Bài phát biểu cảm tưởng khi được xét nhận học bổng.docx

1. Họ và tên: Hoàng Thị Ngọc Diệp
Lớp: K66 Quốc tế Sinh học
Nhóm: 4
Tên các bạn cùng nhóm: Trần Phạm Minh Châu, Nguyễn Trà My, Nguyễn Minh Hạnh
BÁO CÁO THỰC HÀNH
TÁCH CHIẾT DNA
I. Mục tiêu bài thực hành
- Nắm được làm thế nào để phá vỡ màng tế bào
- Nắm được làm thế nào để loại bỏ protein và carbohydrate
- Nắm được làm thế nào để tách DNA hòa tan ra khỏi các thành phần không
hòa tan của tế bào
- Sử dụng DNA sau khi tinh sạch để làm gì?
II. Kiến thức chung
Với việc khám phá ra cấu trúc xoắn kép của DNA, Watson và Crick cùng với
Maurice Wilkins đã được nhân giải Nobel Sinh lý học và Y học. Nghiên cứu
nguyên liệu di truyền như DNA là rất quan trọng để nghiên cứu chức năng của
gene. Rất nhiều kỹ thuật được sử dụng trong quá trình tách chiết DNA và chất
lượng DNA quyết định các nghiên cứu về sau. Cho đến nay hệ gen người đã được
giải trình tự, vì vậy chúng ta có thể nghiên cứu chức năng của các gen một cách
chính xác hơn nữa ở mức độ phân tử. Dự án hệ gen người đã mở ra một kỷ nguyên
mới đối với proteomic và transcriptomic. Trong bài thực tập này chúng ta sẽ thảo
luận về các phương pháp tách chiết DNA khác nhau.
Các phương pháp tách chiết DNA
Có rất nhiều protocol tách chiết DNA. Tuy nhiên, có một số bước cần quan
tâm trong quá trình tách chiết DNA. Đó là – (i) phá hủy màng tế bào (ii) loại bỏ
protein (iii) loại bỏ RNA (iv) cô đặc DNA (v) xác định độ tinh sạch và chất lượng
DNA
1. Phá vỡ màng tế bào
Phá vỡ màng tế bào là một trong những bước quan trong quá trình chuẩn bị DNA.
Quy trình tốt nhất để phá vỡ tế bào và thu được DNA còn nguyên vẹn phải dựa vào
các ứng dụng hóa học (sử dụng các chất hoạt động bề mặt) hoặc các quy trình sử
dụng enzyme để phá vỡ. Các chất tẩy rửa có thể hòa tan protein cũng như lipid ở
màng tế bào, bằng cách đó sẽ phá hủy tế bào một cách dễ dàng. Thêm vào đó, các

2. chất tẩy rửa có hiệu quả ức chế tất cả các enzyme DNAse của tế bào và làm biến
tính protein, qua đó hỗ trợ loại bỏ các protein khỏi dung dịch. Phá hủy màng tế bào
động vật được thực hiện bằng cách sử dụng các chất hoạt động bề mặt (còn gọi là
các chất tẩy rửa) như SDS (sodium deodecyl sulfate) hoặc Sarcosyl (sodium
deodecyl sarcosinate).
Ngoài ra có thể sử dụng một số phương pháp khác như:
- Tác động vật lý: Làm đông, dùng chày, cối, máy xay,…. tác động vật lý lên
tế bào
- Tác động sinh học: Dùng enzyme phân giải protein và lipit (proteinkinase
hoặc lysozyme)
2. Loại bỏ protein
Bước thứ hai trong quá trình tinh sạch DNA đòi hỏi cần phải loại bỏ các chất
bám vào DNA, cụ thể là protein từ quá trình phá hủy tế bào. Quá trình này được gọi
là khử protein. Loại bỏ các protein khỏi dung dịch DNA phụ thuộc vào sự khác
nhau về các đặc tính lý học giữa acid nucleic và các protein. Sự khác nhau đó là khả
năng hòa tan, khối lượng riêng và tính nhạy cảm với các enzyme phân hủy.
3. Loại bỏ RNA
Phương pháp thường được sử dụng để loại bỏ RNA trong quá trình chuẩn bị
DNA là sử dụng enzyme. Cho nên, không loại bỏ được tất cả RNA, vì vậy vẫn còn
một lượng nhỏ RNA sót lại trong sản phẩm DNA cuối cùng. Hai loại ribonuclease
tinh sạch sẵn có và rẻ tiền là ribonuclease A và ribonuclease T1.
4. Cô đặc DNA (tăng nồng độ DNA)
Phương pháp kết tủa bằng cồn (tủa cồn) thường được sử dụng để cô đặc
DNA trong dung dịch hòa tan sau khi đã loại bỏ protein. Hai loại cồn thường được
sử dụng để làm tủa DNA: ethanol và isopropanol.
Cơ sở của việc tủa cồn dựa trên nguyên tắc làm giảm độ tan của acid nucleic
trong nước. Trong dung dịch, các phân tử H2O phân cực bao quanh phân tử DNA,
đầu tích điện dương của H2O liên kết chặt chẽ với nhóm phosphodiester tích điện
âm của DNA, tương tác này làm tăng độ tan của DNA trong nước. Ethanol lại có
thể hòa tan vô hạn trong nước, mặc dù vậy chúng phân cực yếu hơn nước rất nhiều.
Phân tử ethanol không thể tương tác với các gốc phân cực của acid nucleic mạnh
mẽ giống như nước, điều này làm cho ethanol trở thành một dung môi rất kém đối
với acid nucleic.
Quá trình kết tủa DNA thường được tiến hành với ethanol 70% (nồng độ
cuối cùng) với nồng độ muối natri hoặc muối amoni thích hợp. Việc sử dụng các

3. muối này có cả ưu và nhược điểm. Ưu điểm chính của muối NaCl, ngoài chuyện
tiện lợi và chi phí thấp, là việc SDS vẫn hòa tan tốt trong ethanol khi có mặt NaCl
0,2M. Do đó muối NaCl được khuyến khích sử dụng khi trước đó tế bào được ly
giải bằng SDS nồng độ cao. Nhược điểm của natri clorua là việc
nó hòa tan kém trong ethanol 70% và gây khó khăn khi muốn loại bỏ chúng khỏi
DNA, nhất là khi thu lấy DNA bằng phương pháp ly tâm.
5. Xác định độ tinh sạch và chất lượng DNA
Bước cuối cùng trong quá trình tách chiết DNA là đánh giá chất lượng DNA
thu được. Máy quang phổ UV được dùng để đánh giá nồng độ DNA, phổ hấp thụ
cực đại của Axit Nucleic (AND, ARN) là 260nm và hấp thụ cực tiểu là 234nm. pH
của môi trường hòa tan DNA cũng có thể ảnh hưởng đến phổ hấp thụ của chúng.
Nồng độ DNA (N) = A260/260; 260 là hệ số tắt (hằng số thể hiện mối
quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thu ánh sáng của chất tan tại một bước sóng ánh
sáng cho trước, ở đây là 260) của DNA. 260 của DNA bằng 0.022g-1
cm-
1
ở pH trung tính. Suy ra, hệ số hấp thụ A260 = 1.0 tương ứng với nồng độ DNA là
50g/mL (=1/0.02), Tuy nhiên, giá trị này có thể thay đổi phụ thuộc tỷ lệ % GC.
Nếu nồng độ DNA kiểm tra quá thấp, các thành phần tạp chất trong mẫu cũng có
thể ảnh hưởng đến độ hấp thụ A260. Có thể kiểm tra trường hợp này bằng cách đọc
mẫu một lần nữa ở bước sóng 320nm (A320). DNA không hấp thụ bước sóng
320nm, do vậy, giá trị của A320 (nếu có) chỉ ra sự có mặt của các hạt bẩn lẫn trong
dung dịch. Nếu dung dịch DNA tinh sạch, A320 sẽ phải nhỏ hơn 5% của A260.
Nồng độ protein được xác định nhờ quang phổ 280nm.
Nồng độ AND trong mẫu được tính theo công thức:
CADN (ng/ml) = A260 * 50 * n
Trong đó: n là hệ số pha loãng
Để xác định độ tinh sạch của DNA người ta dựa vào tỷ lệ:
- A260:A280. Độ tinh sạch cao nhất khi tỷ lệ này đạt 1.8 đến 2.
- A260:A230. Độ tinh sạch cao nhất khi tỷ lệ này >1.5.
III. Các bước thực hiện
a. Các bước thực hiện
Bước 1: Các bạn sẽ được cung cấp tế bào Sarcoma đã được ly tâm
Bước 2: Thêm vào 1 ml dung dịch ly giải tế bào (Lysis buffer – ký hiệu L)
có thành phần là (50 mM TRIS-Cl pH 8, 10 mM EDTA, 2% SDS) và dùng
pipet nhẹ nhàng đánh tan mẫu bằng cách hút dung dịch lên xuống nhiều lần.

4. *) Lysis buffer: phá vỡ tế bào và hỗ trợ quá trình phân tích các
phân tử sinh học trong tế bào.
+ TRIS-CI pH 8: ổn định tính pH của môi trường thí nghiệm
+ 10 Mm EDTA: giúp giúp ổn định nhũ tương, là chất hoạt động bề mặt
và là chất tạo bọt, ổn định độ pH của sản phẩm. Bằng cách chelat hóa các
đồng yếu tố của các enzym này, hoạt tính của enzym giảm, vì chúng sẽ không
có sẵn cho phản ứng. Ngoài ra, EDTA cũng sẽ giúp phân ly các tiểu đơn vị
ribosome 40S và 60S, phức hợp protein-RNA,...
+ 2% SDS:
 Là chất tẩy rửa (các chất hoạt động bề mặt)
 Có thể hòa tan protein cũng như lipid ở màng tế bào, từ đó có thể phá
hủy màng tế bào một cách dễ dàng.
 Có hiệu quả ức chế tất cả các enzyme DNAs của tế bào và làm biến
tính protein, qua đó loại bỏ các protein khỏi dung dịch.
Bước 3: Ủ mẫu trong 5 phút tại 65o
C.
 Đây là nhiệt độ phù hợp để tốc độ phản ứng ly giải tế bào của dung
dịch Lysis buffer đã được thêm vào từ trước đạt hiệu quả tốt nhất, ta sẽ
duy trì dịch mẫu trong khoảng nhiệt độ này ~5’.
Bước 4: Thêm vào mẫu 500 µl 4.5 M NaCl và trộn đều bằng pipet.
 NaCl có tác dụng làm trung hòa điện thế âm trong AND từ đó giúp
AND tách nước tốt hơn khi kết tủa.
 Sử dụng NaCl như một chất kết tủa để tránh việc nhiễm ADN hoặc
ARN với chất tẩy rửa.
 Mặt khác muối NaCl cũng sẽ giúp phá vỡ một số cấu trúc liên kết với
nhau, đặc biệt là protein-DNA.
Bước 5: Ly tâm mẫu với tốc độ 13000 rpm trong 4 phút.
 Ly tâm để tách phần kết tủa và dung dịch. Khi ly tâm hỗn hợp nhiều
chất trong dung dịch, lực ly tâm sẽ tách các chất cùng loại với nhau về
gần nhau để tạo ra lớp phân tách.
Bước 6: Nhẹ nhàng hút phần dịch nổi sang một ống ly tâm 1.5 ml mới. Phân
tử ADN sẽ nằm trong phần dịch nổi này
Bước 7: Tủa DNA bằng cách bổ sung 800 µl isopropanol vào ống và ly tâm
với tốc độ 13000 rpm trong 5 phút.
+ Isopropanol:
 Là một loại cồn

5.  Có tác dụng để cô đặc DNA trong dung dịch hòa tan sau khi đã loại bỏ
protein.
Bước 8: Loại bỏ dịch nổi. Hòa tan tủa DNA bằng 500 µl đệm TE
 Đệm TE: Dùng để bảo quản AND.
Bước 9: Xác định độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng máy quang phổ UV
b. Những vấn đề cần lưu ý
- Thận trọng trong khi thao tác với tất cả các hóa chất, đặc biệt là phenol; nếu
để phenol dính lên da, phải rửa ngay với nhiều nước và bôi polyethylene
glycol, không được dùng cồn.
- Nếu cần làm việc với mẫu máu hoặc mô của người, phải xử lý thận trọng
giống như đối các mẫu bệnh phẩm (HIV, HBV, lao, v.v…).
- Ở bước 8, khi loại bỏ dịch nổi cần đổ một cách dứt khoát, trong lúc đổ không
được để nước chảy ngược lại, sau đó cần để khô tủa trước khi vào bước tiếp
theo.
- Khi dùng pipet trộn mẫu thì cần nhẹ nhàng, không đẩy hết dịch ra khỏi pipet
để hạn chế tạo bọt và giúp ADN không bị đứt gãy.
- Thêm nữa, phải luôn luôn dùng găng tay.
- Khi dùng pipet xong cần để lò xo giãn cực đại, chỉnh thể tích về mức to nhất.
Nếu để bé hơn lâu ngày sẽ bị đơ, hỏng pipet.
IV. Kết quả và phân tích
1. Kết quả:

6. 2. Nhận xét:
-