 % về diện tích và 5,48 % về sản lượng so với năm 2010. Trong đó, diện tích
nuôi tôm sú là 623.377 ha, đạt sản lượng 319.206 tấn, bằng 95,81 % năm 2010.
Riêng khu vực đồng bằng sông Cửu Long, tổng diện tích thả nuôi tôm là
602.416 ha (bao gồm 588.419 ha nuôi tôm sú và 18.498 ha nuôi tôm thẻ chân
trắng), chiếm 91,8 % diện tích nuôi tôm của cả nước.
Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam cho biết, tổng giá trị xuất
khẩu tôm của Việt Nam trong năm 2011 đạt 2.396 tỷ USD, tăng 13,7 % so với năm
10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
9
2010 và đã vượt qua mốc 2 tỷ USD. Trong đó, xuất khẩu tôm sú đạt trên 1,43 tỷ
USD, chiếm gần 60 % tổng giá trị, xuất khẩu tôm chân trắng đạt 704 triệu USD,
chiếm 29,3 % tỷ trọng, 12 % còn lại là tôm các loại khác.
Về thị trường xuất khẩu, tôm Việt Nam đã thâm nhập sâu hơn và các thị
trường khác ngoài 3 thị trường trọng điểm truyền thống là Mỹ, Nhật Bản và châu
Âu. Năm 2010, giá trị xuất khẩu tôm sang 3 thị trường này chiếm hơn 71 % tổng
sản lượng xuất khẩu tôm cả nước. Sang năm 2011, tỷ trọng này còn 66 %.
Trong khi đó, xuất khẩu sang một số thị trường khác như Hàn Quốc, các nước
Đông Nam Á… và đặc biệt là sang Nga tăng mạnh, xuất khẩu tôm sang Nga tăng
124 % so với năm 2010. Xuất khẩu tôm sang Hàn Quốc tăng 23 %, sang các nước
Đông Nam Á tăng 54,7 %.
Năm 2011, tôm sú vẫn giữ vị trí chủ đạo trong cơ cấu xuất khẩu tôm Việt
Nam. Tuy nhiên, tỷ trọng về khối lượng và giá trị đang giảm dần, đặc biệt là các
mặt hàng tôm sú sống, tươi hoặc đông lạnh.
1.2.4. Các sản phẩm chủ yếu được sản xuất từ tôm sú
Tôm tươi được chế biến lạnh đông dưới nhiều dạng như sau:
Tôm nguyên con còn đầu và còn vỏ.
Tôm bỏ đầu: tôm bỏ đầu và còn vỏ.
Tôm bỏ đuôi: tôm bỏ đầu, bỏ ruột và bóc một phần vỏ.
Tôm xẻ lưng, bóc vỏ đến đốt áp chót.
Tôm cánh bướm, bóc vỏ đến đốt áp chót, cắt dọc theo chiều dài sống
lưng, xẻ banh ra.
Tôm có 4 đốt đầu được bóc vỏ và cắt theo chiều dài.
Tôm bóc noãn: tôm bỏ đầu, bỏ vỏ và bỏ ruột.
Tôm bóc noãn.
Tôm bóc noãn, xẻ lưng.
Tôm bóc noãn không nguyên vẹn.
Tôm bóc noãn và cắt cánh bướm: tôm boc noãn được cắt dọc theo
chiều dài đến đốt cuối cùng.
11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
10
Tôm bóc noãn có 4 đốt đầu tiên được cắt theo chiều dài.
1.2.5. Các phương pháp xử lý vỏ tôm thải hiện nay
Trong các quy trình sản xuất tôm lột vỏ, một lượng lớn vỏ tôm bị thải ra
ngoài, gây ô nhiễm môi trường, đồng thời trong vỏ tôm thải vẫn còn rất nhiều hợp
chất có thể thu nhận lại. Các protein, khoáng chất, vi lượng… trong vỏ tôm thải có
thể chế biến thành thức ăn gia súc, gia cầm. Ngoài ra, các hợp chất quý như
carotenoid, chitin… thu nhận từ vỏ tôm có rất nhiều ứng dụng trong y học, công
nghiệp và nông nghiệp.
Đầu vỏ tôm, phụ phẩm trong ngành chế biến thuỷ hải sản, đã được nhiều tác
giả nghiên cứu và sử dụng làm thức ăn gia súc, có nhiều công trình nghiên cứu về
thành phần hoá học và giá trị dinh dưỡng của đầu và vỏ tôm.
Theo Vũ Duy Giảng (1995), bột đầu tôm được chế biến từ đầu, càng, vỏ tôm
là nguồn protein động vật rất tốt cho gia súc, gia cầm. Giá trị dinh dưỡng của bột
đầu tôm thấp hơn bột cá và bột máu. Bột đầu tôm có 33 – 34 % protein, trong đó có
4 – 5 % lysin và 2,7 % methionin.
Theo Dương Xuân Tuyển, đầu vỏ tôm tươi đem hấp cách thuỷ có chứa chất
khô là 26,40 % và protein thô khoảng 11,38 %, trong khi protein thô trong vỏ đầu
tôm muối chua là 11,20 %.
Chất xơ trong đầu vỏ tôm khá cao và biến động tuỳ theo thành phần đầu vỏ
tôm, hàm lượng thay đổi từ 3,3 – 6,0 %. Canxi, phospho là thành phần khá quan
trọng trong đầu vỏ tôm. Đầu vỏ tôm tươi đem hấp chứa 3,68 % canxi và 0,22 %
phospho, tro và đầu vỏ tôm ủ chua có hàm lượng canxi 2,15 % và phospho 0,44 %.
Bột đầu vỏ tôm sấy khô chứa 5,2 % canxi và 0,9 % phospho (Dương Xuân Tuyển,
1992).
Đầu vỏ tôm tươi ít được sử dụng nuôi heo nhưng được sử dụng khá phổ biến
như nguồn thức ăn bổ sung đạm trong chăn nuôi vịt đẻ. Vỏ đầu tôm tươi đem hấp
được Dương Xuân Tuyển (1992) sử dụng đến 46 % và lúa là nguồn thức ăn năng
lượng chính nuôi vịt đẻ CV super M tại trại Vigova, cho năng suất trứng 160
12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
11
quả/năm so với tiêu chuẩn của Anh về năng suất trứng đối với giống vịt bố mẹ 170
quả/năm.
Một vài tác giả cũng đã sử dụng vỏ đầu tôm ủ chua nuôi heo thịt. Lê Văn Liễn,
Nguyễn Thiện (1995), dùng 5 % đầu vỏ tôm ủ chua thay thế bột cá trong khẩu phần
thức ăn nuôi heo thịt cho kết quả tăng trọng và tiêu tốn thức ăn tương đương khẩu
phần có 10 % bột cá. (Theo Nguyễn Thị Thu Vân – 1997).
Tuy nhiên, các phương pháp trên vẫn chưa tận dụng hết các hợp chất trong vỏ
tôm như chitin hay carotenoid. Những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu trên
toàn thế giới về việc thu nhận chitin trong vỏ tôm nhằm tránh lãng phí nguồn tài
nguyên này.
1.3. Tổng quan về chitin – chitosan
1.3.1. Cấu trúc chitin - chitosan
Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào 1821, trong cặn
dịch chiết từ một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn
gốc của nó. Năm 1823, Odier phân lập một chất từ bọ cách cứng mà ông gọi là
chitin hay “chiton”, tiếng Hy Lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra
sự có mặt của nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận
chitin có dạng công thức giống như cellulose.
Chitin là polysaccharide phổ biến thứ 2 trên đất sau cellulose, được tìm thấy
trong xương người cũng như trong các bộ phận của động vật không xương sống.
Nó là sự kết hợp giữa liên kết β (1→4) với 2 – acetamido – 2 – deoxy – β – D
– glucose (N – acetylglucosamine).
Chitin thường được coi là dẫn xuất cellulose và có chứa 6,9 % là N (Black và
Schwartz, 1950). Nó có cấu trúc giống hệt cellulose vì có gốc acetamide (-NH-CO-
CH3) ở vị trí C2. Một dẫn xuất khác của chitin, chitosan là 1 polymer tuyến tính
α (1 → 4) 2 – annino – 2 – deoxy – β – D – glucopyranose
13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
12
Hình 1.3. Công thứ cấu tạo của chitin
1.3.2. Tính chất hoá học của chitin - chitosan
Chitin là 1 polysaccharide chứa nitơ, trắng, cứng, không đàn hồi, không tan
trong nước và acid yếu, chỉ tan trong một số dung môi, bền trong môi trường kiềm
nhưng kém bền trong môi trường acid.
Chitin ở thể rắn có độ kết tinh cao do gốc –NHCOCH3 ở vị trí cacbon thứ hai,
làm tăng liên kết hydro giữa các mạch và trong mạch với nhau.
Chitin ổn định với các chất oxy hoá khử như KMnO4, H2O2, NaClO hay
Ca(ClO)2,... có thể lợi dụng tính chất này để khử màu chitin.
Khi đun nóng trong môi trường kiềm đậm đặc, chitin bị khử bởi gốc acetyl tạo
thành chitosan.
a. b.
Hình 1.3. Cấu tạo của chitin (a) và chitosan (b)
14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
13
Phản ứng của chitosan linh hoạt hơn so với cellulose nhờ nhóm -NH2, có thể
liên kết với chất béo.
Chitosan phản ứng với các acid đậm đặc tạo thành muối khó tan, tác dụng với
iod và acid sulfuric thành phản ứng màu tím, có thể dùng trong phân tích định tính
chitosan.
Tính chất chung của chitin và chitosan:
chuỗi polymer bền,
các nhóm amin phản ứng,
có nhóm hydroxyl phản ứng tồn tại, và
giữ nhiều ion thu kim loại chuyển đổi.
Thuộc tính sinh học của chitosan:
a. Thích ứng sinh học:
chuỗi polymer tự nhiên,
có thể phân hủy sinh học,
an toàn và không độc.
b. Có phản ứng liên kết.
c. Tái tạo các phản ứng keo liên kết.
d. Tăng hệ hình thành chất osteoblast chịu trách nhiệm cho xương hình
thành.
e. Cầm máu.
f. Diệt nấm, vi khuẩn, virus.
g. Diệt tinh trùng.
h. Ngừa sưng tấy.
i. Chống các tác nhân gây dị ứng.
j. Ngừa chotesterol, ngừa tăng huyết áp.
k. Tăng khả năng tái tạo xương.
l. Ức chế sự đau đến hệ thần kinh trương ương.
m. Bổ trợ miễn dịch.
26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
25
Bông thấm nước, bông không thấm nước.
Bao nilong hấp, bao nilon kích thước 5x7 cm, dây thun, giấy gói.
2.2 Phương pháp luận
2.2.1. Mục đích
Nghiên cứu quy trình khử khoáng vỏ đầu tôm sú để sản xuất chitin bằng
phương pháp lên men với L. acidophilus.
2.2.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: xác định các thông số về thành phần hoá học của nguyên liệu vỏ
tôm. Các yếu tố cần phân tích trong mục tiêu này:
1. Xác định độ ẩm ban đầu và hàm lượng khoáng của vỏ tôm.
2. Xác định hàm lượng N - tổng có trong vỏ tôm bằng phương pháp
Kjeldahl.
3. Xác định hàm lượng N - amin có trong vỏ tôm theo phương pháp chuẩn
độ formol.
4. Xác định hàm lượng N - protein hoà tan có trong vỏ tôm bằng phương
pháp Bradford.
Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình lên men vỏ
tôm bằng L. acidophilus. Thực hiện quy trình lên men với các tỉ lệ nước 0,5:1; 1:1;
1,5:1; 2:1 và 2,5:1 (v:w). Các yếu tố cần phân tích:
1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ
nước bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1 N.
2. Xác định hàm lượng N - protein hoà tan trong dịch lên men sau các thời
gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp Bradford.
3. Xác định hàm lượng N - amin có trong dịch lên men sau các thời gian
lên men ở các tỉ lệ nước theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh giá
mức độ thuỷ phân protein.
4. Xác định hàm lượng N - tổng có trong dịch sau lên men.
27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
26
Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường đối với quá trình lên men vỏ
tôm bằng L. acidophilus. Thực hiện lên men với các tỉ lệ đường 15 %, 20 %, 25 %,
30 % và 35 %. Các yếu tố cần phân tích:
1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ
đường bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1 N.
2. Xác định hàm lượng N - protein hoà tan có trong dịch lên men sau các
thời gian lên men ở các tỉ lệ đường bằng phương pháp Bradford.
3. Xác định hàm lượng N - amin có trong dịch lên men sau các thời gian
lên men ở các tỉ lệ đường theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh
giá mức độ thuỷ phân protein.
4. Xác định hàm lượng N - tổng có trong dịch sau lên men.
5. Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men bằng phương
pháp acid dinitro – salisylic (DNS).
Nội dung 4: So sánh hiệu quả khử khoáng và khử protein bằng phương pháp
lên men lactic với các quá trình hóa học tương đương.
Đề nghị quy trình khử khoáng vỏ đầu tôm sú để sản xuất chitin
28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
27
Tìm được tỉ lệ nước thích
hợp cho quá trình lên men.
Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước
đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng LA.
Xác định
lượng acid
lactic sinh
ra trong
quá trình
lên men.
Xác định
hàm lượng
N- protein
hoà tan
trong dịch
lên men.
Xác định
hàm lượng
N - amin
có trong
dịch lên
men.
Xác định
hàm lượng
N - tổng
có trong
dịch sau
lên men.
Nội dung 1: xác định các thông số về thành
phần hoá học của nguyên liệu vỏ tôm.
Xác định
độ ẩm ban
đầu và hàm
lượng
khoáng của
vỏ tôm.
Xác định
hàm lượng
N – tổng
có trong
vỏ tôm.
Xác định
hàm lượng
N – amin
có trong
vỏ tôm.
Xác định
hàm lượng
N - protein
hoà tan có
trong vỏ
tôm.
29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
28
Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm của toàn bộ đồ án.
Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường
đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng LA.
Xác định
lượng acid
lactic sinh
ra trong
quá trình
lên men.
Xác định
hàm
lượng N -
protein
hoà tan
trong
dịch lên
men.
Xác định
hàm
lượng N -
amin có
trong
dịch lên
men.
Xác định
hàm
lượng N -
tổng có
trong vỏ
tôm.
Xác định
lượng
đường
khử còn
lại sau
quá trình
lên men.
Tìm được tỉ lệ đường thích
hợp cho quá trình lên men.
Nội dung 4: So sánh hiệu quả
khử khoáng và khử protein
bằng phương pháp lên men
lactic với các quá trình hóa học
tương đương.
30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
29
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nội dung 1: xác định các thông số về thành phần hoá học của
nguyên liệu vỏ tôm.
Tiến hành: vỏ tôm đã qua xử lý được thêm vào 20 ml nước cất, sau đó đem ly
tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút, lặp lại 2 lần. Phần dịch sau hai lần ly tâm được
trộn lẫn và định mức tới 50 ml gọi là dịch D1, rắn sau ly tâm gọi là R1.
Hình 2.3. Sơ đồ tóm tắt của nội dung 1.
Các yêu cầu của nội dung nghiên cứu 1 được thực hiện theo sơ đồ hình 2.2:
1. Xác định độ ẩm ban đầu và hàm lượng khoáng của vỏ tôm.
2. Xác định hàm lượng nitơ tổng có trong vỏ tôm bằng phương pháp
Kjeldahl.
Vỏ tôm đã xử lý (10g)
Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút
Khuấy trộn
20 ml nước cất
Rắn R1 Thu dịch
Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút
Rắn sau ly tâm Thu dịch
Khuấy trộn
20 ml nước cất
Định mức 50 ml
Dịch D1
31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
30
3. Xác định hàm lượng N - amin có trong vỏ tôm theo phương pháp chuẩn
độ formol.
4. Xác định hàm lượng N - protein hoà tan có trong vỏ tôm bằng phương
pháp Bradford.
Các phương pháp thực hiện được trình bày ở phần phương pháp tiến hành.
2.3.2. Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình lên
men vỏ tôm bằng L. acidophilus.
Thực hiện quy trình lên men với các tỉ lệ nước 0,5:1; 1:1; 1,5:1; 2:1 và 2,5:1
(v:w).
Chuẩn bị:
Vỏ tôm đã xử lý và bảo quản ở -4 o
C được đem rã đông.
Giống L. acidophilus được hoạt hoá bằng cách cho gói ANTIBIO 1 g vào 100
ml nước cất, khuất đều (10 8
CFU/ml).
Tiến hành:
Cho vào bao nilon các thành phần sau:
Bột vỏ tôm: 10 g.
Đường D – glucose: 1,5 g.
NaCl: 0,2 g.
Nước:đầu tôm với các tỉ lệ thí nghiệm (v:w): 0,5:1; 1:1; 1,5:1;
2:1; 2,5:1.
Giống L. acidophilus đã hoạt hoá: 1 ml.
Trộn đều các thành phần trên, sau đó cột chặt bằng thun để tạo điều kiện kị khí
và đem ủ ở nhiệt độ phòng.
Sau các khoảng thời gian 24, 48, 60, 72 giờ, đem dịch lên men đi ly tâm 4000
vòng trong 10 phút, thu dịch, sau đó cho thêm 20 ml nước cất vào, trộn đều và ly
tâm thêm 4000 vòng trong 10 phút thu dịch. Cả 2 phần dịch sau ly tâm được trộn
đều và định mức đến 50 ml (dịch D2), phần cặn sau đó được rửa nhiều lần bằng
nước (cặn R2).
32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
31
Hình 2.4. Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm của nội dung nghiên cứu 2.
Tổng số nghiệm thức cần thực hiện: 1 giống x 5 tỉ lệ x 3 lặp lại x 4 thời gian =
120 nghiệm thức.
Các yếu tố cần xác định trong phần thí nghiệm này:
1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ
nước bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1 N.
2. Xác định hàm lượng protein hoà tan trong dịch lên men sau các thời
gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp Bradford.
10 g vỏ tôm đã xử lý
Khuấy trộn
Đường D - glucose: 1,5 g.
NaCl: 0,2 g.
Nước: với các tỉ lệ thí
nghiệm.
Giống L. acidophilus đã
hoạt hoá: 1 ml. Lên men yếm khí
(nhiệt độ phòng, ở các thời gian
24, 48, 72, 96 giờ)
Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút
Rắn R2 Thu dịch
Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút
Rắn sau ly tâm Thu dịch
Khuấy trộn
20 ml nước cất
Định mức 50 ml
Dịch D2
33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
32
3. Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch lên men sau các thời gian
lên men ở các tỉ lệ nước theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh giá
mứ độ thuỷ phân protein.
4. Xác định hàm lượng tổng nitơ có trong dịch sau lên men.
Dựa vào kết quả của các thí nghiệm trên, ta tìm ra tỉ lệ nước thích hợp nhất
cho quá trình lên men.
2.3.3. Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường đối với quá trình
lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus.
Thực hiện lên men với các tỉ lệ đường 15 %, 20 %, 25 %, 30 % và 35 %.
Chuẩn bị:
Vỏ tôm đã xử lý và bảo quản ở -4 o
C được đem rã đông.
Giống L. acidophilus được hoạt hoá bằng cách cho gói ANTIBIO 1g vào
100ml nước cất, khuất đều (108
CFU/ml).
Tiến hành:
Thực hiện thí nghiệm như hình 2.4, nhưng khác phần nguyên liệu và thời gian
lên men.
Cho vào bao nilon các thành phần sau:
Bột vỏ tôm: 10 g.
Đường D – glucose với các tỉ lệ thí nghiệm: 1,5 g; 2 g; 2,5 g; 3 g; 3,5
g.
NaCl: 0,2 g.
Nước:đầu tôm với tỉ lệ (v:w): 2,5:1.
Giống L. acidophilus đã hoạt hoá: 1 ml.
Trộn đều các thành phần trên, sau đó cột chặt bằng thun để tạo điều kiện kị khí
và đem ủ ở nhiệt độ phòng.
Sau các khoảng thời gian 48, 60, 72, 96 giờ, lấy các bao nilon đi ly tâm 4000
vòng trong 10 phút, thu dịch, sau đó cho thêm 20 ml nước cất vào, trộn đều và ly
tâm thêm 4000 vòng trong 10 phút thu dịch. Cả 2 phần dịch sau ly tâm được trộn
34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
33
đều và định mức đến 50 ml (dịch D3), phần cặn sau đó được rửa nhiều lần bằng
nước (cặn R3).
Tổng số nghiệm thức cần thực hiện: 1 giống x 5 tỉ lệ x 3 lặp lại x 4 thời gian =
120 nghiệm thức.
Các yếu tố thí nghiệm:
1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ
đường bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N.
2. Xác định hàm lượng N protein hoà tan có trong dịch lên men sau các
thời gian lên men ở các tỉ lệ đường bằng phương pháp Bradford.
3. Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch lên men sau các thời gian
lên men ở các tỉ lệ đường theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh
giá mứ độ thuỷ phân protein.
4. Xác định hàm lượng tổng nitơ có trong dịch sau lên men.
5. Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men bằng phương
pháp acid dinitro – salisylic (DNS).
Từ các kết quả đạt được, ta tính toán được tỉ lệ đường nào thích hợp nhất cho
quá trình lên men.
2.3.4. Nội dung 4: so sánh phương pháp khử protein và khoáng bằng
phương pháp lên men lactic với phương pháp hoá học.
Khử khoáng và khử protein được thể hiện bằng tỉ lệ phần trăm như mô tả của
Rao và cộng sự (2000):
%𝐷𝑀 =
[𝐴𝑂 × 𝑂] − [𝐴𝑅 × 𝑅]
[𝐴𝑂 × 𝑂]
× 100
%𝐷𝑃 =
[𝑃𝑂 × 𝑂] − [𝑃𝑅 × 𝑅]
[𝑃𝑂 × 𝑂]
× 100
Với: %DM: tỉ lệ phần trăm khử khoáng.
%DP: tỉ lệ phần trăm khử protein.
PO và PR: nồng độ protein trước và sau lên men.
35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
34
AO và AR: % tro trong mẫu trước và sau lên men.
O và R: khối lượng mẫu trước và sau lên men.
Từ công thức trên ta tính được hiệu suất khử khoáng và khử protein của cả hai
phương pháp xử lý vỏ tôm bằng hoá học và sinh học.
2.3.4.1. So sánh hiệu suất khử khoáng của quy trình thí nghiệm với quy trình
phương pháp hoá học.
Phương pháp lên men lactic
Từ các nội dung nghiên cứu 2 và 3, ta tìm ra được tỉ lệ nước : vỏ đầu tôm và tỉ
lệ đường thích hợp cho quá trình lên men, dùng nghiệm thức đã chọn để xác định
khoáng trong mẫu còn lại nhằm so sánh hiệu suất với quá trình khử khoáng của
phương pháp hoá học.
Phương pháp hoá học
Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm 4.1.
Cân 10 g vỏ tôm đã qua xử lý vào bình tam giác 1 l, cho thêm HCl 0,25 M với
tỉ lệ 1:40 w:v. Lắc ở nhiệt độ phòng trong vòng 2 giờ, lọc chân không và thu cặn.
Phần cặn sau đó được đem đi xác định hàm lượng khoáng (cách xác định được trình
bày ở phần phương pháp tiến hành).
10 g Vỏ tôm đã được xử lý
Lắc 2 giờ ở nhiệt độ phòng
HCl 0,25 M tỉ lệ 1:40 w:v
Lọc
Thu cặn
Xác định hàm lượng khoáng
36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
35
2.3.4.2. So sánh hiệu suất xử lý protein của quy trình thí nghiệm với quy trình
từ phương pháp hoá học.
Phương pháp lên men lactic
Tương tự như khi so sánh hiệu suất khử khoáng, dùng nghiệm thức này để
định lượng N tổng số nhằm so sánh hiệu suất với quá trình xử lý protein của phương
pháp hoá học.
Phương pháp hoá học
Cân 20 g vỏ tôm đã qua xử lý vào bình tam giác 1 l, cho thêm NaOH 1 M với
tỉ lệ 15 mg/l. Ủ ở 70 o
C trong 24 giờ, lọc chân không và thu cặn. Phần cặn sau đó
được đem đi xác định hàm lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl (cách
xác định được trình bày ở phần phương pháp tiến hành).
Hình 2.6. Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm 4.2.
2.4 Phương pháp tiến hành
2.4.1. Xác định độ ẩm của mẫu cần phân tích
Tiến hành
Cốc đã được sấy khô và cân đo trước (m0)
Cân mẫu Rx chính xác đến 0,001 g, cho vào cốc trên (m1)
20 g Vỏ tôm đã được xử lý
Ủ 70 o
C trong 24 giờ
NaOH 1 M với tỉ lệ 15mg/l
Lọc
Thu cặn
Xác định hàm lượng N tổng số.
37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
36
Để cốc có chứa mẫu Rx vào tủ sấy ở nhiệt độ 105 ºC ± 2 ºC thời gian 3 giờ.
Sau đó làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng, đem cân chính xác đến
0,001 g (m2). Lập lại thao tác trên nhưng mỗi lần chỉ để khoảng 30 phút trong tủ sấy
cho đến khi lượng mất đi của hai lần cân liên tiếp không chênh lệch nhau quá 2 mg
hoặc 4 mg tuỳ theo khối lượng của phần mẫu thử.
Tính toán
Độ ẩm tính bằng % khối lượng được tính theo công thức sau:
Độ ẩm (%)=([m1 – m2] * 100)/(m1 – mo)
Trong đó:
mo : khối lượng cốc không (g)
m1 : khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g)
m2 : khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g)
2.4.2. Xác định hàm lượng khoáng trong mẫu phân tích
Tiến hành
Cho chén nung vào tủ sấy trong 2 giờ. Sau đó lấy chén ra và làm nguội trong
bình hút ẩm và đem cân để xác định khối lượng với độ chính xác 0,001 g (mo). Cân
khoảng 2 g mẫu Rx ở trạng thái khô không khí và cho vào chén nung đã biết khối
lượng với độ chính xác 0,001 g.
Cho chén và mẫu vào tủ sấy, sấy ở 105 o
C trong 2 – 3 giờ để cho nước có
trong mẫu bay đi hết, sau đó đặt chén mẫu vào lò nung và nung ở nhiệt độ 500 –
550 ºC trong 2 giờ.
Lấy ra ngoài làm nguội trong bình hút ẩm, đem mẫu đi cân ta có khối lượng
m2.
Kết quả
Hàm lượng tro thô của mẫu Rx được tính bằng % theo công thức:
X = ([m2 – m0] *100) /m1
Trong đó:
38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
37
X : hàm lượng tro thô của mẫu (%).
m2: khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g).
m0 : khối lượng chén (g).
m1 : khối lượng mẫu thử trước khi nung (g).
2.4.3. Xác định lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men
Độ acid được xác định bằng cách trung hòa với NaOH, sử dụng thuốc thử
phenolphtalein
Tiến hành
Cho 30 ml dịch Dx vào bình tam giác, thêm 3 giọt phenolphtalein.
Chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N đến khi dịch chuyển sang màu hồng tím.
Kết quả
% Khối lượng acid lactic sinh ra được tính theo công thức:
%g acid lactic = VNaOH/30*50/10*0.1/1000*90*100
Trong đó:
VNaOH: thể tích NaOH 0,1N chuẩn độ được.
30: số ml dịch Dx được đem đi chuẩn độ.
50: tổng số ml dịch Dx.
0,1: nồng độ NaOH dùng chuẩn độ.
1000: hệ số chuyển đổi ra g.
90: mỗi ml NaOH chuẩn độ tương đương với 90 mg acid lactic trong dịch Dx.
2.4.4. Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch sau lên
Tiến hành
Cho vào bình 10 ml dung dịch Dx, 15 giọt chit thị hỗn hợp, chỉnh độ pH bằng
dung dịch NaOH 0,1 N cho đến khi màu xanh xuất hiện.
39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
38
Cho thêm 5 ml formol trung tính, lúc này dung dịch có màu vàng rơm. Chuẩn
độ bằng NaOH 0,05N đến khi xuất hiện màu tím.
Mẫu trắng: thực hiện như trên, thay 10 ml Dx bằng 10 ml nước cất.
Tính kết quả
𝑁𝑎𝑚𝑖𝑛 =
(𝑛1−𝑛2)×0,007×50×1000
10×10
Trong đó:
N amin: Hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu (mg/g).
n1: số ml NaOH 0,05 N để chuẩn độ mẫu thí nghiệm.
n2: số ml NaOH 0,05 N để chuẩn độ mẫu trắng.
0,007: số g N amin tương ứng với 1ml NaOH 0,05N.
50: số ml dung dịch mẫu Dx ban đầu.
1000: hệ số chuyển đổi mg ra g.
10: số ml dung dịch Dx đem chuẩn độ.
10: số g nguyên liệu ban đầu.
2.4.5. Xác định hàm lượng protein hoà tan trong dịch sau lên men bằng
phương pháp Bradford
Nguyên tắc
Các protein khi phản ứng xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue-CBB) sẽ
hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường
độ màu tỷ lệ với protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao cho phép
phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
Tiến hành
Lập đồ thị chuẩn
Để dung dịch albumin có nồng độ từ 10-50 µg/ml ta thực hiện như sau:
40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
39
Bảng 2.2: Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn
Số ống ĐC 1 2 3 4 5
Nồng độ albumin (µg/ml) 0 10 20 30 40 50
Vml albumin 0 1 1 1 1 1
Vml H2O 1 0 0 0 0 0
Coomassie(ml) 2 2 2 2 2 2
Mẫu thí nghiệm: hút 0,1ml dịch Dx và 5ml thuốc thử Coomassie.
Ủ mẫu 20 phút và đo OD ở bước sóng 595nm.
Kết quả
Từ kết quả đo OD vẽ ra đồ thị đường chuẩn albumin dạng y = ax + b
Hàm lượng N protein (mg/g) =([y-b]/a)*50/10/6,25
Trong đó:
y là kết quả OD của mẫu thí nghiệm
a và b là hai hằng số trong đường chuẩn albumin.
50: số ml dịch Dx.
10: số g nguyên liệu ban đầu.
6,25: hệ số chuyển đổi từ protein hoà tan sang N protein.
2.4.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số có trong vỏ tôm sau khi lên men
Tiến hành
Vô cơ hóa mẫu
Cân 0,2 g mẫu bột vỏ tôm cần xác định N tổng, cho vào bình Kjeldahl, cho
tiếp 5 ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxy
hóa). Cho thêm vào 0,2 g chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt bình
Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh.
41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
40
Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi
thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở
trên thành bình còn chưa bị oxi hóa vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi
dung dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình
định mức 100 ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến
vạch.
Cất đạm
Chuyển 25 ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn
50 ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro, lúc này trong bình có màu tím hồng.
Tiếp tục cho vào bình cất 20 ml NaOH 45 % cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển
sang màu xanh lá mạ (thêm 5 ml NaOH 45 % nếu dung dịch trong bình chưa
chuyển hết sang màu xanh lá mạ).
Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20 ml H2SO4 0,1 N và 3
giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập
đầu ống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm. Kiểm tra xem hơi ra từ đầu ống sinh hàn có
làm xanh giấy quỳ không, nếu không thêm NaOH 45 %.
Sau khi cất đạm 20 – 25 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không,
dùng giấy quỳ thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy quỳ không đổi màu xanh là được.
Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa.
Chuẩn độ
Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.,1N cho đến khi mất màu
tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ, ghi nhận thể tích NaOH 0,1N sử dụng.
Tính kết quả:
Khối lượng nitơ tổng số có trong mẫu được tính theo công thức:
N (g) = [{1,42 * (V1-V2)*100/a}*4/1000]*10/100
Trong đó:
V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng.
V2: số ml NaOH 0,1N đã chuẩn độ.
42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
41
a: số g nguyên liệu đem vô cơ hoá mẫu.
1,42: hệ số, cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với
1,42 mg Nitơ.
2.4.7. Xác định hàm lượng nitơ tổng có trong dịch sau khi lên men
Hàm lượng N tổng trong dịch sau lên men (mg/g) được tính bằng công thức
N tổng trong dịch (mg/g) = N protein (mg/g) + N amin (mg/g)
2.4.8. Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men bằng
phương pháp DNS
Tiến hành
Lập phương trình đường chuẩn D – glucose:
Cân 1 g D – glucose tinh khiết 99 % pha loãng với nước cất đến 100 ml (dung
dịch 1)
Bảng 2.3. Phương pháp lập đường chuẩn DNS
Ống nghiệm ĐC’ 1’ 2’ 3’ 4’ 5’
Dung dịch 1 (ml) 0 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9
Nước cất (ml) 10 9,9 9,7 9,5 9,3 9,1
Lấy 1 ml từ 7 ống nghiệm trên (dung dịch 2) cho vào 7 ống ủ mẫu
Ống nghiệm ĐC 1 2 3 4 5
Dung dịch 2 (ml) 1 1 1 1 1 1
Thuốc thử DNS (ml) 3 3 3 3 3 3
Đậy nắp các ống nghiệm ĐC, 1, 2, 3, 4, 5 lại, đun cách thuỷ 5 phút, để nguội
và đo ở bước sóng 540mm.
Từ kết quả OD, vẽ đồ thị đường chuẩn D – glucose.
43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
42
Mẫu thí nghiệm: Pha loãng dịch Dx tỉ lệ n lần, lấy 1ml dịch đã pha loãng với 3
ml thuốc thử DNS đun cách thuỷ 5 phút, để nguội và đo ở bước sóng 540 mm. Chú
ý pha loãng sao cho kết quả OD của mẫu thí nghiệm nằm trong khoảng đường
chuẩn D – glucose.
Kết quả
Từ phương trình đồ thị đường chuẩn tính được X (mg/ml) đường khử trong
dung dịch Dx pha lõang, nhân với hệ số pha lõang n để được lượng đường trong 1
ml dung dịch gốc.
Tính hàm lượng đường trong nguyên liệu (mg/g) = X*n*V/m
Trong đó:
X: lượng đường khử trong dung dịch Dx pha lõang (mg/ml).
V: thể tích dịch Dx (ml)
m: khối lượng mẫu ban đầu (g)
n: hệ số pha loãng.
44. 43
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Nội dung 1: xác định thành phần hoá học của nguyên liệu vỏ đầu
tôm.
Để thuận tiện cho các tính toán về sau và xác định hiệu suất quá trình lên men,
việc xác định các thành phần hoá học trong vỏ tôm là điều rất cần thiết.
Bảng 3.1. Thành phần hoá học của vỏ tôm
Thành phần Nguyên liệu vỏ tôm (%
khối lượng tươi)
Ẩm độ 77,43 ± 8,31
Khoáng 6,41 ± 0,22
N tổng số 4,07 ± 0,06
N amin (dịch trích ly) 0,037 ± 0,018
N protein (dịch trích ly) 0,059 ± 0,018
Theo Black và Schwartz (1950), chitin chứa 6,9 % là N trong thành phần, từ
các thành phần trên, có thể suy ra % khối lượng chitin trong mẫu.
Trong vỏ tôm, N tồn tại ở hai dạng: vô cơ và hữu cơ. Có thể nói, N vô cơ chủ
yếu trong vỏ tôm là N của chitin, vậy nên, N chitin = N tổng số – N hữu cơ.
Mặt khác, N hữu cơ trong vỏ tôm sau quá trình ly tâm có thể tính bằng công
thức: N tổng trong dung dịch = N protein +N amin.
Từ đó, ta suy ra được % Chitin trong mẫu được tính bằng công thức:
% chitin = (% N tổng số – [% N protein + % N amin]) x 6,9 = 27,42 %
So với các nghiên cứu trước đây trên thế giới (trung bình 27%), %chitin trong
bài báo cáo này không có thay đổi gì đáng kể.
45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
44
3.2. Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình
lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus
Trong vỏ tôm tồn tại nhiều ion kim loại nhưng nhiều nhất là Ca2+
và Mg2+
. Vì
vậy, quá trình khử khoáng trong vỏ tôm nhằm thu nhận chitin chủ yếu là loại bỏ hai
ion này. Ca2+
và Mg2+
đều có khả năng tạo thành muối tan trong HCl và các acid
hữu cơ như acid lactic.
Tỉ lệ nước rất quan trọng đối với quá trình lên men lactic vì nó ảnh hưởng trực
tiếp tới lượng acid lactic sinh ra trong phản ứng. Trong quy trình lên men vỏ đầu
tôm thu chitin, vấn đề này lại càng quan trọng hơn, vì lượng acid sinh ra ảnh hưởng
trực tiếp đến quá trình khử khoáng nhằm thu nhận chitin.
3.2.1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ
lệ nước
Trong quá trình lên men, từ 24 giờ đầu tiên, kết quả đã cho thấy có sự lên men
ở tất cả các tỉ lệ nước. pH của dịch lên men giảm từ 7 xuống còn khoảng 4 và giữ
nguyên ở các thời gian tiếp theo. Lượng acid sinh ra qua các thời gian có sự tăng lên
rõ rệt.
Hình 3.1. Kết quả % khối lượng acid lactic sinh ra ở các tỉ lệ nước sau các
thời gian lên men.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
24 48 72 96
% acid lactic
THỜI GIAN (GiỜ)
% Khối lượng acid lactic tổng hợp trong quá trình lên
men với các tỉ lệ nước:nguyên liệu
0,5 : 1
1 : 1
1,5 : 1
2 : 1
2,5 : 1
46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
45
Theo kết quả ở hình 3.1, % khối lượng acid lactic sinh ra ở các tỉ lệ đều có sự
khác biệt với sai khác có ý nghĩa thống kê với p – value ≤ 0,05. Ở tỉ lệ nước 2,5:1
v:w có thể cho thấy lượng acid lactic nhiều hơn hẳn so với các tỉ lệ nước khác và
các thời gian khác.
Tuy nhiên, ở các thời gian và tỉ lệ nước này, người làm đề tài chưa tìm ra được
đỉnh của quá trình sinh acid lactic là tại thời điểm nào. Vì vậy, nên kéo dài thời gian
lên men thêm để có thể xác định chính xác thời gian sinh mà quá trình lên men sinh
acid lactic nhiều nhất.
3.2.2. Xác định hàm lượng protein hoà tan trong dịch lên men sau các
thời gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp Bradford.
Hình 3.2. Kết quả hàm lượng N - protein ở các thời gian của các tỉ lệ nước
khác nhau.
Trong quá trình lên men lactic, L. acidophilus đã phân huỷ một phần protein
trong dịch lên men thành N amin. Điều này lý giải cho việc hàm lượng N protein
giảm dần qua các thời gian một cách rõ rệt.
Ở các tỉ lệ nước, tỉ lệ 2,5:1 v:w cho thấy hàm lượng N protein giảm rõ rệt nhất
và khác biệt với các tỉ lệ nước khác với mức ý nghĩa thống kê p – value ≤ 0,05.
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
0 24 48 72 96
HÀM LƯỢNG
N-PROTEIN
(mg/g)
THỜI GIAN (GiỜ)
HÀM LƯỢNG N-PROTEIN (mg/g) SAU CÁC THỜI
GIAN LÊN MEN VỚI CÁC TỈ LỆ NƯỚC KHÁC NHAU
0,5 : 1
1 : 1
1,5 : 1
2 : 1
2,5 : 1
47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
46
3.2.3. Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch lên men sau các thời
gian lên men ở các tỉ lệ nước
Hàm lượng N - amin của có trong dịch sau các thời gian lên men được trình
bày ở hình 3.4.
Hình 3.3. Kết quả hàm lượng N - amin ở các thời gian của các tỉ lệ nước khác
nhau.
Qua các thời gian, lượng N - amin trong dịch lên men tăng lên đáng kể. Điều
này cho thấy có sự phân giải protein trong vỏ tôm nguyên liệu thành các N - amin.
Sự sai khác giữa các thời gian lên men cũng như các tỉ lệ nước đều mang ý nghĩa
thống kê với p –value ≤ 0,05 nhưng không khác biệt rõ ràng ở các tỉ lệ nước, cụ thể
là có sự tương đồng ở hai tỉ lệ 2,5:1 và 2:1 (v:w).
Nhìn vào đồ thị và số liệu, có thể thấy ở tỉ lệ nước 2,5:1 v:w và thời gian 96
giờ, hàm lượng N - amin đạt cực đại. Tuy nhiên, sự khác biệt về hàm lượng N -
amin ở các tỉ lệ nước là không đáng kể cũng như chưa thất được đỉnh của quá trình
phân giải protein. Người thực hiện đề tài nên kéo dài thời gian lên men để tìm ra
thời gian thích hợp nhất cho quá trình này.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
0 24 48 72 96
HÀM LƯỢNG
N-AMIN (mg/g)
THỜI GIAN (GiỜ)
HÀM LƯỢNG N-AMIN (mg/g) SAU CÁC THỜI GIAN
LÊN MEN VỚI CÁC TỈ LỆ NƯỚC KHÁC NHAU
0,5 : 1
1 : 1
1,5 : 1
2 : 1
2,5 : 1
48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
47
3.2.4. Xác định hàm lượng nitơ tổng có trong dịch sau khi lên men
Tổng N có trong dung dịch sau lên men tức tà N của protein thịt tôm được hòa
tan vào dịch lên men lactic. Giá trị này bao gồm N - protein hòa tan, N - amin có
nguồn gốc từ protein thủy phân, nhưng giá trị này không bao gồm được phần N đã
bị vi khuẩn đồng hóa. Do đó giá trị này được sử dụng để tham khảo, là bằng chứng
của protein thịt tôm hòa tan vào dịch lên men có thể giảm nếu tốc độ đồng hóa của
vi khuẩn cao hơn tốc độ hòa tan và thủy phân.
Hình 3.4. Kết quả hàm lượng N tổng ở các thời gian của các tỉ lệ nước khác
nhau.
Dựa vào hình trên, ta có thể thấy ở tỉ lệ nước 2,5:1, hàm lượng tổng N không
khác biệt nhiều khi so sánh giữa các tỉ lệ nước. Điều này hợp lý vì protein hòa tan từ
trong thịt đầu tôm vào nước có thể tồn tại dưới dạng protein hay dạng thủy phân của
chúng.
Tóm lại, dựa vào các kết quả thu được ở nội dung nghiên cứu 2, người thực
hiện đề tài đã lựa chọn tỉ lệ nước 2,5:1 v:w vì nhận thấy rằng ở tỉ lệ nước này, khả
năng sinh acid lactic là lớn nhất, các kết quả N - protein thấp hơn, N - amin cao hơn
so với các tỉ lệ còn lại.
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
0 24 48 72 96
HÀM LƯỢNG
N tổng (mg/g)
THỜI GIAN (GiỜ)
HÀM LƯỢNG N TỔNG SỐ TRONG DUNG DỊCH (mg/g)
SAU CÁC THỜI GIAN LÊN MEN VỚI CÁC TỈ LỆ
NƯỚC KHÁC NHAU
0,5 : 1
1 : 1
1,5 : 1
2 : 1
2,5 : 1
49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
48
Đồng thời, các khoảng thời gian lên men ở các thí nghiệm trên chưa cho biết
được thời gian có lượng acid lactic là lớn nhất, người thực hiện đề tài đã kéo dài
thời gian lên men lactic vỏ đầu tôm và tiến hành lấy mẫu khảo sát ở 48, 72, 96 và
120 giờ để tìm ra thời gian thích hợp nhất cho quá trình lên men.
3.3. Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường đối với quá trình
lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus.
Đường là cơ chất chủ yếu của quá trình lên men lactic. Đề tài này sử dụng
nguồn đường D – glucose vì đây là nguồn đường dễ sử dụng nhất cho VSV.
Việc xác định hàm lượng đường trong quá trình lên men rất quan trọng vì nó
sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới cá quá trình sinh tổng hợp của VSV. Nếu L. acidophilus
đủ cơ chất để hoạt động, quá trình lên men sẽ đạt cực đại về lượng acid sinh ra,
đồng thời các enzyme hoạt động cũng mạnh mẽ hơn. Tuy nhiên, nếu chọn hàm
lượng đường quá cao sẽ ức chế VSV phát triển, nếu quá thấp sẽ không đủ cơ chất
cho VSV sống, cả hai vấn đề này đều ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất của quá
trình lên men.
3.3.1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ
lệ đường
Trong quá trình lên men, pH của dịch lên men luôn ở khoảng 4 đến 4,5. Tuy
nhiên, ở mốc thời gian 120 giờ, pH đã tăng lên khoảng từ 4,8 đến 5. Điều này chứng
tỏ đến thời gian này xuất hiện một quá trình khác đan xen, có thể là do hoạt động
của các enzyme decarboxylase do vi khuẩn lactic sinh ra, làm xuất hiện các
bioamine, dẫn đến tăng pH. Hiện tượng này cũng thừơng xuất hiện ở thực phẩm lên
men. Để kéo dài thời gian lên men lactic và giữ pH ổn định lâu dài ở 4 - 4,5, cần
tuyển chọn những chủng không có hoạt lực amino acid decarboxylase.
50. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
49
Hình 3.5. Kết quả % khối lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở
các tỉ lệ đường khác nhau
Nhìn vào đồ thị trên, ta có thể nhận thấy mốc thời gian 96 giờ cho kết quả %
khối lượng acid lactic tốt nhất và đạt đỉnh của quá trình sinh acid lactic ở tỉ lệ đường
35 %. Nhưng theo các số liệu đạt được, sự sai khác giữa hai tỉ lệ 25 và 30 % là
không đáng kể.
3.3.2. Xác định hàm lượng N - protein hoà tan có trong dịch lên men sau
các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường
Cơ chất đường có ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình sinh trưởng của L.
acidophilus, từ đó gián tiếp ảnh hưởng đến quá trình phân huỷ protein trong vỏ tôm,
vì nếu VSV không phát triển tốt sẽ không sinh nhiều enzyme protease, enzyme
chính trong quá trình khử protein.
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
48 72 96 120
% acid lactic
THỜI GIAN (GiỜ)
% Khối lượng acid lactic tổng hợp trong quá trình lên
men với các tỉ lệ đường
15
%
20
%
25
%
30
%
51. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
50
Hình 3.6. Kết quả hàm lượng N - protein ở các thời gian của các tỉ lệ đường
khác nhau.
Nhìn vào đồ thị, có thể thấy rõ sự giảm mạnh của hàm lượng N - protein qua
các thời gian. Tuy nhiên, sự suy giảm hàm lượng N - protein trong dung dịch gần
như đồng đều ở tất cả các tỉ lệ nước và các sai khác này không có ý nghĩa về mặt
thống kê do p – value >0,05.
Với kết quả này, người thực hiện đề tài không thể xác định với tỉ lệ nước nào
thì cho kết quả hàm lượng N protein giảm nhiều nhất, hay nói cách khác, không có
sự khác biệt về khả năng phân huỷ protein của L. acidophilus ở các tỉ lệ nước khác
nhau.
3.3.3. Xác định hàm lượng N - amin có trong dịch lên men sau các thời
gian lên men ở các tỉ lệ đường.
Kết quả trên đã cho thấy, với thời gian 96 giờ, hàm lượng N - amin đạt cực
đại. Tuy nhiên, khác biệt về sự ảnh hưởng của tỉ lệ đường đến hàm lượng N - amin
là chỉ có ý nghĩa thống kê (p – value ≤ 0,05) để phân biệt tỉ lệ đường 15 %, 20 %
với 25-30 % và 35 %, nhưng không có khác biệt giữa 25 và 30 % đường bổ sung.
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
0 48 72 96 120
HÀM LƯỢNG
N-PROTEIN
(mg/g)
THỜI GIAN (GiỜ)
HÀM LƯỢNG N - PROTEIN (mg/g) SAU CÁC THỜI
GIAN LÊN MEN VỚI CÁC TỈ LỆ ĐƯỜNG KHÁC
NHAU
15%
20%
25%
30%
35%
52. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
51
Điều này phù hợp với kết quả theo dõi ảnh hưởng của tỉ lệ đường lên % acid lactic
tạo thành. Hàm lượng N - amin phản ảnh hoạt tính thủy phân protein của vi khẩun
lactic trong lên men lactic do đó phải tương đồng với cường độ lên men. Trong khi
đó hàm lượng N - protein không phản ánh nhiều lắm hoạt động thủy phân, nhưng
tổng số N - protein và N - amin lạ là bằng chứng của sự khử protein ra khỏi vỏ đầu
tôm.
Hình 3.7. Kết quả hàm lượng N - amin ở các thời gian của các tỉ lệ đường
khác nhau.
3.3.4. Xác định hàm lượng nitơ tổng có trong dịch lên men
Hàm lượng N tổng trong dịch D3 được tính như thí nghiệm trên.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
0 48 72 96 120
HÀM LƯỢNG
N-AMIN (mg/g)
THỜI GIAN (GiỜ)
HÀM LƯỢNG N - AMIN (mg/g) SAU CÁC THỜI GIAN
LÊN MEN VỚI CÁC TỈ LỆ ĐƯỜNG KHÁC NHAU
15
%
20
%
25
%
30
%
53. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
52
Hình 3.8. Kết quả hàm lượng N tổng ở các thời gian của các tỉ lệ đường khác
nhau.
Qua kết quả trên (hình 3.9), có thể thấy trừ ở tỉ lệ 35% D – glucose bổ sung,
hàm lượng N tổng giảm tương đương nhau với sai khác không mang ý nghĩa thống
kê. Việc N - tổng số giảm như đã nói ở trên có thể do bị vi khuẩn sử dụng tiếp tục
sự dụng, tuy nhiên chưa có bằng chứng rõ ràng.
3.3.5. Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men
Lượng đường tồn dư cũng là một thông số sử dụng để kiểm soát quá trình lên
men. Lượng đường bổ sung làm cơ chất cho quá trình lên men không nên tồn dư
sau lên men dễ dẫn đến làm cơ chất cho những vi sinh vật khác. Bảng 3.2 cho thấy
với tỉ lệ đường bổ sung 15, 20, lên men lactic tiêu thụ cạn kiệt đường, bổ sung
25 %, đường tồn dư rất ít chỉ còn 10 mg/g nguyên liệu và hết sau 120 h, trong khi
với 30, 35% đường bổ sung thì lượng đường tồn dư tương đương nhau, tồn dư 35
mg/g nguyên liệu sau 96 giờ và 10 mg/g nguyên liệu sau 120 giờ.
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
0 48 72 96 120
HÀM LƯỢNG
NITƠ (mg/g)
THỜI GIAN (GiỜ)
HÀM LƯỢNG NITƠ TỔNG TRONG DUNG DỊCH
(mg/g) SAU CÁC THỜI GIAN LÊN MEN VỚI CÁC
TỈ LỆ ĐƯỜNG KHÁC NHAU
15%
20%
25%
30%
35%
54. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
53
Bảng 3.2. Kết quả hàm lượng đường khử (mg/g) trong dịch sau lên men
Giờ
% D-glucose
15% 20% 25% 30% 35%
0 228,0 250,6 280,7 319,0 358,2
48 19,9 26,4 39,4 94,4 95,5
72 9,8 10,8 31,0 69,2 86,3
96 0,0 0,0 9,6 34,2 38,8
120 0,0 0,0 0,0 9,6 9,8
Dựa vào bảng số liệu trên, ta có thể rằng lên men lactic cho % lactic acid cực
đại ở 96 giờ nhưng sau đó vẫn tiếp tục sử dụng đường và nguồn Nitơ trong dịch lên
men. Liệu đây có phải là tạp nhiễm hay không điều này còn cẩn được làm rõ nhằm
tối ưu hóa các thông số của quá trình sau này.
Tóm lại, dựa vào các thí nghiệm trên, người thực hiện đề tài đã rút ra các kết
luận sau đây:
Về tỉ lệ nước, tỉ lệ nước 2,5:1 v:w đã cho các kết quả về % khối lượng acid
lactic và khả năng phân huỷ protein tốt hơn so với các tỉ lệ nước khác. Có thể nói
đay là tỉ lệ nước tối ưu cho quá trình lên men
Về tỉ lệ D – glucose, ở tỉ lệ 25 – 30 % và 96 giờ, kết quả đã cho thấy đây là
đỉnh của quá trình sản sinh acid lactic, điều kiện cho quá trình phân huỷ Canxi trong
vỏ tôm nhằm thu chitin. Ngoài ra, các kết quả về khả năng phân huỷ protein của L.
acidophilus ở tỉ lệ này cũng rất tốt.
Vì các lý do trên, người thực hiện đề tài đã chọn ra được quy trình lên men
được cho là tối ưu nhất để tiến hành lên men thu chitin từ vỏ tôm bằng L.
acidophilus như sau:
55. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
54
Nguyên liệu: Đầu vỏ tôm sú, bổ sung đường 25 – 30 %, bổ sung muối 2 %, tỉ
lệ nước/nguyên liệu = 2,5:1, tỉ lệ cấy giống 1 % so với nguyên liệu tươi, tương
đương 108
cfu/ml.
Thời gian lên men lactic 96 giờ, sau đó thu hồi chitin bằng cách ly tâm rửa thu
hồi bã sấy khô.
3.4. Nội dung 4: So sánh hiệu quả khử khoáng và khử protein bằng
phương pháp lên men lactic với các quá trình hóa học tương đương
Ứng dụng công nghệ sinh học trong vấn đề xử 1ý chất thải rắn cũng như tái sử
dụng chất thải biến chúng thành các sản phẩm có giá trị chỉ có thể đi vào thực tế
được khi các quá trình sinh học này có hiệu quả tương đương các quá trình hóa học.
Khử khoáng bằng phương pháp hóa học được thực hiện ở nhiệt độ phòng với HCl
0,25 M trong 2 giờ và khử protein bằng NaOH 1 M ở 70 o
C trong 24 giờ.
So sánh hiệu quả khử khoáng và khử protein bằng lên men lactic với các quá
trình hóa học tương đương theo công thức của Rao và cộng sự (2000).
Hiệu quả khử khoáng của quá trình lên men lactic và quá trình hóa học sử
dụng HCl được trình bày trên bảng 3.3. Với quy mô nhỏ phòng thí nghiêm có thể
thấy hai quá trình khử khoáng hóa học và sinh học là tương đương và khử khoáng
hầu như triệt để.
Bảng 3.3. Hiệu quả khử khoáng
Quy
trình
% khoáng
đầu
KL mẫu
ban đầu, g
% khoáng
sau
KL mẫu
sau, g
HS khử
khoáng, %
PPHH 6,41 10 0,028 6,95 99,7
PPSH 6,41 10 0,015 6,11 99,9
56. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
55
Khác với quá trình khử khoáng, quá trình khử protein sinh học tỏ ra còn thua
xa quá trình khử protein hóa học, mới đạt 30 % so với 73 % của quá trình sinh
học (Bảng 3.3)
Bảng 3.4. Hiệu quả khử protein
Quy
trình
% N tổng
số đầu
KL mẫu
ban đầu, g
% N tổng
số sau
KL mẫu
sau, g
HS khử
protein, %
PPHH 4,07 20,00 2,27 9,79 72,7
PPSH 4,07 10,00 5,02 5,70 29,9
Quá trình lên men lactic chủ yếu là để khử khoáng, tận dụng enzyme protease
của vi khuẩn lactic để khử protein, nhưng enzyme protease của vi khuẩn lactic
thường yếu hơn rất nhiều vi sinh vật khác. Muốn tăng hiệu quả cần nghiên cứu bổ
sung chế phẩm protease thương mại hoặc sử dụng các vi sinh vật sinh protease tiềm
năng như nhiều nghiên cứu sử dụng Bacillus spp.
Từ các kết quả trên đây chúng tôi đề nghị quy trình khử khoáng vỏ đầu tôm sú
để sản xuất chitin như sau:
57. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
56
Hình 3.7. Quy trình đề xuất thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng L. acidophilus
Vỏ tôm đã nghiền <2 mm
Trộn đều
Đường D – glucose: 25-30 %
NaCl: 2 %
Nước: vỏ tôm = 2,5:1 (v:w)
Giống LA đã hoạt hoá: 10 %
(108
cfu/ml) Lên men yếm khí
(nhiệt độ phòng, 96 giờ)
Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút
Rắn sau ly tâm Bỏ dịch
Rửa trung tính
Khử protein
Chitin thô
58. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
57
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Đầu vỏ tôm sú ẩm độ (77,43 ± 8,31) %, khoáng (6,41 ± 0,22) %, N tổng số
(theo Kjeldahl) (4,07 ± 0,06) % được ước tính chứa 27,42 % chitin.
Quá trình lên men lactic đầu vỏ tôm sử dụng Lactobacillus acidophilus từ chế
phẩm ANTIBIO đạt tỉ lệ acid lactic cao nhất sau 96 giờ khi tỉ lệ nước/nguyên liệu là
2.5:1 và tỉ lệ đường D-glucose bổ sung là 25 – 30 % so với nguyên liệu tươi.
Đồng thời, hàm lượng khoáng giảm từ 0,64 đến 0,015 % và khối lượng mẫu
giảm 38,9 %, dẫn đến hiệu quả khử khoáng là 99,9 %. Hiệu suất khử khoáng củ
phương pháp này tương đương với hiệu suất khử khoáng bằng phương pháp hóa
học sử dụng HCl 0,25 M ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ với tỉ lệ 40:1 (thể tích/khối
lượng).
Cũng trong điều kiện này hàm lượng N protein trong dịch ly tâm sau lên men
lactic giảm 72,4 %, nhưng N - amin tăng 62,8 %. Hiệu suất khử protein là 29,9 %,
thấp hơn rất nhiều so với cao hơn hiệu suất khử protein bằng phương pháp hóa học
là 72,3 % khi sử dụng NaOH 1 M ở nhiệt độ 70 o
C trong 24 giờ với tỉ lệ 15:1 (thể
tích/khối lượng).
Từ đó đề xuất được quy trình khử khoáng từ vỏ đầu tôm sú bằng phương pháp
lên men lactic với các thông số kỹ thuật như sau:
- Tỉ lệ nứơc/nguyên liệu xay nhuyễn là 2.5:1 v:w.
- Tỉ lệ đường bổ sung là 25 – 30 %.
- Tỉ lệ cấy giống L. acidophilus là 10 % (108
cfu/ml).
- Thời gian lên men lactic là 96 giờ.
4.2. Kiến nghị
Ngoài L. acidophilus, cần nghiên cứu thêm các giống vi khuẩn lên men lactic
khác để chọn ra chủng có hiệu suất cao hơn. Có thể bổ sung thêm các enzyme phân
huỷ protein hoặc các chủng VSV khác vào để thu được hiệu suất phân huỷ protein
tốt hơn.
59. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
58
Có thể nghiên cứu để VSV lên men từ các loại đường khác rẻ hơn, như mật rỉ
đường, để giảm giá thành sản suất.
Ngoài ra, trong đề tài này chỉ chú trọng phần chitin trong vỏ tôm mà không
quan tâm đến một hợp chất cũng không kém phần quan trọng: caroteniod. Nếu
trong quá trình lên men ta có thể trích ly cả hợp chất này sẽ thu về một khoảng lợi
nhuận không nhỏ cho nhà sản xuất.
60. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu là sách:
[1] Nguyễn Văn Mùi (2007), Thực hành hoá sinh học, NXB đại học quốc
gia Hà Nội.
[2] Phạm Văn Tình (2005), Kỹ thuật nuôi tôm sú, NXB nông nghiệp.
Tài liệu là bài báo trong tạp chí:
[3] S. Bautista-Ban˜osa, A.N. Herna´ ndez-Lauzardo, M.G. Vela´ zquez-
del Valle, M. Herna´ ndez-Lo´ pez , E. Ait Barka, E. Bosquez-Molina, C.L. Wilson
(2005). Chitosan as a potential natural compound to control pre and postharvest
diseases of horticultural commodities, USA.
[4] Luis A. Cira, Sergio Huerta, George M. Hall, Keiko Shirai (2001).
Pilot scale lactic acid fermentation of shrimp wastes for chitin recovery, a
Departamento de Biotecnologia, Univ ersidad Autonoma Metropolitana, Mexico,
D.F. Av . San Rafael Atlixco No. 186 Col. Vicentina C.P. 09340 Mexicob
Department of Chemical Engineering, Loughborough University, UK.
[5] Hermann Ehrlich, Petros G. Koutsoukos , Konstantinos D. Demadis ,
Oleg S. Pokrovsky. Part II. Decalcification, Principles of demineralization:
Modern strategies for the isolation of organic frameworks, Micron 4D, 2009,
Germany.
[6] Maria Hayes. Chapter 4: Chitin, Chitosan and their Derivatives from
Marine Rest Raw Materials: Potential Food and Pharmaceutical Applications, ,
Chitin, Chitosan and Chitooligosaccharides, Ireland.
[7] Nicole Krueziger Keppy, Michael W. Allen, Ph.D. The Biuret Method
for the Determination of Total Protein Using an Evolution Array 8-Position Cell
Changer, Thermo Fisher Scientific, Madison, WI, USA.
[8] Pradip Kumua Dutta, Joydeep Dutta, VS Tripathi (2004). Chitin and
chitosan: Chemistry, properties and applications, Department of Chemistry, Motilal
Nehru National Institute of Technology, Allahabad 211 004.
[9] A. Khanafari, R. Marandi, Sh. Sanatei (2007). Recovery of chitin and
chitosan from shrimp waste by chemical and microbial methods, Department of
61. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
60
Microbiological Sciences, Islamic Azad University, North of Tehran branch, Iran,
Department of Environmental Engineering, Islamic Azad University, North of
Tehran branch, Iran.
[10] Bhaskar Narayan, Suresh Puthanveetil Velappan, Sakhare Patiram
Zituji, Sachindra Nakkerike (2009). Yield and chemical composition of fractions
from fermented shrimp biowaste, India.
[11] Kandra Prameela, Ch. Murali Mohan, P.V. Smitha, K.P.J. Hemalatha
(2010). Bioremediation of shrimp biowaste by using natural probiotic for chitin and
carotenoid production an alternative method to hazardous chemical method,
Department of Biotechnology, GITAM Institute of Technology, Rushikonda,
GITAM University, Visakhapatnam 530 045, India. Department of Biochemistry,
College of Science and Technology, Andhra University, Visakhapatnam 530 045,
India.
[12] Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần
Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp, Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len, Bùi Thị Thu
Huyền (2010). Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo
quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại, Viện Vi sinh
vật và CNSH - Đại học Quốc Gia Hà Nội, Viện Chăn nuôi.
[13] Ths. Thạch Thanh, Ks. Tăng Minh Khoa, Ks. Phạm Văn Quyết, Ts.
Nguyễn Văn Hòa, (2005). Nghiên cứu ứng dụng nước biển nhân tạo trong sản xuất
giống tôm sú (Penaeus monodon) qua hệ thống lọc sinh học tuần hoàn, khoa Thủy
sản, Trường Đại Học Cần Thơ
Tài liệu là luận văn, luận án
[14] Đặng Tiến Đông (2010). Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm, Đại học
Kỹ Thuật Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh, thành phố Hồ Chí Minh.
[15] Bùi Đức Tài (2008), Thiế kế kỹ thuật thiết bị sản xuất chitin năng suất
0,5 tấn/mẻ, khoa cơ khí, trường đại học Nha Trang, Nha Trang.
[16] Trần Thị Hoài Thanh (2007), Khảo sát qui trình sản xuất một số sản
phẩm tôm đông lạnh tại công ty TNHH thực phẩm Amanda. Đề xuất biện pháp
nâng cao chất lượng và tận dụng phế liệu.
62. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
61
[17] Đỗ Như Ý (2011), khảo sát quy trình chế biến tôm sú đông lạnh tại
công ty cổ phần đầu tư thương mại thủy sản INCOMFISH, trường ĐH Hùng
Vương, thành phố Hồ Chí Minh.
63. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đây là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân tôi, dưới sự
hướng dẫn của TS Nguyễn Hoài Hương, được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu
thực nghiệm tại phòng thí nghiệm, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM.
Tất cả các kết quả và số liệu là trung thực, hoàn toàn không sao chép và chưa
được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời
cam đoan này.
Ngày 1 tháng 8 năm 2012
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Ngọc Thu
64. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ii
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô ngành Công nghệ Sinh
học, Khoa Môi Trường và Công nghệ Sinh học trường Đại Học Kỹ Thuật Công
Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức cơ bản
trong suốt 4 năm Đại học.
Con xin cảm ơn mẹ ba đã nuôi dạy con khôn lớn, luôn ủng hộ, động viên, tạo
mọi điều kiện cho con yên tâm học tập.
Em xin gởi lời cám ơn chân thành nhất đến Cô TS Nguyễn Hoài Hương đã tận
tình quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành đồ án
tốt nghiệp.
Em cảm ơn Thầy Nguyễn Văn Thành, Thầy Nguyễn Trung Dũng đã tạo điều
kiện cho em tiến hành thực nghiệm nội dung của đồ án này. Cám ơn các bạn khoá
08 và 09DSH đã luôn động viên, ủng hộ và nhiệt tình giúp đỡ em từ trước tới nay.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2012
Nguyễn thị Ngọc Thu