Chuẩn đoán ung thư sớm

1. Ly trích Biomarker trong nước bọt
liên quan đến ung thư
1
Nhóm 3:
Đặng Trần Hoài Phương
Trần Mạnh Hùng
Lê Thanh Thịnh
Nguyễn Hữu Trường
Nguyễn Thị Trúc Giang
Đặng Quốc Hội
Giảng viên: ThS.Bs Cao Hữu Tiến

2. I. Tổng quan
2

3. II. Giới thiệu
 Giới thiệu về Biomarker
• Là các thành phần có trong
nước bọt có thể là protein,
hormon hay kháng thể, thậm chí
là các phức hợp phân tử khác.
• Cho biết tình trạng sức khỏe,
bệnh lý của cơ thể.
 Ứng dụng trong chẩn đoán y học.
 Bản chất Biomarker
• DNA
• RNA
• Protein
• Các thành phần khác
3

4.  Phân loại theo chức năng
• Giám kiểm hormon: testosterone ( chức năng tinh hoàn), estradiol (
cho biết tình trạng nhẹ cân, sinh non) hay progesterone ( tiên đoán
sự rụng trứng), ….
• Các bệnh toàn thân: bệnh di truyền ( khiếm khuyết 21 hydroxylate,
Alzheimer,…), bệnh chuyển hóa ( tiểu đường), ung thư ( u vú, u
biểu mô buồng trứng,…),…
• Các bệnh lý nhiễm trùng: nhiễm khuẫn ( helicobacter pylari), nhiễm
virut ( HBV, HCV, sởi, quai bị, HIV,…)
• Giám kiểm thuốc: caffein, antipyrine, cacbamazepine, giám kiểm tình
trạng hút thuốc lá, đánh giá sử dụng thuốc trái phép,…
4

5. III. Ly trích DNA trong nước bọt
1. Tính chất DNA
2. Quy trình ly trích cổ điển
3. Quy trình ly trích hiện nay
5

6. III.1. Tính chất DNA
• Tan vô hạn trong nước.
• Thiếu nước DNA bị biến dạng.
• Tăng nhiệt độ tới ngưỡng Tg, liên kết Hydro bị đứt tạo thành 2
mạch.
• Khối lượng phân tử lớn: DNA >> RNA
6

7. III.2. Quy trình ly trích cổ điển
Dụng cụ:
• Ống nghiệm (Eppendoff)
• Nước bọt
• Muối ăn
• Nước ép dứa (thơm)
• Vài giọt xà phòng
• Isopropyl alcohol
• Que gỗ
7

8. Chuẩn bị thu nước bọt
1. Làm sạch mảng bám thức ăn trên răng ngay trước khi thu mẫu do
chúng làm ảnh hưởng đến độ pH và sự gia tăng vi khuẩn trong khoang
miệng;
2. Không sử dụng chất kích thích như rượu , caffee, thuốc lá trước 12h;
3. Không có bệnh tật hay tổn thương ở miệng;
4. Không ăn thịt 1h trước khi thu mẫu;
5. Súc miệng và đợi ít nhất 10 phút để dung dịch súc miệng loãng ra rồi
mới thu mẫu nước bọt;
 Để có được mẫu ly trích tốt nhất.
8

9. Quy trình
Thu
nước bọt
Phân
giải tế
bào
Protease
Thêm
muối
Isopropyl
ancohol
Thu DNA
9

10. Quy trình
1. Thêm 1mL nước bọt vào ống nghiệm
 Cần chú ý vài điều để có mẫu nước bọt tốt nhất.
2. Thêm 1-2 giọt xà phòng vào ống nghiệm
 Bước đầu ta cần phá vỡ tế bào. Để làm điều này ta trộn với 2 giọt xà phòng.
Tính tẩy của xà phòng sẽ làm mất ổn định màng tế bào, làm hở cấu trúc bên
trong. Gồm tất cả: cytoplasmic và protein hạt nhân, đường, DNA và RNA. Tuy
nhiên tất cả còn hoà tan trong nước bọt. Phần chính là chúng ta cần làm DNA
tụ và lắng tách khỏi hỗn hợp.
10

11. 3. Protease
 Thêm vài giọt nước ép thơm vào hỗn hợp.
 Phá vỡ màng tế bào, phá huỷ phần lớn protein và các enzyme khác. Chúng sẽ lắng cùng DNA sau.
4. Muối
 Thêm một mẫu nhỏ muối vào dung dịch nước bọt. Trộn đều nhẹ tay hoặc đảo ngược
ống nghiệm nhẹ nhàng.
 Vì DNA tự do chứa gốc photphas mang điện âm nên khi hoà tan muối chứa ion Natri
mang điện dương dẫn đến các ion Na tương tác giúp liên kết các phân tử DNA gần
nhau khỏi lực đẩy của chúng  giúp DNA tụ trong bước tiếp theo.
11
Quy trình

12. 5. Thêm isopropyl ancohol
 Thêm 5-6 mL isopropyl ancohol và đảo ngược ống để trộn.
 DNA ưa nước và không hoà tan trong cồn. Làm điều này để DNA
lắng. Khi trộn thấy vờn trắng trong dung dịch .. đó là DNA.
6. Thu DNA
 Dùng que gỗ thu DNA bằng cách đưa que gỗ nhẹ nhàng vào ống
nghiệm xoáy và quay nhẹ que cùng lúc. Ta sẽ được sợi DNA quấn
quanh thanh gỗ. Mọi thao tác phải nhẹ nhàng.
7. Hoà tan lại DNA trong eppendoff nước khác.
12
Quy trình

13. III.3. Quy trình ly trích hiện nay
13
Thu nước
bọt
Phân giải tế
bào
Loại RNA
Loại Lipid &
Protein
Tách và làm
sạch DNA
Bảo quản
DNA

14. Hóa chất cần pha
DNA Stabilization Buffer 250 mL
1M NaCl 1.461g 0.1M
Tris HCL 2.5 0.01M
0.5M EDTA 5 0.01M
10% SDS 12.5 0.014M
Proteinase K Solution
(20mg/mL)
2.5 6.92x10-6M
ddH2O 227.5
14

15. 1. Thu nước bọt
 Thu hơn 2,5mL nước bọt vào eppendoff rồi thêm lượng thể tích DNA stabilization
buffer tương tự. Đóng nắp eppendoff rồi lắc đảo đều hỗn hợp thành thể đồng nhất.
Lưu giữ ở 4oC.
2. Chuẩn bị ban đầu và phân giải tế bào
 Trước khi ly trích , cần ủ trong bể nước 37oC và chuẩn bị một bể nước đá. Chuẩn bị
3 eppendoff 15mL, giữ tế bào , protein ; DNA ; isopropanol và ethanol.
 Đảo ngược vài lần và votex tốc độ trung bình trong 15s.
 Lấy 2,5mL nước bọt cho vào mỗi ống và thêm 5mL dung dịch Cell Lysis. Đảo ngược
50 lần và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
15
Quy trình

16. 3. Loại RNA
 Thêm 40 µL dung dịch RNase A nồng độ 100mg/mL, ủ ở 37oC trong 15
phút. Sau đó gia tăng nhiệt lên 65oC để cho bước DNA rehydrat.
 Lấy ra khỏi bể ủ và đưa vào làm lạnh bằng nước đá trong 3 phút.
4. Loại Lipid và Protein
 Thêm 50µL Proteinase K (20mg/mL) đảo ngược để trộn vài lần rồi ủ 30 phút
ở nhiệt độ phòng. ở bước này chúng ta có thể giữ ở 4oC trong hơn 24h mà
không gây hư hại đáng kể đến kết quả ly trích và chất lượng DNA.
 Thêm 1.7 mL dung dịch kết tủa Protein và votex tốc độ nhanh trong 20s , đặt
trong nước đá 10 phút.
 Sau đó đem ly tâm 3000 vòng ở 4oC trong 10 phút. Nếu protein chưa tủa có
thể ủ thêm 5 phút ở nước đá và làm lại quá trình ly tâm.
16
Quy trình

17. 5. Tách và làm sạch DNA
• Thêm vào eppendof mới 5mL isopropanol và 8µL dung dịch Glycogen
thuần 20mg/mL.
• Đổ phần dịch lỏng ở eppendof trước vào eppendof mới. Trộn đảo
ngược 50 lần và ly tâm 3000 vòng ở 4oC trong 30 phút.
• Từ từ loại bỏ dịch bên trên và thêm 1mL ethanol 70% để rửa sạch
ống từ từ. Sau khi rửa ly tâm 2000 vòng ở 20oC hay 4oC trong 1 phút.
• Từ từ cẩn thận loại ethanol nổi. Để khô eppendof trong 15 phút.
6. Hoà tan lại DNA trong nước
• Thêm 300µL Tris-EDTA hoà tan DNA.
• Votex 5s ở tốc độ trung bình và đặt trong bể ủ 65oC trong 1 giờ. Lấy
mẫu ra và ủ nhiệt độ phòng.
17
Quy trình ly trích hiện nay

18. Kết quả
18
Ly trích DNA từ nước bọt. Điện di
trong 0.8% agarose gel (250ng
DNA). Tất cả DNA ly trích đều có
trọng lượng phân tử cao >20kb
và không biến chất rõ. ‘’Từ trái
sang phải’’
Lane 1 là DNA thang chuẩn, 2&3
là dùng Ogagene Kit, 4&5 dùng
Puregene Kit, 6&7 dùng phương
pháp ly trích không loại RNA,
8&9 là phương pháp ly trích có
bước loại RNA.
A: 0.8% aragose gel
B: 2% aragose gel
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7 8 9

19. Giải trình tự DNA
19

20. Giải trình tự DNA
20
Sử dụng gel poly acrylamide
Nguyên tắc hoạt động:
o Trong quá trình điện di các
vạch điện di đi qua chùm tia
laser sẽ phát sáng lên và
được sensor quang ghi nhận
lại thành một đỉnh cường độ
sáng.
 Phân tích trình tự DNA

21. IV. Chẩn đoán sớm Ung thư Vú
21
Bệnh nhân 38 tuổi, trong gia đình có hai người bị ung thư vú

22. Tài liệu tham khảo
1. PCR_sequencing;
2. Saliva_Collection_Handbook;
3. Molecular_Oncology_Presentation_Oct2013;
4. Next generation sequence (2014);
5. Role of Pancreatic Cancer-derived Exosomes in Salivary;
Biomarker Development;
6. THE USE OF SALIVARY BIOMARKERS IN OCCUPATIONAL AND
ENVIRONMENTAL MEDICINE.
Và một số trang web khác....
22

23. Cảm ơn Thầy và các bạn đã lắng nghe
23