Vi sinh

1. Các thử nghiệm sinh hóa

2. — Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết
cho định danh VSV
— Việc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm
kiểu hình đặc biệt là các phản ứng sinh hóa.
— Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa
để định danh VSV:
◦ Cách truyền thống
◦ Sử dụng các bộ KIT
◦ Sử dụng các thiết bị tự động

4. Thử nghiệm khả năng lên men
— Mục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các
nguồn CH của các VSV
— Nguyên tắc: VSV sử dụng CH à tạo acid à
giảm pH môi trường
— Các loại carbonhydrate
◦ Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose …
◦ Dicarbonhydrate: sucrose, lactose …
◦ Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose
◦ Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO
◦ Các loại đường rượu: chứa chức -OH

5. Phenol Red Carbohydrate Broth có pH 7.4
Trypticase 10g
NaCl 5g
Cao thịt 1g
Phenol red
(7,2ml của dung dịch phenol red
0,25%)
0,018g
Carbohydrate* 1 g
Hấp ở 115oC trong 15 phút

6. Thử nghiệm khả năng lên men
— Môi trường: Phenolred broth
base bổ sung 0,5-1% đường
cần thử nghiệm
— VSV sử dụng được nguồn
đường trong môi trường sẽ
làm giảm pH à thay đổi
màu chất chỉ thị phenolred
— Phản ứng (+): môi trường
chuyển vàng
— Phản ứng (-): môi trường có
màu đỏ

7. TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
— Mục đích: thử nghiệm khả năng chuyển hoá
glucose theo các con đường khác nhau
— Cơ sở sinh hóa:
◦ Lên men: là quá trình kỵ khí, tạo môi trường
acid cao
◦ Ôxi hóa: là quá trình hiếu khí

8. TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
— Môi trường sử dụng: Oxidation/
Fermentation media (Hugh & Leifson
media)
— Chỉ thị pH: bromothymol blue

9. TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
— Đọc kết quả:
A: đối chứng
B: phản ứng Ôxi hóa
C: phản ứng lên men

10. Thử nghiệm Citrate
— Mục đích: Xác định khả năng VSV sử dụng
nguồn citrate như là nguồn cacbon duy nhất.
— Cở sở sinh hóa:
◦ VSV sử dụng citrate, sinh ra CO2 làm kiềm
hóa MT
◦ VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm
duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa MT

11. Thử nghiệm Citrate
Môi trường Simmon citrate agar
Ammonium dihydrogen phosphate 1.0g
Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g
NaCl 5g
Sodium citrate 2g
MgSO4 0,2g
Bromothymol blue 0,08g
Agar 13g

12. Thử nghiệm Citrate
— Chú ý
- Cấy lượng sinh khối vừa đủ
- Có đối chứng trắng đi kèm
Đối chứng trắng Pứ âm tính Pứ dương tính

13. Thử nghiệm Malonate
— Mục đích
Phát hiện các VSV có khả năng sử dụng
malonate như nguồn carbon duy nhất
— Cơ sở sinh hoá
Malonate là chất cạnh tranh với succinate
Khi VSV phân hủy được malonate thì cũng
phân huỷ được các nguồn đạm vô cơ khác ð
tạo thành sp kiềm ð làm tăng pH môi trường

14. Thử nghiệm Malonate
— Môi trường sử dụng:
Malonate broth
(bromothymol blue)
— Dương tính: MT chuyển
màu xanh da trời
— Âm tính: MT không đổi
màu và không sinh khối
(+) (-)
Đ
C
pH <6,0 6,0 – 7,6 pH >7,6

15. Thử nghiệm catalase
— Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ
enzym catalase.
— Cơ sở sinh hoá:
◦ Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ
khí tùy ý
◦ H2O2 H2O + O2 (bọt khí)
(hydrogen peroxide)
catalase

16. Thử nghiệm catalase
— Thực hiện
◦ VSV lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn)
◦ Đặt VSV lên lam kính sạch
◦ Nhỏ H2O2 30%
◦ Quan sát sau 1-2 giây
– Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện
– Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện

17. Thử nghiệm catalase

18. Thử nghiệm catalase
Thử nghiệm catalase trên đĩa petri: sử dụng H2O2 30%

19. Thử nghiệm Urease
— Mục đích: phát hiện VSV có mang enzym urease
— Cơ sở sinh hoá:
(NH2)2CO + H2O à 2 NH3 + CO2
à tăng pH môi trường à đỏ phenol (vàng – đỏ)
— Môi trường sử dụng:
◦ Urea Broth (Rustigian – Stuart)
◦ Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng)

20. Môi trường Urea Broth
Urea 20g
Cao nấm mem 0,1g
Na2HPO4 9,5g
K2HPO4 9,1g
Phenol red 0,01g
Nước cất 1 lít

21. — Thực hiện
◦ Chuẩn bị môi trường
◦ Cấy VSV vào 5ml môi
trường
◦ ủ 37oC/24 giờ
◦ Quan sát
Thử nghiệm Urease

22. Thử nghiệm khả năng sinh H2S
— Mục đích: phát hiện khả năng sinh H2S
— Cơ sở sinh hóa:
Acid amin chứa S H2S
Thiosulfate H2S
Ø H2S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì tạo
kết tủa màu đen (FeS, PbS)
desulfohydrase
thiosulfate reductase

23. Thử nghiệm khả năng sinh H2S
— Để phân biệt các loài thuộc họ Enterobacteriaceae
và giống Proteus
— Môi trường sử dụng:
◦ KIA, TSI (thạch nghiêng)
◦ SIM, PIA (thạch sâu)
◦ BSA (thạch đĩa)
Cấy vsv lên môi trường Ủ (37oC, 24 – 48h)

24. — Đọc kết quả:
Xuất hiện màu đen
trong môi trường
Không xuất hiện màu
đen trong môi trường
(+)
(-)
(+)
ĐC
Thử nghiệm khả năng sinh H2S

25. Thử nghiệm khả năng sinh H2S
(+) (+)
(-)
Pancreatic digest of casein
(casitone)
20.0 g
Peptic digest of animal
tissue (beef extract)
6.1 g
Ferrous ammonium
sulfate
0.2 g
Sodium thiosulfate 0.2 g
Agar 3.5 g

26. Thử nghiệm KIA/TSI
— KIA: Kligler iron agar
Pepton 20g
Lactose 20g
Glucose 1g
NaCl 5g
Feric ammonium citrate 0,5g
Sodium thiosulphate 0,5g
Agar 15g
Phenol red 0,025g
Nước cất 1 lít
pH 7,4±0,2

27. Thử nghiệm KIA/TSI
— TSI: Triple sugar iron agar (trang 106)
Pepton 20g
Lactose 10g
Sucrose 10g
Glucose 1g
NaCl 5g
Feric ammonium sulphate o,2g
Sodium thiosulphate 0,2g
Agar 13g
Phenol red 0,025g
Nước cất 1 lít
pH 7,4±0,2

28. Thử nghiệm KIA/TSI
— Mục đích: phát hiện khả năng
◦ sử dụng các nguồn cacbonhydrate (glucose,
lactose, sucrose)
◦ sinh H2S
◦ tạo hơi (gas)
Ủ 37oC/24 giờ
Quan sát:
Phần nghiêng / phần sâu / hơi /
H2S

29. Thử nghiệm KIA/TSI
1 2 3 4 5 6 7 8 10
9 11
ĐC

30. Thử nghiệm khả năng sinh Indol
— Mục đích
Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol ð các
VSV có hệ emzym tryptophanase
Chủng VSV MT canh trypton
Thuốc thử
Kovac’s
Pứ dương tính Pứ âm tính
37oC / 24h

31. Thử nghiệm khả năng sinh Indol
— Là phản ứng giúp phân biệt
◦ E. coli (+) với Klebsiella (-)
◦ Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+)
◦ Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-)
…
— Đối chứng (+) Proteus rettgeri
(-) Serratia marcescens

32. Thử nghiệm MR (Methyl red)
— Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì
các acid bền trong quá trình lên men glucose.
— Cơ sở sinh hóa:
◦ Chất chỉ thị pH: methyl red
◦ MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường
càng acid
◦ MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có
tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính
ð Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oC
dưới 4,4 5,0 – 5,8 trên 6,0

33. Thử nghiệm MR (Methyl red)
— Môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth)
ChủngVSV
ủ 2 – 5 ngày
37oC
Pứ âm tính
Pứ dương tính ĐC
MR-VP broth

34. Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
— Mục đích: Phát hiện vsv tạo sản phẩm
trung tính (acetoin) trong quá trình lên men
glucose
— Cở sở sinh hóa: Acetoin được tạo ra trong
điều kiện yếm khí hoàn toàn.
2 pyruvate acetoin + 2 CO2

35. Phức màu đỏ

36. Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
— Môi trường sử dụng: MR-VP
— Phương pháp tiến hành:
◦ Cấy vi sinh vật trong môi trường MR-VP
◦ Ủ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37oC
◦ Bổ sung thuốc thử vào môi trường, lắc nhẹ
◦ Đọc kết quả sau 20 phút và chậm nhất là 4 giờ.

37. Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
— Kiểm tra thuốc thử
bằng đối chứng
(+) : Enterobacter
cloacea
(-) : E. coli
— Đọc kết quả:
(+): màu đỏ trên môi
trường
(-): mặt môi trường không
đổi màu
(+)
(-)

38. Thử nghiệm tính di động
— Mục đích: Xác định khả năng di động của vi
sinh vật.
— Cở sở: Vi sinh vật di động nhờ tiêm mao
— Các tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật vào môi
trường thạch mềm (0,5% agar).
◦ Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục,
phát triển lan ra khỏi vết cấy.
◦ Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh
đường cấy, môi trường không bị đục.

39. (+) (+)
(-)
Thử nghiệm tính di động

40. THỬ NGHIỆM COAGULASE
— Mục đích: Thử nghiệm khả năng làm đông tụ
huyết tương bởi enzyme coagulase
— Là bước cuối trong định danh các giống
Staphylococcus
— Chủng đối chứng (+): S. aureus
(-): S. epidermidis
— Thử nghiệm tiến hành với huyết tương hoặc
fibrinogen.

41. THỬ NGHIỆM COAGULASE
Thử nghiệm bằng 2 cách
Thử trên phiến kính
Đọc kết
quả
Giọt nước Sinh khối vsv Huyết tương người
+ +
Thử nghiệm trong ống nghiệm:
0,5ml huyết tương
0,5ml huyết dịch sinh khối
Ủ và đọc kết quả mỗi
30 phút

42. THỬ NGHIỆM COAGULASE
Kết quả thử nghiệm Coagulase
(+) khi xuất hiện khối đông tụ huyết tương
(-) không xuất hiện khối đông tụ, dung dịch đồng nhất

43. Thử nghiệm decarboxylase
— Mục đích: xác định khả năng tạo enzyme
decarboxylase xúc tác phân cắt nhóm carboxyl
ở một số acid amin
Cấu trúc của phân tử
Amino acid

44. — 3 thử nghiệm quan trọng
◦ Lysine decarboxylase (LDC)
◦ Ornithine decarboxylase (ODC)
◦ Arginine decarboxylase (ADC) /
Arginine dehydrolase (ADH)
Các enzyme trên là các enzyme cảm ứng,
chỉ được tạo ra khi trong môi trường
nuôi cấy có cơ chất tương ứng

45. — Cơ sở sinh hoá
◦ Các sp tạo ra làm tăng pH môi trường à
đổi màu chất chỉ thị
— Môi trường sử dụng:
Decacboxylase Basal Medium
chỉ thị bromocresol purple (5,2 – 6,8)
Thử nghiệm decarboxylase
pH <5,2 5,2 – 6,8 pH >6,8

46. — Biểu hiện sinh hoá
Dương tính: pH môi trường tăng
Âm tính: pH giảm
MT trước khi cấy Pứ dương tính Pứ âm tính
Thử nghiệm decarboxylase

47. Thử nghiệm gelatinase
— Mục đích: thử nghiệm khả năng phân giải
gelatine bởi gelatinase.
— Cơ sở sinh hóa:
Gelatine polypeptide + acid amin
Gelatine trong môi trường dinh dưỡng môi
trường đông đặc
VSV phân hủy gelatine môi trường lỏng
gelatinase

48. Thử nghiệm gelatinase
— Đối chứng dương: Aeromonas hydrophila
âm: E. coli
— Môi trường sử dụng Nutrient Gelatine
— Dạng ống nghiệm thạch sâu
— Cấy vi sinh vật và ủ (14 ngày) ở nhiệt độ
phòng.

49. Thử nghiệm gelatinase
— Đọc kết quả
(+) môi trường tan chảy
(-) môi trường không tan chảy

50. Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
— Mục đích: Thử nghiệm khả năng khử nitrate
— Cở sở sinh hóa:
3 2 3 2 2
, , , ,
− −
⎯⎯⎯
⎯
→
nitratase
NO NO NH N NH OH NO
NO2 + sulphanilamine/N-napthylethylenediamine
hydrochloride ð chất màu hồng
NO3 + bụi kẽm ð màu hồng

51. Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
— Phương pháp tiến hành:
◦ Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường
chứa nitrate
◦ Bổ sung chất thử để kiểm tra sự hiện diện của
nitrite
◦ Phản ứng định tính nitrite (-) ðbổ sung lượng
kẽm nhỏ để định tính nitrate

52. Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)

53. Thử nghiệm oxydase
— Mục tiêu: phát hiện VSV có hệ enzym oxydase (hệ
cytochrom C)
— Cơ sở sinh hoá
Cytochrom C khử + H+ + O2à Cytochrom C ôxi
hoá + H2O
Cytochrom C ôxi hoá + Tetramethyl-p-
phenylenediamine (TMPD) khử à TMPD ôxi hoá
(màu xanh)

54. Thử nghiệm oxydase
— Thuốc thử
◦ TMPD (0,1%): N,N,N’,N’-tetramethyl-p-
phenylenediamine
◦ Bảo quản lạnh trong tối
◦ Thời hạn bảo quản: 2 tuần
— Đối chứng (+): Serratia marcescens
(-) : Proteus rettgeri

55. Thử nghiệm oxydase
— Thực hiện:
◦ Lấy VSV từ Nutrient Agar đặt lên giấy thấm
◦ Nhỏ thuốc thử TMPD
◦ Quan sát sau 30 giây
Phản ứng (+): sinh khối chuyển màu xanh
Phản ứng (-): sinh khối vẫn màu trắng

56. Thử nghiệm oxydase

57. Thử nghiệm O-nitrophenyl-D-
galactopyranoside (ONPG)
— Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ
enzyme ß-galactosidase – enzyme cảm
ứng.
— Cơ sở sinh hóa:
ONPG o-nitrophenol
Màu vàng
Không màu

58. Thử nghiệm ONPG
Lactose agar
ChủngVSV 2ml ONPG broth Pứ (+) Pứ (-)
ủ qua đêm
37oC
Màu vàng

59. Thử nghiệm CAMP (Christie, Atkins,
Munch-Petersen)
— Mục tiêu: thử nghiệm khả năng cộng hưởng tan
huyết giữa các VSV
— Cơ sở sinh hóa:
◦ S. aureus tiết β-lysin gây tan hồng cầu
◦ VSV tiết CAMP gây tan huyết
◦ β-lysin + CAMP ð gây tan huyết mạnh, hoàn
toàn
— Ý nghĩa: dùng phân biệt Streptococcus nhóm B
(+) với Streptococcus nhóm khác (-)

60. Staphylococcus aureus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pyogenes
(+)
(-)

61. Thử nghiệm Bile Esculin
— Mục đích: xác định khả năng thủy giải
liên kết glucoside trong esculin thành
esculetin và glucose khi có sự hiện diện
của muối mật.
— Cơ sở sinh hoá:
◦ Esculin là hợp chất nhân tạo
◦ Esculetine được phóng thích phản ứng
với Fe2+ tạo thành phức hợp màu đen

62. Môi trường Bile Esculine Agar
Beef extract 3g
Pepton 5g
Esculin 1g
Mật bò (Oxgall) 40g
Ferric citrate 0,5g
Agar 15g
Nước cất 1 lít

63. Glucose
Esculetine
Phân tử Esculine

64. Sự phân giải Esculine thành Glucose và Esculetine
Thử nghiệm Bile Esculin

65. Khuẩn lạc Enterococcus faecalis cho kết quả BEA (+)

66. Ứng dụng thử nghiệm sinh hóa để định
danhVSV
— Mỗi loài vsv có những đặc tính sinh hóa
khác nhau
— Thực hiện kiểm tra các thử nghiệm sinh
hóa có thể giúp xác định tên loài (định
danh) vi sinh vật đó.

67. Hệ thống xác định vi sinh vật API-20E
(bioMerieux, Inc)