Активный центр ферментов При изучении механизма химической реакции, катализируемой ферментами, исследователя всегда интересует не только определение промежуточных и конечных продуктов и выяснение отдельных стадий реакции, но и природа техфункциональных групп в молекуле фермента, которые обеспечивают специфичность действия фермента на данныйсубстрат (субстраты) и высокую каталитическую активность. Речь идет, следовательно, о точном знании геометрии и третичной структуры фермента, а также химической природы того участка (участков) молекулы фермента, который обеспечивает высокую скорость каталитической реакции. Участвующие в ферментативных реакциях молекулысубстратов часто имеют небольшие размеры по сравнению с молекулами ферментов, поэтому было высказано предположение, что при образовании фермент-субстратных комплексов в непосредственный контакт с молекулойсубстрата, очевидно, вступает ограниченная часть аминокислот пептидной цепи. Отсюда возникло представление об активном центре фермента. Под активным центром подразумевают уникальную комбинацию аминокислотных остатков в молекуле фермента, обеспечивающую непосредственное связывание ее с молекулой субстрата и прямое участие в акте катализа . Установлено, что у сложных ферментов в состав активного центра входят также простетические группы.

1. Ферменты.
Структура активного центра
в ферментах
(Часть 2-ая)
К.Э. Герман
Зав.кафедрой естественнонаучных дисциплин
МИ РЕАВИЗ

2. Схема активации -1

3. Схема активации - 2

4. Свойства ферментов
1. Специфичность.
2. Каталитическая эффективность.
3. Лабильность ферментов.
4. Способность ферментов к регуляции.
5. Высокий коэффициент полезного
действия (100 %).
4

5. Строение активного центра фермента
А – присоединение субстрата к ферменту в
активном центре. Б – положение
аминокислотных остатков, формирующих
активный центр фермента в первичной
структуре белка.
В – активный центр фермента условно
разделяется на участок связывания и
каталитический участок. Участок
связывания представлен радикалами
аминокислот, функциональные группы
которых обеспечивают связывание
субстрата. Каталитический участок
образован радикалами аминокислотных
остатков, функциональные группы
которых обеспечивают химические
превращения субстрата.
5

6. 6
Активный центр ферментов
Изучение механизма химической реакции, катализируемой ферментом
наряду с определением промежуточных и конечных продуктов на разных
стадиях реакции подразумевает точное знание геометрии третичной
структуры фермента, природы функциональных групп его молекулы,
обеспечивающих специфичность действия и высокую каталитическую
активность на данный субстрат, а также химической природы участка
(участков) молекулы фермента, который обеспечивает высокую скорость
каталитической реакции.
Обычно молекулы субстрата, участвующие в ферментативных реакциях,
по сравнению с молекулами ферментов имеют относительно небольшие
размеры.
Таким образом, при образовании фермент-субстратных комплексов в
непосредственное химическое взаимодействие вступают лишь
ограниченные фрагменты аминокислотной последовательности
полипептидной цепи — «активный центр» — уникальная комбинация
остатков аминокислот в молекуле фермента, обеспечивающая
непосредственное взаимодействие с молекулой субстрата и прямое
участие в акте катализа[10].

7. 7
Наиболее реалистичная ситуация в случае
индуцированного соответствия.
Неправильные субстраты — слишком
большие или слишком маленькие — не
подходят к активному центру

8. В PDB много других примеров сериновых протеаз,
построенные для пищеварения, активизации гормонов,
свертывания крови, активации иммунной системы и
многих других функций.
Они входят в необычную коллекцию производных
аминокислот, предназначенных для оказания помощи в
реакции резки белков, которые были подобраны
природой снова и снова в процессе эволюции

9. Серин в ферментах
Центром этой «машины» является аминокислота
серин, которая активируется с помощью гистидина
и аспартата.
Вместе эти три аминокислоты были названы
«системой передачи заряда).
Гистидин и аспарат помогают в удалении атома
водорода от серина (белого цвета), что делает его
более реакционноспособным при атаке на цепь
целевого белка.

10. Серин разрывает пептидную связь
Бифуркатная
Водородная
связь

11. Активный участок (Ser-His-Asp) расположен в центре
молекулы (закрытая форма ), который недоступен
молекулам растворителя.

12. Дезаминазы удаляют аминогруппу –
например из аминокислот.
Так из серина получается пируват.

13. Кофакторы (металлы)
13
КОМПЛЕКС Mg-АТФ

14. Кофакторы (металлы)
Участие ионов магния в присоединении субстрата
в активном центре гексокиназы
14
В активном центре
гексокиназы есть
участки связывания
для молекулы
глюкозы и
комплекса Mg2+ -
АТФ.
В результате
ферментативной
реакции происходит
перенос концевого
γ-фосфатного
остатка молекулы
АТФ на глюкозу с
образованием
глюкозо-6-фосфата.

16. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/ae/GLO1_Homo_sapiens_small_fast.gif

17. Фермент активируется после
димеризации.
Кальций играет важную роль в
катализе. Каждый из двух ионов
кальция (зеленые шарики) связаны
как OMPLA мономеров, таких, что
отдельные молекулы OMPLA не
может связать кальций
эффективно.
Два субстрата аналогов приведены
расширения вниз от ионов кальция.
Эти аналоги зажатой между двумя
OMPLA monomers.
до сих пор неизвестно, что вызывает
образование активного OMPLA
димера. Скорее всего мембрана
возмущение играет важную роль.
Следует отметить, что активный
центр ориентирован по
направлению к внешней грани
наружной мембраны.
Это фосфолипаза OMPLA
(белок бета-баррель) встроен в
наружную мембрану, содержащую
в основном липополисахариды
(ЛПС) на наружной поверхности и
фосфолипиды на внутренней
поверхности.
http://mbb.science.uu.nl/research/researchofegmond.html
Outer membrane phospholipase A1 (OMPLA)

18. Цифры соответствуют фактической последо-
вательности и положении аминокислот. Эти
аминокислоты находятся на петлевых областей
двумя доменами, и представляют собой
«систему передачи заряда» для активного
сайта. Специфика карман также находится в
петлях двумя доменами. Эти две области
ствола структур важны, поскольку они обеспе-
чивают каркас, на котором конкретные амино-
кислотные связи могут взаимодействовать с
образованием субстрата конкретных активный
сайт. Связь между доменами менее плотно в
активном центре и может позволить более
жесткие движения внутри доменов, которые
могут способствовать катализа. Эти жесткие
движения тела фермента являются основной
причиной его каталитического действия.
Фермент : трипсин - в семье серин-протеазы. Активный сайт Трипсина имеет две области,
а активный центр - между ними. В центре каждой области имеются полости со структурой
ствола. Полярные регионы структуры гидрофильны.
Активный сайт трипсина содержит аминокислотную последовательность
Asp 102, His 57, Ser 195 (аспарагиновая кислота, гистидин, серин и, соответственно).

19. Охота на вирус
СПИДа
A Handy Enzyme
This ribbon representation of the
RT active domain illustrates its
hand-like structure, showing
fingers (blue), palm (pink) and
thumb (green). The active site (red
atoms), where DNA is elongated, is
in the palm region. Also shown is
an RT-inhibitor drug (yellow) in the
pocket where it binds.
http://www.psc.edu/science/2000/madrid/getting_a_grip_on_aids.html

20. То же
Flexibility of HIV-1 Reverse Transcriptase
The crystal structure of RT with DNA (orange). Coil thickness corresponds to the
crystallographic B-factors and simulated movements. The entire molecule is
represented, with the active-site subunit shown in red (crystal structure) and pink
(simulation) and RT's other subunit in corresponding dark and light green. Analysis of
these simulations finds a pattern of motions among regions in concert with other.

21. Транскетолазы (ТКТ) –
фермент микобактерий туберкулеза
Транскетолазы (ТКТ) - фермент микобактерий туберкулеза представляет
собой препарат нового поколения для лечения туберкулеза и имеет низкую
гомологию с ортологичными ферментами человека. Структурная
характеристике транскетолазы от микобактерий туберкулеза (TBTKT),
гомодимера которого мономеры каждый из которых содержит 700
аминокислот. TBTKT катализирует окисление сахаров доноров ксилулозо-5-
фосфат и фруктозо-6-фосфата, а также снижение акцептором сахара рибозы-
5-фосфата. Инвариант остаток консенсусной последовательности ТКТ,
необходимых для тиамина кофактора связывания мутирует в TBTKT; пока его
каталитическая активность не влияет, и разрешение структура 2,5 Å
полноразмерного TBTKT дает объяснение этого. Основные структурные
различия между ферментами человека и микобактерий TKT, которые влияют
как субстрат и кофактора признание и связывание были раскрыты. Эти
изменения объясняют кинетические различия между TBTKT и его
человеческого коллегой и их дифференциальной торможения от малых
молекул.

22. Структура сайта кофактора связывания в TBTKT.
ТЭЦ кофактор – голубые палочки, Mg2 + в голубой области, а также отдельных
аминокислотных остатков в представлении палкой.
Аминокислоты предоставлены различных мономеров обозначены разным
цветом кодирования. (б) При наложении TBTKT (зеленый) к человеческому ТКТ
(серебро) с Кофакторы ТЭС и Mg2 +, и выбранные остатки в представлении
палкой.

23. Structure of the cofactor-binding site in TBTKT. (a)
Illustration showing TPP cofactor as cyan sticks, Mg2+
as a cyan sphere as well as selected amino acid
residues in stick representation. Amino acids
contributed by different monomers are indicated by
different colour-coding. (b) Superposition of the
TBTKT (green) to human TKT (silver) with cofactors
TPP and Mg2+, and selected residues in stick
representation.

24. Superposition of active sites of TBTKT (pdb code 3RIM), human TKT (pdb code 3MOS) and yeast
TKT (pdb code 1ngs). (a) Illustration of the three structures with sphere representation of
substrate erythrose-4-phosphate (E4P) and cofactors TPP and Mg2+ as found in the active site of
yeast TKT. Amino acid residues (amino acid numbering: TBTKT/human TKT/yeast TKT) involved in
the binding of E4P to yeast TKT (light blue orange) as well as the corresponding TBTKT (green
and pink) and human TKT (dark blue/yellow) amino acid residues are shown in stick
representation. (b) Illustration of TBTKT and human TKT with selected amino acid residues of
TBTKT (magenta) and human TKT (yellow). Cofactors TPP and Mg2+ are represented as spheres.

25. Structure
of soybean
lipoxygenase-1
showing the
essential FeII/III
in the centre of
the molecule

26. Структура Субтилизина
Carlsberg из Сенной палочки
(оранжевая)
в комплексе с ингибитором
Eglin C (серый). Данные
взяты из Банк данных
белков 1 cse.pdb.
Ингибитор для
предотвращения
автоматического протеолиза
в процессе кристаллизации
Это также хороший пример
взаимодействия между
протеазой и белковым
субстратом.

27. Crystal structure of human aromatase, the estrogen factory.
A bound androstenedione molecule at the active site is shown
within its electron density surface.
A 3D, animated view of the structure of aromatase can be seen here.

28. Изоцитрат-дегидрогеназа
• (IDH) (ЕС 1.1.1.42) представляет собой фермент, который
катализирует окислительное декарбоксилирование изоцитрата,
производство альфа-кетоглютарата и CO2.
• Двухступенчатый процесс : включает окисление изоцитрата
(вторичный спирт), до оксалосукцината (кетон), а затем
декарбоксилирования карбоксильной группы бета до кетона,
образуя альфакетоглютарат.
• У людей, IDH существует в трех изоформ: IDH 3 катализирует 3-й
шаг цикла лимонной кислоты при преобразовании NAD +, чтобы
обеспечить NADH в митохондриях.
• Изоформы IDH1 и IDH2 катализируют такую же реакцию, вне
цикла лимонной кислоты и используют NADP + в качестве
кофактора, вместо NAD +. Они локализуются в цитозоле, а
также митохондрии и пероксисомы.

30. Дегидрогеназа изоцитрата из E. coli
Кристаллографическая структура Дегидрогеназа изоцитрата из
E. coli . В ней три активных сайта в активном центре.
Three isocitrates, one isocitrate in the binding site for NADP+.

31. Изоцитрат-дегидрогеназа (ИДГ)
• Большинство изоцитратдегидрогеназ димеры, точнее,
Гомодимеры (два одинаковых мономерных субъединиц,
образующих один димерную блок).
• При сравнении C. glutamicum и кишечной палочки, мономера и
димера, соответственно, было обнаружено , что оба фермента
"эффективно катализируют идентичные реакции."
• Тем не менее, ИДГ С. Glutamicum имела в десять раз больше
активности, чем ИДГ кишечной палочки и в семь раз больше
способность к связыванию

32. Дегидрогеназа изоцитрата из E. coli
Некоторые Дегидрогеназы изоцитрата являются тетрамером.

33. Изоцитрат- дегидрогеназа : Один активный участок в аналогичном
ферменте НАДФ у свиней (зеленый). Свиной фермент - гомодимер
и имеет другой активный сайт с другой стороны

34. http://chemwiki.ucdavis.edu/Biological_Chemistry/Catalysts

35. Характеристика взаимодействия между Asp141 и Phe236
и Mn2 +связываемого в L-малате яблочного-фермента,
выделен из печени голубей ( pigeon liver malic enzyme)
Biochem. J. (2003) 374 (633–637)

36. Ленточная структура (слева) изображает металло-бета-лактамаз
фермент. Два иона цинка (фиолетовый сферы) находятся в
активном сайте фермента (с аминокислотами координации
металлы, представленные в виде палочек).
Бета-лактамным антибиотиком связаны в активном центре представлен в виде космических заполнено шариками.

37. Образование Цитозин-монофосфата
(CMP) из фосфат-рибозо-пирофосфата
( PRPP) и цистеина под действием

38. Adenine Phosphoribosyltransferase that
catalyzes the formation of AMP from
Adenine and PRPP.
Это симметричный гомодимер.
Крышка-капот (hood)состоит из альфа 1, 2 и бета
1, 2;
Ядро состоит из остальных альфа-спиралей и
бета-лент. При фиксации каталитического остатка
на петле в течение активного кармана на
площадке, цикл будет закрыт, когда субстрат
связывается с активным сайтом. Этот фермент
действует совместно с 9-deazaadenosine (9DA),
Mg-ион, ФРПФ

39. Мономер справа имеет замкнутый гибкий контур (II),
который выделен толстым. Этот фермент имеет активный
участок, расположенный между центром и концом домена
Активный участок
окружен четырьмя
петлями (I-IV).
На этой фигуре,
ионы
гидратированные
металлов
приведены в
стандартном
представлении
атома ван-дер-
Ваальса

40. 1L1R
The monomer
six alpha-helices
nine beta-strands
The enzyme's
catalytic loop
(beta5 and beta6)
is closed onto the
active site.
9dA - Adenine is
shown in green,
and PRPP is shown
in red.
http://publications.csail.mit.edu/abstracts/abstracts05/chunsrivirot/chunsrivirot.html

41. Фермент
метилентетрагидрофолатредуктаза
Структура активного сайта фермента
метилентетрагидрофолатредуктазы бактерий
(E.coli), который аналогичен по структуре
дрожжевого фермента MTHFR.
Пять-сайтов, помеченных красным цветом - места,
где общие мутации происходят влияния на
активность фермента;
мутации в зеленой меченных сайта не повлиять на
деятельность фермента. Geoff Хорнер

42. Метилентетра-
гидрофолат-
редуктаза

43. At the top is an enzyme that uses NAD as the cofactor
to perform the oxidation reaction (PDB entry 1gco), and
the enzyme at the bottom (PDB entry 1cq1) uses ...

45. Изоцитрат-дегидрогеназа
• (IDH) (ЕС 1.1.1.42) представляет собой фермент, который
катализирует окислительное декарбоксилирование изоцитрата,
производство альфа-кетоглютарата и CO2.
• Двухступенчатый процесс : включает окисление изоцитрата
(вторичный спирт), до оксалосукцината (кетон), а затем
декарбоксилирования карбоксильной группы бета до кетона,
образуя альфакетоглютарат.
• У людей, IDH существует в трех изоформ: IDH 3 катализирует
третий шаг цикла лимонной кислоты при преобразовании NAD
+, чтобы NADH в митохондриях.
• Изоформы IDH1 и IDH2 катализируют такую же реакцию, вне
цикла лимонной кислоты и используют NADP + в качестве
кофактора, вместо NAD +. Они локализуются в цитозоле, а
также митохондрии и пероксисомы. [2]

46. Дегидрогеназа изоцитрата из E. coli
Кристаллографическая структура Дегидрогеназа изоцитрата из
E. coli . В ней три активных сайта в активном центре.
Three isocitrates, one isocitrate in the binding site for NADP+.

47. Изоцитрат-дегидрогеназа
• (IDH) (ЕС 1.1.1.42) представляет собой фермент, который
катализирует окислительное декарбоксилирование изоцитрата,
производство альфа-кетоглютарата и CO2.
• Двухступенчатый процесс : включает окисление изоцитрата
(вторичный спирт), до оксалосукцината (кетон), а затем
декарбоксилирования карбоксильной группы бета до кетона,
образуя альфакетоглютарат.
• У людей, IDH существует в трех изоформ: IDH 3 катализирует
третий шаг цикла лимонной кислоты при преобразовании NAD
+, чтобы NADH в митохондриях.
• Изоформы IDH1 и IDH2 катализируют такую же реакцию, вне
цикла лимонной кислоты и используют NADP + в качестве
кофактора, вместо NAD +. Они локализуются в цитозоле, а
также митохондрии и пероксисомы. [2]

48. Дегидрогеназа изоцитрата из E. coli
Кристаллографическая структура Дегидрогеназа изоцитрата из
E. coli . В ней три активных сайта в активном центре.
Three isocitrates, one isocitrate in the binding site for NADP+.