Tailieu.vncty.com lai phan-tu_2413

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
“Chuyên đề: Kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc và ứng dụng
trong kiểm tra động vật chuyển gen
Thái Nguyên, 2014
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH

• Đặt vấn đề
• Nội dung
• Kết luận
43CNSH

Đặt vấn đề
• Động vật chuyển gen: là những động vật có hệ gen bị biến đổi
bằng cách đưa thêm DNA ngoại lai gắn vào hệ gen của nó.
Đoạn DNA ngoại lai dùng để đưa vào cơ thế khác gọi là gen
chuyển.
• Để khẳng định ĐV có được chuyển gen lạ vào hay không
người ta phải kiểm tra xem có gen lạ xâm nhập được vào bộ
máy di truyền của động vật hay không. Phương pháp thường
hay sử dụng đó là các kỹ thuật lai phân tử trên pha rắn
(Southern blot, Nouthern blot….)
43CNSH

Hình ảnh một số động vật chuyển gene
Mèo phát sáng Cá gấu trúc phát sáng
43CNSH

Hình ảnh một số động vật chuyển gene
Dê tạo tơ nhện Lợn thân thiện với môi trường
43CNSH

Nội dung
1. Khái niệm về lai phân tử
2. Các phương pháp lai phân tử
3. Các phương pháp khác
4. Kết luận
43CNSH

1.Khái niệm về lai phân tử
• Lịch sử:
- 1960 Julius Marmur và những đồng nghiệp của ông quản lý
ngành học tại Đại học Harvard đã khám phá ra quá trình ủ lại
(reannealing).Quá trình này bao gồm sự kết hợp của những
mạch đơn thành các phân tử 2 mạch đôi bền vững. Từ sự khám
phá ra quá trình reannealing phương pháp lai các nucleic được
phát triển.
- Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các nguồn khác nhau
của acid nucleic có thể trọn lẫn thành dạng phân tử 2 mạch đôi
được đặt tên là thể lai (hybrid).
43CNSH

=> Việc lai phân tử mở rộng ra nhiều kỹ thuật khác nhau và được
dùng vào những mục đích đa dạng với mục đích sử dụng lai
DNA như 1 kỹ thuật so sánh dùng cặp base bổ sung để đối
chiếu bộ gene chứa toàn bộ nội dung di truyền của 2 loài khác
nhau và đánh giá những điểm tương đồng giữa chúng
43CNSH

*Cơ sở của lai phân tử : là sự biến tính và hồi tính của DNA.
Khi 1 phân tử DNA mạch đôi được đun lên 1 nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ
nóng chảy Tm thì 2 mạch đơn sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết
Hydro nối liền mạch. Sau khi 2 mạch tách rời, nếu nhiệt độ phản ứng
được làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng sẽ
bắt cặp trở lại. Hiện tượng này gọi là lai phân tử.
* Đặc điểm của lai phân tử:
-Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa 2 trình tự có trình tự
hoàn toàn bổ sung.
-Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA dẫn đến sự hình thành
các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lại DNA-RNA.
43CNSH

1.1 Các nhân tố ảnh hưởng đến lai phân tử
- Ảnh hưởng của thành phần các base trong phân tử DNA.
- Ảnh hưởng của độ dài DNA
- Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch).
- Ảnh hưởng của môi trường phản ứng.
43CNSH

1.1.1 Ảnh hưởng của thành phần base
Do số lượng các liên kết hidro giữa A và T, G và C không bằng nhau
(A=T; G =C) nên thành phần các base cấu tạo một DNA mạch đôi có
ảnh hưởng rất quan trọng cho sự bền vững của phân tử này, đặc biệt là
tỷ lệ các base G,C. Trong điều kiện chuẩn , Tm được đánh giá bằng
công thức sau: Tm = 69,3 + 0,41 (% G+C).
43CNSH

1.1.2 Ảnh hưởng của độ dài DNA
Đọan DNA càng dài bao nhiêu thì số lượng liên kết hidro nối 2
mạch càng lớn bấy nhiêu và do đó “nhiệt độ nóng chảy” cũng
càng cao. Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tử DNA được tính
theo công thức sau: ∆Tm = -500/số lượng cặp base
Công thức trên cho thấy ảnh hưởng của độ dài chỉ quan trọng đối
với những đoạn DNA ngắn.
43CNSH

1.1.3Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch
)
+ Bắt cặp sai lệch ngoài quy tắc ( A=T, G=C) => Giảm tính ổn
định của phân tử lai.
+ Tm giảm 10ºC => 1% bắt cặp sai lệch.
43CNSH

1.1.4 Ảnh hưởng của môi trường phản ứng
* Ảnh hưởng của nồng độ muối:
+ Sự giảm lực ion sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy.
+ Dung dịch càng loãng càng làm mất tính ổn định của chuỗi
xoắn kép DNA.
* Ngoài ra còn các yếu tố như : nhiệt độ tốc độ phản ứng lai phụ
thuộc vào nhiệt độ. Thông thường phản ứng lai đạt cực đại ở
nhiệt độ thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó 25%.
43CNSH

2. Phân loại
- Lai trong pha lỏng ( dùng quang phổ kế, nuclease S1 , sắc kí
trên hydroxylapatite).
- Lai trên pha rắn ( thường sử dụng hơn) :
+ Southern blot
+Nouthern blot
+Western blot
+Dot ( slot ) blot.
43CNSH

2.1 Lai trong pha lỏng
Nguyên tắc:
+Các mạch đơn nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch
đệm.
+Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển
động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài
độ.
43CNSH

2.1.1 Phương pháp dùng quang phổ kế
- DNA hấp thụ ánh sáng yếu hơn DNA mạch đôi.
- Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác
định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị mật độ
quang (OD) ở bước sóng 260 nm.
- Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển
thành mạch đơn, hiện tượng này có tên gọi là phản ứng siêu
sắc (hyperchromic effect).
43CNSH

2.1.1 Phương pháp dùng quang phổ kế
Nhuộm tím phân tử DNA, nếu đem chúng đun nóng và làm
lạnh từ từ thì kết quả là các phân tử DNA sẽ trở nên tím đậm.
Nếu hạ nhiệt độ một cách đột ngột thì chúng sẽ trở nên rất
đậm. Đó là hiện tượng các mạch đơn DNA hấp thụ tia UV
mạnh hơn DNA mạch đôi.
43CNSH

2.1.2 Phương pháp sử dụng nuclease S1
- Nuclease S1 là enzyme thủy giải các nucleic acid mạch đơn
bất kể là DNA hy RNA trong một số điều kiện thực nghiệm.
- Dung dịch phản ứng lai được trích ra một phần đem xử lý với
nuclease S1.
- Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các NA còn lại tương ứng với
các phân tử lai được thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem
định lượng.
43CNSH

2.1.3 Phương pháp sắc ký trên hydroxylapatite
• Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat calci.
• Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc
kháng thể ) để lai với DNA, RNA hoặc với các protein ở trong
các tế bào mà không cần tách chiết.
• Sau khi bị đốt nóng chúng được làm lạnh để những mạch đơn
va chạm ngẫu nhiên. Các hỗn hợp được ủ khoảng 120h ở 600
trong một dung dịch đệm Natri phosphat.
• Ở nồng độ muối cao chỉ những nucleic mạch đôi mới gắn
được vào giá thể này, phần nucleic không gắn sẽ được thu
nhận.
43CNSH

2.2 Lai trên pha rắn
* Nguyên tắc:
- Giống với nguyên tắc lai trên pha lỏng.
- Khác ở chỗ một trong 2 trình tự bổ sung được cố định trên một
giá thể rắn.
*Ưu điểm:
-Dễ dàng trong thao tác tách các trình tự không lai ra khỏi các
phân tử.
-ngăn sự tái bắt cặp giữa hai mạch của cùng 1 phân tử.
*Nhược điểm:
-Phân tích và định lượng các phân tử lai kém chính xác và hiệu
quả lai thấp.
-Vận tốc lai kém so với lai trên pha lỏng.
43CNSH

2.2.1 Phương pháp Southern blot
Nguyên tắc:
Màng lai nitrocelluse có khả nagw tiếp nhậ DNA đã được biết
từ lâu và đã được sử dụng trong các nghiên cứ lai nucleic acid
khác nhau vào những thập niên 1950 và 1960.
Các bước tiến hành:
• Cắt DNA bằng enzyme giới hạn
• Điện di sản phẩm cắt trên gel
• Làm biến tính DNA
• Chuyển DNA lên màng lai
• Lai DNA đã được cố định với mẫu dò DNA có đánh dấu
• Định vị các phân tử lai DNA-mẫu dò.
43CNSH

2.2.1 Phương pháp Southern blot
43CNSH

2.2.2 Phương pháp Nouthern blot
Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi
nếu nó được đánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫu dò
được gắn với enzyme thì đem ủ với cơ chất không màu.
Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản phẩm không
màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ được phát
hiện bằng phim X quang một cách trực tiếp.
43CNSH

2.2.2 Phương pháp Nouthern blot
43CNSH

2.2.3 Phương pháp Western blot
• Là phương pháp có độ nhạy cao dựa trên tính đặc hiệu của kháng
nguyên-kháng thể để phát hiện protein điện di trên gel SDS-PAGE
và chuyển lên màng lai.
• Phương pháp này cho phép xác định sự có mặt, trọng lượng phân
tử, định lượng protein có mặt trong các mẫu khác nhau.
* Các bước thực hiện:
• Protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE
• Các pr được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí
như đã phân tách trên gel.
• Ủ màng lai với một kháng thể sơ cấp.
• Tiếp tục ủ màng lai trong hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme.
• Đặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các
điểm sáng phát ra do enzyme.Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH

2.2.3 Phương pháp Western blot
43CNSH

2.2.4. Dot và slot blot
Mục đích:
Định lượng tương đối cho 1 RNA đặc trưng trong 1 hỗn
hợp RNA mà không cần phải phân tách chúng ra. Phương pháp này
có thể sử dụng cho RNA.
Đặc điểm:
Trong phương pháp này người ta không chuyển acid nulceic từ gel lên
mà mà đặt trực tiếp 1 lượng mẫu nhỏ lên màng lai ( thành 1 điểm_Dot
hay 1 khe_Slot). Bản phóng xạ tự ghi sau đó đươc phân tích bằng kỹ
thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng các phân tử lai có trong
mẫu. Trong thực nghiệm, người ta sử dụng một dụng cụ ( tên là manif
old) cho phép đặt một lúc nhiều mẫu DNA hay RNA lên màng lai.
43CNSH

3.Các phương pháp khác
• Lai tại chỗ
• Lai khuẩn lạc
• Lai trên NST
• Lai trên tế bào và mô.
43CNSH

3.1 Lai tại chỗ
*Định nghĩa:
+ Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử trong đó trình tự cần tìm nằm
ngay trong tế bào hay trong mô
+ Lai tại chỗ được sử dụng để định vị những đoạn acid nucleic bổ
sung với mẫu dò được đánh dấu đặc thù trên NST trong tế bào
sinh vật nhận thật hoặc tế bào vi khuẩn.
*Nguyên tắc:
Nghiên cứu acid nucleic mà không cần giai đoạn tách chiết chúng
ra khỏi mô hay tế bào.
43CNSH

3.2. Lai khuẩn lạc
*Mục đích:
Dùng để phát hiện dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp
cần tìm trong một ngân hàng gen.
*Các bước tiến hành:
- Mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai.
- Màng lai sau đó sẽ được xử lý bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi
khuẩn và làm biến tính DNA.
- Việc cố định trên màng lai và thao tác lai diễn biến theo các
bước tương tự như ở các phương pháp lai trên pha rắn.
- Kết quả phóng xạ tự ghi của dấu ấn cho phép các định dòng vi
khuẩn cần tìm trên hộp petri ban đầu.
43CNSH

3.2. Lai khuẩn lạc
43CNSH

3.3. Lai trên NTS
*Mục đích:
Cung cấp thông tin chính xác về vị trí và sự phân bố của 1 trình tự
DNA cần tìm trên NST nhờ một mẫu dò chuyên biêt.
*Các bước thực hiện:
• Các NST ở giai đoạn trung kỳ (các NST này thường có nguồn gốc
từ bạch cầu) được xử lý bằng các kỹ thuật tế bào học trên lame.
• NTS cố định trên lame được đem lai với mẫu dò có đánh dấu
phóng xạ.
• Để phát hiện phân tử lai, người ta sẽ phủ lên lame 1 dịch huyền
nhạy cảm với tia xạ. Sau một thời gian cho tia xạ tác động lên
huyền dịch. Lame được quan sát dưới kính hiển vi, kết quả thể
hiện thành những hạt nằm trong lớp huyền dịch ngay trên vị trí có
phân tử lai.
43CNSH

3.3. Lai trên NTS
43CNSH

3.4. Lai trên tế bào và mô
*Mục đích:
Nghiên cứu chức năng và sự điều hòa biểu hiện của gen cũng
như sự tương tác giữa mRNA với các thành phần khác nhau
của tế bào và mô.
*Ứng dụng:
- Trong đối tượng nghiên cứu phức tạp bao gồm nhiều tập hợp tế
bào khác nhau như não bộ.
- Xác định mối tương quan giữa các hoạt động phiên mã và dịch
mã của cùng một gen.
43CNSH

4.Kết luận
• Những phần trên đã trình bày về kỹ thuật lai phân tử, nguyên
tắc và ứng dụng trong kiểm tra động vật chuyển gen.
• Các phương pháp lai phân tử rất có ý nghĩa trong việc kiểm tra
động vật chuyển gen nên việc ứng dụng của các phương pháp
này đang được sử dụng phổ biến.
43CNSH

Tài liệu tham khảo
1. Bài giảng CNSHĐV, TS. Nguyễn Văn Duy, khoa CNSH &
CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
2. “Công nghệ sinh học trên người và động vật”, (2007), Phan
Kim Ngọc, NXB Giáo dục.
3. Bài giảng “ Công nghệ sinh học thú y”,GS.TS Nguyễn Quang
Tuyên, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên.
4. http://tailieu.vn
5. http://vcn.v.nn.vn/
6. http://violet.vn/main/
43CNSH

Cảm ơn thầy giáo và các bạn đã
chú ý lắng nghe
43CNSH

Thành viên nhóm
1. Mạc Văn Dương
2. Nguyễn Thị Thanh Dung
3.Đỗ Thị Hào
4.Nguyễn Thị Hằng
5.Mông Thị Hương
6. Lý Thị Liễu
43CNSH

Tailieu.vncty.com lai phan-tu_2413

More Related Content

What's hot

Viewers also liked

Similar to Tailieu.vncty.com lai phan-tu_2413

More from Trần Đức Anh

Tailieu.vncty.com lai phan-tu_2413

Editor's Notes