1. Обмен отдельных аминокислот. Наследственные
энзимопатии
Биологическая химия. Лекция 15
Зав.кафедрой, к.мед.н., доц. Шатова Ольга Петровна
Донецк, 2015
2. Углеродный скелет аминокислоты может
превратиться в:
Ацетил-КоА
Ацетоацетил-КоА
Пируват
Метаболит ЦТК
Таким образом, из аминокислот может
синтезироваться глюкоза (гликогенные) или
кетоновые тела (кетогенные)
1. Гликогенные и кетогенные
аминокислоты
5. 2.Обмен глицина и серина
Серин - заменимая аминокислота, синтезируется из
промежуточного продукта гликолиза - 3-фосфоглицерата, а
аминогруппу получает от глутаминовой кислоты.
Глицин - также заменимая аминокислота, основным источником
которой служит серин. Реакцию синтеза глицина из серина
катализирует фермент серин-оксиметилтрансфераза,
коферментом которой является Н4-фолат.
7. Наследственные нарушения обмена глицина*
Гиперглицинемия характеризуется повышенной концентрацией глицина в крови вследствие
дефекта глицинрасщепляющей ферментной системы. Наиболее тяжёлое проявление
гиперглицинемии - резкое повреждение мозга, судороги, гипотония, нарушение дыхания.
Глицинурия характеризуется повышенным выделением глицина с мочой (до 1 г/сут) при
нормальном содержании его в крови. Один из симптомов этого заболевания - образование
оксалатных камней в почках, причём содержание оксалата в моче находится в пределах нормы.
Избыток оксалата имеет эндогенное происхождение (образуется из глицина, при
дезаминировании глиоксилат - предшественник оксалата. Метаболический дефект, очевидно,
состоит в нарушении метаболизма глиоксилата - невозможности его превращения снова в глицин
из-за дефекта глицинаминотрансферазы. Причиной глицинурии является, очевидно, нарушение
реабсорбции глицина в почках.
2.Обмен глицина и серина
8. 3. Обмен серосодержащих аминокислот
Метионин - незаменимая аминокислота. Она необходима для
синтеза белков организма, метионил-тРНК участвует в
инициации процесса трансляции.
Активной формой метионина является S-аденозилметионин
(SAM) , образуеться в результате присоединения метионина к
молекуле аденозина. Аденозин образуется при гидролизе АТФ.
S-аденозилметионин (SAM) участвует в реакциях
трансметилирования:
• Синтез фосфатидилхолина из фосфатидилэтаноламина
• Синтез карнитина
• Синтез креатина
• Синтез адреналина
В состав белков человека входят 2 аминокислоты, содержащие серу, - метионин и цистеин.
9. Регенерация метионина
Реакции метилирования играют важную роль в организме и протекают очень интенсивно. Это вызывает большой
расход метионина, так как он является незаменимой аминокислотой (в клетках метионин синтезироваться не
может). В связи с этим большое значение приобретает возможность регенерации метионина с участием
заменимых аминокислот (Сер, Гли). В результате отщепления метильной группы SAM превращается в S-
аденозилгомоцистеин (SAГ), который при действии гидролазы расщепляется на аденозин и гомоцистеин.
S-аденозилгомоцистеин + Н2О → Аденозин + Гомоцистеин
3. Обмен серосодержащих аминокислот
10. Обмен цистеина
Синтез цистеина из гомоцистеина происходит в 2
стадии под действием пиридоксальзависимых (В6) ферментов
цистатионинсинтазы и цистатионинлиазы.
При нарушении использования гомоцистеина в организме из него образуется
гомоцистин:
Гомоцистин может накапливаться в крови и тканях" выделяться с мочой, вызывая
гомоцистинурию. Возможной причиной является наследственное нарушение
обмена гомоцистеина либо гиповитаминоз фолиевой кислоты, а также витаминов
В12 и В6. Из других биохимических нарушений можно
отметить цистатионинурию, также часто возникающую при недостаточности
витаминов группы В.
3. Обмен серосодержащих аминокислот
12. 4. Обмен ароматических аминокислот
(фенилаланина и тирозина)
Фенилкетонурия -
наследственное
заболевание, связанное с
мутациями в гене
фенилаланингидроксилазы .
Большие концентрации
фенилаланина
ограничивают транспорт
тирозина и триптофана
через
гематоэнцефаличеекий
барьер и тормозят синтез
нейро-медиаторов
(дофамина, норадреналина,
фенилаланин
гидроксилаза
13. черные и коричневые
4. Обмен ароматических аминокислот
(фенилаланина и тирозина)
желтые и красновато-
коричневые
14. Альбинизм
Причина метаболического нарушения - врождённый дефект тирозиназы.
Этот фермент катализирует превращение тирозина в ДОФА в
меланоцитах. В результате дефекта тирозиназы нарушается синтез
пигментов меланинов.
Клиническое проявление альбинизма (от лат. albus - белый) – отсутствие
пигментации кожи и волос. У больных часто снижена острота зрения,
возникает светобоязнь. Длительное пребывание таких больных под
открытым солнцем приводит к раку кожи.
4. Обмен ароматических аминокислот
(фенилаланина и тирозина)
15. Алкаптонурия ("чёрная моча")
Дефект фермента диоксигеназы (оксидазы)
гомогентизиновой кислоты
Для этой болезни характерно выделение с мочой
большого количества гомогентизиновой кислоты,
которая, окисляясь кислородом воздуха, образует
тёмные пигменты алкаптоны.
Клиническими проявлениями
болезни, кроме потемнения мочи на воздухе,
являются пигментация соединительной ткани
(охроноз) и артрит.
4. Обмен ароматических аминокислот
(фенилаланина и тирозина)
16. Обмен триптофана:
кинурениновый и серотониновый пути
1. Кинурениновый (основной) – окисление
и разрушение индольного кольца с
образованием производных кинуреновой
и антраниловой кислот. В одном из
ответвлений этого пути одна из 60
молекул триптофана превращается в
никотиновую кислоту (вит амин РР),
большая часть триптофана распадается до
ацетил-S-КоА.
2. Серотониновый путь – окисление до 5-
окситриптофана и далее превращение
в серотонин и мелатонин.
3. Индольный путь – образование
индольных производных, которые затем
конъюгируются и выводятся с мочой.
Синдром Хартнупа (триптофанурия), симптом голубых пеленок,
возникающий из-за того, что избыток триптофана в кишечнике под
действием микрофлоры превращается в индикан, который выводится с
мочой и окисляется в индиго синего цвета.
19. NO-синтаза
Name Ген(ы) Локализация Функции
Нейрональная NO-
синтаза (nNOS или
NOS1)
NOS1 •нервная ткань
•клеточная
передача
сигнала
Индуцируемая NO-
синтаза (iNOS или
NOS2)
NOS2A,
NOS2B,
NOS2C
•Иммунная
система
•сердечно-
сосудистая
система
•иммунная защи
та от патогенов
Эндотелиальная NO-
синтаза (eNOS или
NOS3 или cNOS)
NOS3 •эндотелий •Вазодилатация
- Unlike glucose and fatty acids, which can be stored.
Эту реакцию катализирует фермент метионин аденозилтрансфераза, присутствующий во всех типах клеток. Структура (-S+-CH3) в SAM - нестабильная группировка, определяющая высокую активность метильной группы (отсюда термин "активный метионин"). Эта реакция уникальна для биологических систем, так как, по-видимому, является единственной известной реакцией, в результате которой освобождаются все три фосфатных остатка АТФ.
Отщепление метильной группы от SAM и перенос её на соединение-акцептор катализируют ферменты метилтрансферазы. SAM в ходе реакции превращается в S-аденозилгомоцистеин (SAT).
Гомоцистеин может снова превращаться в ме тионин под действием гомоцистеинметилтранс феразы. Донором метильной группы в этом слу чае служит N5-метил-Н4-фолат:
Промежуточным переносчиком метильной группы в этой реакции служит производное витамина В12 - метилкобаламин, выполняющий роль кофермента.
Вторая серосодержащая аминокислота - цистеин. Она условно заменима, так как для её синтеза необходим атом серы, источником которого служит незаменимая аминокислота метионин.
Для синтеза цистеина необходимы 2 аминокислоты:
Серин - источник углеродного скелета;
Метионин - первичный источник атома S (см. схему А).
В высокой концентрации фен токсичен
Катаболизм тирозина в печени
В печени происходит катаболизм тирозина до конечных продуктов. Специфический путь катаболизма включает несколько ферментативных реакций, завершающихся образованием фумарата и ацетоацетата (см. схему А на с. 507):
Трансаминирование тирозина с ос-кетоглутаратом катализирует тирозинаминотрансфе-раза(кофермент ПФ) - индуцируемый фермент печени млекопитающих. В результате образуется п-гидроксифенилпируват.
В реакции окисления п-гидроксифенилпирувата в гомогентизиновую кислоту происходит декарбоксилирование, гидроксилирование ароматического кольца и миграция боковой цепи. Реакцию катализирует фермент п-гидроксифенилпируватдиоксигеназа, кофакторами которого выступают витамин С и Fe2+.
Превращение гомогентизиновой кислоты в фумарилацетоацетат сопровождается расщеплением ароматического кольца. Эта реакция катализируется диоксигеназой гомогентизиновой кислоты, в качестве кофермента содержащей Fe2+.
Обмен фенилаланина и тирозина связан со значительным количеством реакций гидроксилирования, которые катализируют оксигеназы. Ферменты оксигеназы (гидроксилазы) используют молекулу О2 и кофермент-донор водорода (чаще - Н4БП). Для катализа оксигеназам необходимы кофакторы - Fe2+ или гем (для некоторых - Сu+), а для многих ещё и витамин С. Оксигеназы делят на 2 группы:
Монооксигеназы - один атом О2 присоединяют к продукту реакции, другой используют для образования Н2О;
Диоксигеназы - оба атома О2 используют для образования продукта реакции.
Почти все процессы расщепления ароматических колец в биологических системах катализируются диоксигеназами, подклассом ферментов, открытым японским биохимиком Осами Хайяши.
В результате разрыва бензольного кольца образуется малеилацетоацетат, который в процессе цис- и транс-изомеризации превращается в фумарилацетоацетат.
Гидролиз фумарилацетоацетата при действии фумарилацетоацетатгидролазы приводит к образованию фумарата и ацетоацетата.
Превращение тирозина в меланоцитах
В пигментных клетках (меланоцитах) тирозин выступает предшественником тёмных пигментов - меланинов. Среди них преобладают 2 типа: эумеланины и феомеланины. Эумеланины (чёрного и коричневого цвета) - нерастворимые высокомолекулярные гетерополимеры 5,6-дигидроксииндола и некоторых его предшественников. Феомеланины - жёлтые или красновато-коричневые полимеры, растворимые в разбавленных щелочах. Находятся они, в основном, в составе волос. Меланины присутствуют в сетчатке глаз. Цвет кожи зависит от распределения меланоцитов и количества в них разных типов меланинов.
Синтез меланинов - сложный, многоступенчатый, разветвлённый процесс. Краткая схема синтеза представлена на рис. 9-28.
Первую реакцию - превращение тирозина в ДОФА - катализирует тирозиназа, использующая в качестве кофактора ионы Сu+ (см. схему А на с. 509).
Превращение тирозина в щитовидной железе
В щитовидной железе синтезируются и выделяются гормоны йодтиронины: тироксин (тет-райодтиронин) и трийодтиронин. Эти гормоны представляют собой йодированные остатки тирозина, которые попадают в клетки щитовидной железы через базальную мембрану (см. раздел 11).
Тирозингидроксилаза (1) в надпочечниках и ка-техоламинергических нейронах не нуждается в ионах меди. Это - Fе2+-зависимый фермент, аналогично фенилаланингидроксилазе в качестве кофермента использующий Н4БП.
Физиологическая роль тирозингидроксилазы чрезвычайно велика, так как этот фермент является регуляторным и определяет скорость синтеза катехоламинов.
Активность тирозингидроксилазы значительно изменяется в результате:
Аллостерической регуляции (ингибитор - норадреналин);
Фосфорилирования/дефосфорилирования: в результате фосфорилирования с участием протеинкиназы А снижаются Кm для кофермента Н4БП и сродство фермента к норадреналину, в результате чего происходит активация тирозингидроксилазы.
Количество фермента регулируется на уровне транскрипции.
ДОФА-декарбоксилаза (2) (кофермент - ПФ) катализирует образование дофамина, который при участии дофамингидроксилазы (3) (монооксигеназы) превращается в норадреналин. Для функционирования фермента необходимы ионы Сu+, витамин С и тетрагидробиоптерин.
В мозговом веществе надпочечников фенилэтаноламин-N-метилтрансфераза (4) катализирует метилирование норадреналина, в результате чего образуется адреналин. Источником метальной группы служит &АМ.
Дофамин и норадреналин служат медиаторами в синаптической передаче нервных импульсов,
Классическая ФКУ - наследственное заболевание, связанное с мутациями в гене фенилаланингидроксилазы, которые приводят к снижению активности фермента или полной его инактивации. При этом концентрация фенилаланина повышается в крови в 20-30 раз (в норме - 1,0-2,0 мг/дл), в моче - в 100-300 раз по сравнению с нормой (30 мг/дл). Концентрация фенилпирувата и фениллактата в моче достигает 300-600 мг/дл при полном отсутствии в норме.
Наиболее тяжёлые проявления ФКУ - нарушение умственного и физического развития, судорожный синдром, нарушение пигментации. При отсутствии лечения больные не доживают до 30 лет. Частота заболевания - 1:10 000 новорождённых. Заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу.
Тяжёлые проявления ФКУ связаны с токсическим действием на клетки мозга высоких концентраций фенилаланина, фенилпирувата, фениллактата. Большие концентрации фенилаланина ограничивают транспорт тирозина
510
и триптофана через гематоэнцефаличеекий барьер и тормозят синтез нейро-медиаторов (дофамина, норадреналина, серотонина).
Вариантная ФКУ (коферментзависимая гиперфенилаланинемия) - следствие мутаций в генах, контролирующих метаболизм Н4БП. Клинические проявления - близкие, но не точно совпадающие с проявлениями классической ФКУ. Частота заболевания - 1-2 случая на 1 млн новорождённых.
Н4БП необходим для реакций гидроксилирования не только фенилаланина, но также тирозина и триптофана, поэтому при недостатке этого кофермента нарушается метаболизм всех 3 аминокислот, в том числе и синтез ней-ромедиаторов. Заболевание характеризуется тяжёлыми неврологическими нарушениями и ранней смертью ("злокачественная" ФКУ).
Прогрессирующее нарушение умственного и физического развития у детей, больных ФКУ, можно предотвратить диетой с очень низким содержанием или полным исключением фенилаланина. Если такое лечение начато сразу после рождения ребёнка, то повреждение мозга предотвращается. Считается, что ограничения в питании могут быть ослаблены после 10-летнего возраста (окончание процессов миелиниза-ции мозга), однако в настоящее время многие педиатры склоняются в сторону "пожизненной диеты".
Для диагностики ФКУ используют качественные и количественные методы обнаружения патологических метаболитов в моче, определение концентрации фенилаланина в крови и моче. Дефектный ген, ответственный за фенилкетонурию, можно обнаружить у фенотипически нормальных гетерозиготных носителей с помощью теста толерантности к фенилаланину. Для этого обследуемому дают натощак ∼10 г фенилаланина в виде раствора, затем через часовые интервалы берут пробы крови, в которых определяют содержание тирозина. В норме концентрация тирозина в крови после фенилаланиновой нагрузки значительно выше, чем у гетерозиготных носителей гена фежилкетонурии. Этот тест используется в генетической консультации для определения риска рождения больного ребёнка. Разработана схема скрининга для выявления новорождённых детей с ФКУ. Чувствительность теста практически достигает 100%.
В настоящее время диагностику мутантного гена, ответственного за ФКУ, можно проводить с помощью методов ДНК-диагностики (рестрикционного анализа и ПЦР).
Некоторые нарушения катаболизма тирозина в печени приводят к тирозинемии и тирози-нурии. Различают 3 типа тирозинемии.
Тирозинемия типа 1 (тирозиноз). Причиной заболевания является, вероятно, дефект фермента фумарилацетоацетатгидролазы, катализирующего расщепление фумарилацетоа-цетата на фумарат и ацетоацетат (рис. 9-28). Накапливающиеся метаболиты снижают активность некоторых ферментов и транспортных систем аминокислот. Патофизиология этого нарушения достаточно сложна. Острая форма тирозиноза характерна для новорождённых. Клинические проявления - диарея, рвота, задержка в развитии. Без лечения дети погибают в возрасте 6-8 мес из-за развивающейся недостаточности печени.Хроническая форма характеризуется сходными, но менее выраженными симптомами. Гибель наступает в возрасте 10 лет. Содержание тирозина в крови у больных в несколько раз превышает норму. Для лечения используют диету с пониженным содержанием тирозина и фенилаланина.
Тирозинемия типа II (синдром Рихнера-Ханхорта). Причина - дефект фермента тирозина-минотрансферазы. Концентрация тирозина в крови больных повышена. Для заболевания характерны поражения глаз и кожи, умеренная умственная отсталость, нарушение координации движений.
Тирозинемия новорождённых (кратковременная). Заболевание возникает в результате снижения активности фермента п-гидроксифенилпируватдиоксигеназы, превращающего п-гидроксифенилпируват в гомогентизиновую кислоту (рис. 9-28). В результате в крови больных повышается концентрация п-гидроксифенилацетата, тирозина и фенил-аланина. При лечении назначают бедную белком диету и витамин С.
Алкаптонурия ("чёрная моча")
Причина заболевания - дефект диоксигеназы гомогентизиновой кислоты (рис. 9-28). Для
511
этой болезни характерно выделение с мочой большого количества гомогентизиновой кислоты, которая, окисляясь кислородом воздуха, образует тёмные пигменты алкаптоны. Это метаболическое нарушение было описано ещё в XVI веке, а само заболевание охарактеризовано в 1859 г. Клиническими проявлениями болезни, кроме потемнения мочи на воздухе, являются пигментация соединительной ткани (охроноз) и артрит. Частота - 2-5 случаев на 1 млн новорождённых. Заболевание наследуется по аутосомнорецессивному типу. Диагностических методов выявления гетерозиготных носителей дефектного гена к настоящему времени не найдено.
Альбинизм
Причина метаболического нарушения - врождённый дефект тирозиназы. Этот фермент катализирует превращение тирозина в ДОФА в меланоцитах. В результате дефекта тирозиназы нарушается синтез пигментов меланинов.
Клиническое проявление альбинизма (от лат. albus - белый) - отсутствие пигментации кожи и волос. У больных часто снижена острота зрения, возникает светобоязнь. Длительное пребывание таких больных под открытым солнцем приводит к раку кожи. Частота заболевания 1:20 000.
Нарушение синтеза катехоламинов (рис. 9-28) может вызывать различные нервно-психические заболевания, причём патологические отклонения наблюдаются как при снижении, так и при увеличении их количества.
Болезнь Паркинсона
Заболевание развивается при недостаточности дофамина в чёрной субстанции мозга. Это одно из самых распространённых неврологических заболеваний (частота 1:200 среди людей старше 60 лет). При этой патологии снижена активность тирозингидроксилазы, ДОФА-декарбоксилазы. Заболевание сопровождается тремя основными симптомами: акинезия (скованность движений), ригидность (напряжение мышц), тремор (непроизвольное дрожание). Дофамин не проникает через гематоэнцефалический барьер и как лекарственный препарат не используется. Для лечения паркинсонизма предлагаются следующие принципы:
заместительная терапия препаратами-предшественниками дофамина (производными ДОФА) - леводопа, мадопар, наком и др.
подавление инактивации дофамина ингибиторами МАО (депренил, ниаламид, пиразидол и др.).
Депрессивные состояния часто связаны со снижением в нервных клетках содержания дофамина и норадреналина.
Гиперсекреция дофамина в височной доле мозга наблюдается при шизофрении.
Хартнуп – имя больного, родители которого были двоюродными братом и сестрой
При синдроме Хартнупа в результате дефекта транспортных систем клеток возникает снижение всасывания (мальабсорбция) триптофана в слизистой кишечника и уменьшение его реабсорбции в канальцах почек.
Патогенез
Отмечается гипераминоацидемия с отсутствием триптофана в крови, в моче преобладают производные триптофана. Так как триптофан необходим для синтеза эндогенного витамина РР, то клиническая картина характеризуется признаками недостаточности витамина PP (перейти).
Клиническая картина
У пациентов наблюдаются дерматологические, неврологические и психические проявления пеллагры, фоточувствительная кожная сыпь, эмоциональная лабильность, возможны энцефалопатия, преходящая мозжечковая атаксия.
Одним из ярких проявлений синдрома является симптом голубых пеленок, возникающий из-за того, что избыток триптофана в кишечнике под действием микрофлоры превращается в индикан, который выводится с мочой и окисляется в индиго синего цвета.
Основы лечения
Симптомы болезни уменьшаются или даже исчезают при кормлении ребенка продуктами с высоким содержанием белка (4 г на 1 кг массы тела в день) и добавлением никотиновой кислоты (по 40-200 мг 4 раза в день).
Аргинин участвует также в синтезе полиаминов (путресцина, спермина, спермидина, агматина и др.), присутствующих во всех клетках в относительно больших, зачастую миллимолярных концентрациях. Особенно много полиаминов синтезируется клетками предстательной железы и выделяется с семенной жидкостью. В настоящее время считается, что полиамины содействуют пролиферации и дифференцировке, ингибируют апоптоз клеток, что, возможно, связано со способностью этих соединений активировать растворимую гуанилатциклазу и повышать уровень цГМФ. Показано влияние полиаминов на состояние прооксидантно-антиоксидантной системы организма. С одной стороны полиамины проявляют антиоксидантную активность, перехватывая радикалы и способствуя экспрессии соответствующих протекторных белков за счет взаимодействия с ДНК, а с другой - окисление полиаминов приводит к образованию избытка перекиси водорода, который приводит к развитию оксидативного стресса [10].
В процессе декарбоксилирования аргинина образуется агматин. Недавние исследования показали, что агматин может быть нейромедиатором: он синтезируется в мозгу, сохраняется в синаптических везикулах определенных нейронов, высвобождается при деполяризации, связывается α-2-адренорецепторами, блокирует NMDA рецепторные и связывающие другие лиганды катионные каналы, инактивируется агматиназой. Кроме того, агматин ингибирует NO-синтазы и индуцирует высвобождение некоторых пептидных гормонов [24]. Постоянный и довольно значительный расход аргинина в организме идет на синтез NO [9,22], который усиливается в условиях индукции соответствующей NO-синтазы при воспалительных процессах, сепсисе и др. патологиях.
При стрессовых состояниях, связанных с интенсификацией белкового и креатинового обмена, например, при больших физических нагрузках, инфекционных заболеваниях (в том числе септических состояниях), восстановлении после травм, заживлении ран при хирургических вмешательствах, ожогах, а также у детей в период интенсивного роста и некоторых наследственных заболеваниях, сопровождающихся дефицитом ферментов синтеза аргинина, аргинин становится незаменимым и обязательно должен в необходимых количествах поступать в организм извне с пищей, напитками, биодобавками или в виде инфузий. Здесь уместно отметить, что пероральный путь поступления аргинина является менее эффективным в сравнении с инфузиями, так как эта высокополярная аминокислота плохо всасывается в кишечнике, ее значительная часть легко метаболизируется микрофлорой кишечника и не поступает в кровяное русло. Всасывание аргинина из пищеварительной системы особенно снижается при различных дисбактериозах, сопровождающихся уменьшением рН. Поэтому в последнее время для перорального потребления аргинина предлагаются различные его производные (L-Arginine Alpha-Ketoglutarate, Arginine Ethyl Ester и др.), которые почти полностью всасываются в кровяное русло [6,8], однако инфузия аргинина по прежнему остается наиболее эффективным путем доставки его в организм.
Аргинин: биологическое действие, влияние на синтез оксида азота
Назад до «Бібліотеки»
Авторы: Дмитренко Н.П., Кишко Т.О., Шандренко С.Г.
Аргинин: биологическое действие, влияние на синтез оксида азота
Дмитренко Н.П. к.б.н. Кишко Т.О., Шандренко С.Г.,
Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И.Медведя МОЗ Украины
(Представлено чл.-кор. НАН Украины Н.М. Гулой)
Для людей аргинин считается условно незаменимой аминокислотой. Его эндогенный синтез осуществляется главным образом из цитруллина, который синтезируется в слизистой тонкого кишечника как конечный продукт глутаминового / глутаматного метаболизма и током крови почти весь доставляется в почки, где при участии аспартата в цикле мочевой кислоты превращается в аргинин. Последний через почечные вены поступает в циркуляцию и разносится к различным клеткам и тканям организма. Синтез аргинина также возможен из цитруллина, орнитина и пролина, но он выражен слабо [3,22].
Количество аргинина, синтезируемого у взрослого человека (примерно 2 грамма в день), достаточно, чтобы обеспечить его физиологические потребности в нормальных условиях. Значительные количества аргинина расходуются на синтез креатина, который является субстратом креатинкиназной ферментативной системы, ответственной в клетке за депонирование и транспорт энергии в виде КрФ от источников ее образования к местам использования. Взрослый организм в результате спонтанного, без участия ферментов, расщепления ежедневно теряет 1-2 г креатина, на синтез которого требуется 1.75 – 3.5 г аргинина [3,22]. Поэтому для восполнения клеточного фонда креатина, необходимо дополнительное поступление его или аргинина из экзогенных источников.
Аргинин участвует также в синтезе полиаминов (путресцина, спермина, спермидина, агматина и др.), присутствующих во всех клетках в относительно больших, зачастую миллимолярных концентрациях. Особенно много полиаминов синтезируется клетками предстательной железы и выделяется с семенной жидкостью. В настоящее время считается, что полиамины содействуют пролиферации и дифференцировке, ингибируют апоптоз клеток, что, возможно, связано со способностью этих соединений активировать растворимую гуанилатциклазу и повышать уровень цГМФ. Показано влияние полиаминов на состояние прооксидантно-антиоксидантной системы организма. С одной стороны полиамины проявляют антиоксидантную активность, перехватывая радикалы и способствуя экспрессии соответствующих протекторных белков за счет взаимодействия с ДНК, а с другой - окисление полиаминов приводит к образованию избытка перекиси водорода, который приводит к развитию оксидативного стресса [10].
В процессе декарбоксилирования аргинина образуется агматин. Недавние исследования показали, что агматин может быть нейромедиатором: он синтезируется в мозгу, сохраняется в синаптических везикулах определенных нейронов, высвобождается при деполяризации, связывается α-2-адренорецепторами, блокирует NMDA рецепторные и связывающие другие лиганды катионные каналы, инактивируется агматиназой. Кроме того, агматин ингибирует NO-синтазы и индуцирует высвобождение некоторых пептидных гормонов [24]. Постоянный и довольно значительный расход аргинина в организме идет на синтез NO [9,22], который усиливается в условиях индукции соответствующей NO-синтазы при воспалительных процессах, сепсисе и др. патологиях.
При стрессовых состояниях, связанных с интенсификацией белкового и креатинового обмена, например, при больших физических нагрузках, инфекционных заболеваниях (в том числе септических состояниях), восстановлении после травм, заживлении ран при хирургических вмешательствах, ожогах, а также у детей в период интенсивного роста и некоторых наследственных заболеваниях, сопровождающихся дефицитом ферментов синтеза аргинина, аргинин становится незаменимым и обязательно должен в необходимых количествах поступать в организм извне с пищей, напитками, биодобавками или в виде инфузий. Здесь уместно отметить, что пероральный путь поступления аргинина является менее эффективным в сравнении с инфузиями, так как эта высокополярная аминокислота плохо всасывается в кишечнике, ее значительная часть легко метаболизируется микрофлорой кишечника и не поступает в кровяное русло. Всасывание аргинина из пищеварительной системы особенно снижается при различных дисбактериозах, сопровождающихся уменьшением рН. Поэтому в последнее время для перорального потребления аргинина предлагаются различные его производные (L-Arginine Alpha-Ketoglutarate, Arginine Ethyl Ester и др.), которые почти полностью всасываются в кровяное русло [6,8], однако инфузия аргинина по прежнему остается наиболее эффективным путем доставки его в организм.
L-аргинин используется в организме как строительный и энергетический материал, а также функционирует как сигнальная молекула. Он содержит положительно заряженную R-группу и в больших количествах входит в состав основных белков. Среди них ядерные белки протамины и гистоны, играющие исключительную роль в формировании структуры и регуляции функции генов, а также пептиды, такие как тафцин – тетрапептид с выраженным иммуномодуляторным действием. Поэтому при дефиците аргинина в первую очередь снижается синтез и уменьшается содержание этих белков, пептидов и полиаминов, например, в богатой ими сперме. Из аргинина, как глюкогенной аминокислоты, образуется D-глюкоза и гликоген. Аргинин стимулирует образование ряда цитокинов, а также высвобождение из гипофиза гормона роста и пролактина, а из поджелудочной железы глюкагона и инсулина; активирует углеводный и липидный обмен [13,19,20,25].
Разностороннее участие аргинина в метаболизме, определяет широкий спектр его терапевтического действия и эффективность использования в составе диетических добавок. Он увеличивает мышечную массу, уменьшает объем жировой ткани, способствует нормализации состояния соединительной ткани. Аргинин, а также богатые им пептиды и белки, снижают рост патогенной микрофлоры, что связано с высоким положительным зарядом его боковой цепи и отрицательным зарядом внешней стенки бактерий, который значительно превышает подобный заряд в мембранах теплокровных. Являясь предшественником важных компонентов соединительной ткани: пролина и оксипролина, аргинин способствует заживлению ран, в том числе гнойных. Регулируя тонус гладкой мускулатуры, проницаемость и микроциркуляцию сосудов, аргинин снижает кровяное давление и ускоряет кровоток, что облегчает доставку кислорода к миокарду, головному мозгу, конечностям и др. органам. Аргинин противодействует тромбообразованию, снижает уровень холестерина в крови и предупреждает развитие атеросклероза. У людей с гиперхолестеринемией, атеросклерозом и различными сердечно-сосудистыми заболеваниями, включая ишемический инсульт, а также животных, у которых моделировались эти состояния, длительное пероральное поступление или периодические инфузии L-аргинина существенно улучшают функцию эндотелия и клиническую симптоматику. Аргинин участвует в коммуникации между нервными клетками и улучшает память, увеличивает бодрость и снижает депрессию, укрепляет иммунитет, повышает резистентность к инфекционным заболеваниям и ранним стадиям канцерогенеза, скорость заживления ран, а также повышает потенцию и стимулирует сперматогонез. Положительный эффект инфузии аргинина отмечается при сепсисе. Через превращение в орнитиновом цикле аргинин участвует в обезвреживании аммиака в организме. Он снижает частоту апоптоза у клеток, подвергнутых повреждающим воздействиям. Потребности в аргинине возрастают при старении и физических нагрузках [1,7,11,14,17,18,21,23,25] .
Такую многоплановость действия аргинина многие исследователи относят к его способности при введении в организм усиливать синтез оксида азота [4,11,14,16]. Физиологические и токсические функции NO реализуются в результате сложных химических превращений, основными участниками которых являются переходные металлы, тиолы, кислород, супероксид и другие радикалы. При этом реализуются прямые (через образование нитрозотиолов, нитрозильных комплексов гемового и негемового железа) и опосредованные другими активными формами азота пути действия NO; через реакции S- и N-нитрозирования, нитрования, окисления, дезаминирования и другие осуществляется регуляция метаболических процессов или реализуются токсические эффекты [2]. Однако очевидность усиления синтеза NO при поступлении в организм аргинина представляется довольно спорной и не всегда подтверждается экспериментально [12,26].
Трудно представить, что NO-синтазы, имеющие высокое сродство к аргинину (Km у них находится в пределах микромолярных величин) испытывают в нем недостаток, поскольку его внутриклеточные концентрации исчисляются в миллимолях. Однако, в последнее время показано, что введение аргинина может приводить к усилению синтеза NO в организме. Этот феномен, известный как «аргининовый парадокс», осуществляется при наличии в клетках определенных концентраций свободного асимметричного диметиларгинина (ADMA), который в условиях in vivo конкурирует с аргинином на уровне транспортера Y+ и/или NO-синтаз. При высоких уровнях ADMA, угнетающих эндотелиальную NO-синтазу, введение L-аргинина восстанавливает ее активность, нормализует функцию эндотелия и сосудистый тонус [4,15]. С другой стороны, направленность действия аргинина, опосредуемая через ускорение ендогенного синтеза NO, может быть различной в зависимости от состояния организма. Так, при выраженных воспалительных процессах, которые сопутствуют тяжело протекающим заболеваниям, таким как cиндром системной воспалительной реакции и органной недостаточности, сепсис, атеросклероз, а также сопровождаются индукцией соответствующей формы NO-синтазы и развитием оксидативного стресса, введение аргинина может не только не оказать терапевтического действия на больного, но даже ухудшить его состояние за счет гиперпродукции пероксинитрита и других токсичных реактивных форм азота [5,26]
В большинстве работ, в которых исследовали in vivo влияние аргинина, о синтезе NO судили по косвенным показателям. В настоящей работе нами c помощью метода ЭПР проведено прямое количественное определение интенсивности образования NO в печени крыс, а также исследовано количество стабильных метаболитов оксида азота ( NO2-и NO3-) в сыворотке крови и моче.
Материалы и методы. Исследования проводили на 36 крысах линии Вистар массой 230-250 г. За неделю до начала экспериментов из рациона питания животных были исключены овощи для уменьшения нитритно-нитратной нагрузки. Проведено 3 серии экспериментов (в каждой группе – по 6 крыс).
В качестве экзогенного источника аргинина использовали 4,2% раствор аргинина гидрохлорида, предоставленный фармацевтическим предприятием «Юрия Фарм» (Украина).
Эксперимент №1: контрольная группа - крысам внутрибрюшинно вводили 2 мл физ.раствора, опытная группа – внутрибрюшинно вводили 4,2% раствор аргинина гидрохлорида из расчета 8 мл/кг массы тела (L-аргинин – 336 мг/кг). Сразу после введения животные были посажены в мочесборные камеры на 1 сутки. В суточной моче определяли диурез, содержание нитритов, нитратов и креатина.
Эксперимент №2: контрольная группа: внутрибрюшинно вводили 2 мл физ. раствора; опытная группа - внутрибрюшинно вводили 4,2% раствор аргинина гидрохлорида из расчета 8 мл/кг массы тела (L-аргинин – 336 мг/кг). Через 2 ч после введения животных декапитировали, отбирали образцы крови и ткани печени. В сыворотке крови определяли содержание нитритов, нитратов и креатина. Образцы ткани печени замораживали в жидком азоте и проводили ЭПР-спектроскопическое исследование для определения концентрации NO в нитрозильных комплексах.
Эксперимент №3. Для прямого количественного определения интенсивности образования NO в тканях органов использовали ловушку NO: за 30 минут до забоя внутрибрюшинно вводили 2,5 мл водного раствора диэтилдитиокарбомата натрия (ДТК) из расчета 500 мг/кг массы тела и подкожно - раствор цитрата двухвалентного железа (сульфат железа 37,5 мг/кг + цитрат натрия 187,5 мг/кг); контрольная группа – вводили ловушку NO (как описано выше), опытная группа: -внутрибрюшинно вводили 4,2% раствор аргинина гидрохлорида из расчета 8 мл/кг массы тела (L-аргинин – 336 мг/кг).Через 1,5 ч животным опытной группы вводили ловушку NO и через 30 мин декапитировали. Образцы ткани печени замораживали в жидком азоте и проводили ЭПР-спектроскопическое исследование для определения NO, захваченного ловушкой.
Спектр ЭПР регистрировали на радиоспектрометре “Varian E 109” (США) при температуре жидкого азота. Осаждение белка в сыворотке крови и моче проводили путем добавления к 2 мл образца 0,5 мл насыщенного Ва(ОН)2 и 0,2 мл 20% ZnSO4 и удаления сформировавшегося осадка центрифугированием.
При определении нитрита к 200 мкл исследуемого образца добавляли 20 мкл конц. НСL и 20 мкл 37,5 мМ водного раствора сульфаниловой кислоты. Через 3 мин добавляли 20 мкл 0,1%-ного водного раствора н-1-нафтилэтилендиаминдигидрохлорида (NED). Через 40 мин измеряли оптическую плотность при 540 нм.
Для определения нитрата его восстанавливали в нитрит путем пропускания проб через кадмиевые колонки (0,5 Х 2,5-3,0 см). Скорость эллюирования не превышала 3-5 см3/мин. Восстановительная способность кадмиевых колонок, определяемая с использованием стандартного раствора нитрата, составляла более 90% и учитывалась при расчетах. Подготовка колонок к работе включала последовательную промывку (по 3 мл) водой и аммиачным буфером рН 9,8 (указать молярность). Затем в колонки последовательно вносили 1 мл исследуемого р-ра образца, 0,25 мл аммиачного буфера рН 9,8 (такой же молярности ?) и 0,75 мл дист. воды. В эллюате определяли содержание нитрита.
Креатинин в образцах сыворотки и мочи определяли по реакции с пикриновой кислотой с использованием набора реактивов «Фелисит».
Статистический анализ данных проводили по t-критерию Стъюдента.
Результаты и их обсуждение. После введения крысам раствора аргинина суммарное содержание нитритов и нитратов в сыворотке крови и моче увеличилось соответственно в 1,6 и 2 раза (табл. 1). Содержание нитратов и нитритов в исследуемых образцах контрольных животных связано в большей степени с поступлением этих соединений с едой, однако значительное увеличение их количества после введения аргинина свидетельствует об интенсификации эндогенного синтеза NO.
Для прямого количественного определения скорости образования NO в организме была введена ловушка NO - комплекс ДТК-Fe2+. Ловушка способна накапливаться в тканях и связывать как свободный NO, так и перехватывать его с эндогенных нитрозильных комплексов. При этом образуется мононитрозильный комплекс ДТК-Fe2+-NO с характерным триплетным сигналом ЭПР (gII=2,04, g┴= 2,02, gср=2,03, рис.1). В отличие от эндогенных комплексов NO, комплекс «ловушка- NO» стабильный в биологической среде при действии кислорода и других окислителей. Поэтому интенсивность соответствующего сигнала ЭПР характеризует интенсивность синтеза NO в тканях. Под действием препарата «Тивортин» количество NO, зафиксированного ловушкой в ткани печени за 1 час, увеличилось на 26% (табл.2). При количественной оценке интенсивность образования NO составил 0,87 и 1,1 мкмоль/(г·час) соответственно у контрольных и опытных животных. Полагается, что концентрация NO в тканях контрольных животных находится на уровне сотни нмоль. Сравнительно большое количество NO, зарегистрированное в ткани печени интактных животных, объясняются действием значительного количества введенного двухвалентного железа, необходимого для достижения требуемой концентрации ловушки в тканях. Если учесть это влияние, то скорость образования NO в печени крыс под действием препарата «Тивортин» оценивается как 0,3 мкмоль/(г·час), что приблизительно в 2 раза больше, чем у интактных животных.
Введение препарата, содержащего L-аргинин, на 13% усиливается сигнал ЭПР митохондриальных свободных радикалов и на 60% сигнал Mn2+-центров в печени, что указывает на усиление электроннотранспортных процессов. Увеличивается на 30% интенсивность сигнала Cu2+-центров (каталитические центры фермента супероксиддизмутазы), что свидетельствует об усилении антирадикальных процессов.
Выводы
1. Введение крысам препарата «Тивортин», содержащего L-аргинин, приводит к усилению образования оксида азота в организме, что сопровождается увеличением образования NO в ткани печени, а также суммарного содержания его стабильных метаболитов (NO2- и NO3-) в плазме крови и моче.
2. По данным ЭПР-спектроскопии введение крысам препарата «Тивортин» усиливает функциональную активность митохондрий.
ЛИТЕРАТУРА
1
Дмитренко Н.П., Холиан А. Роль взаимодействия путей метаболизма формальдегида и оксида азота в механизме их токсического действия.ΙΙ. Токсическое действие оксида азота// Укр. биохим. журн.- 2005.-77, № 5.-С.5-26.
2
Северина И.С., Пятакова Н.В., Щеголев А.Ю. Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы полиаминами // Биомед. Химия.-2007.-53.-вып. 1.- С. 44-55
3
Степанов Ю.М., Кононов И.Н., Журбина А.И., Филиппова А.Ю. Аргинин в медицинской практике (Обзор литературы)// Журн. АМН України.- 2004.- 10, № 2.- С.339―351
4
Abdelhamed A. I., Reis S. E. ,Sane D. C., Brosnihan K. B., Preli R. B., Herrington D. M. NO effect of an L-arginine-enriched medical food (HeartBars) on endothelial function and platelet aggregation in subjects with hypercholesterolemia // American Heart Journal. - 2003.-145, N 3.- P. E15
5
Abumrad N. N., Barbul A. The use of arginine in clinical practice in «Metabolic and Therapeutic Aspects of Amino Acids in Clinical Nutrition» Cynober L. A. Eds., CRC Press Boca Raton, FL.- 2004.- P.595-611
6
AXIS LABS performance driven nutrition [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.axislabs.net/p-NE201.htm.
7
Beaumier L., Castillo L., Yu Y.-M., Ajami A. M., Young V. R. Arginine: New and exciting developments for an "old" amino acid // Biomed. Environ. Sci.-1996, № 2-3.- Р.296-315
8
Blum A., Hathaway L., Mincemoyer R., Schenke W.H., Kirby M., Csako G., Waclawiw M.A., Panza J.A., Cannon R.O. Effects of oral L-arginine on endothelium-dependent vasodilation and markers of inflammation in healthy postmenopausal women// J. Am. Coll. Cardiol.- 2000.-35, N2.- P.271-276
9
Bode-Böger S.M. Effect of L-arginine supplementation on NO production in man// Europ. J. Clin. Pharm.- 2006.-62, N 1.- P.91-99
10
Bode-Boger S.M., Scalera F., Ignarro L.J. The l-arginine paradox: Importance of the l-arginine/asymmetrical dimethylarginine ratio// Pharmacol. Ther.- 2007.-114, N 3.- P.295-306
11
Böger R. The Pharmacodynamics of L-Arginine//J. Nutr.-2007.- 137.-P.- 1650S-1655S
12
Brosnan M.E., Brosnan J.T. Renal arginine metabolism // J. Nutr.-2004.-134, N 10.- P.2791S-2795S.
13
Collier S. R., Casey D. P., Kanaley J. A. Growth hormone responses to varying doses of oral arginine// Growth horm. IGF res.-2005.- 15, N 2.- P.136-139
14
Hayashi T., Juliet P.A.R., Matsui-Hirai H., Miyazaki A., Fukatsu A., Funami J. , Iguchi A., Ignarro L. J. L-Citrulline and L-arginine supplementation retards the progression of high-cholesterol-diet-induced atherosclerosis in rabbits //Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.- 2005.- 102, N 38.- P.13681-13686
15
Down-regulation of intestinal arginine absorption in proliferating crypt cells in acidosis [Электронный ресурс] / Karinch, Choudry H.A., Meng Q., A. Karinch M., Lin C., Vary T. C., Souba W. W., Pan M.// JPEN: Journal of Parenteral and Enteral Nutrition.- Jan/Feb 2004.- Режим доступа к журн.: http://findarticles.com/p/articles/mi_qa3762/is_200401/
ai_n9348091
16
Loscalzo J. Adverse Effects of Supplemental L-Arginine in Atherosclerosis // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.-2003.- 23, N 1.- P.3-5
17
Luiking Y. C., Poeze M., Ramsay G., Deutz N.E. The Role of Arginine in Infection and Sepsis //J. Parent. and Enter. Nutrit.-2005.-29, No 1.- P.S70-S74
18
Mansoor J. K., Morrissey B. M., Walby W. F., Yoneda K. Y., Juarez M., Kajekar R., Severinghaus J. W., Eldridge M. W., Schelegle E. S.. L-Arginine supplementation enhances exhaled NO, breath condensate VEGF, and headache at 4342 m. High Alt. Med. Biol.-2005.- 6, N 4.- P.289–300
19
Ohtsuka Y., Nakaya J. Effect of oral administration of L-arginine on senile dementia // Am. J. Med.-2000.- 108, N 5.- P.439.
20
Reis D.J., Regunathan S. Isagmatineanovelneurotransmitterinbrain?// Trends Pharmacol. Sci.- 2000.-21, N 5.- P.187-193
21
Ścibior D., Czeczot H. Arginine--metabolism and functions in the human organism// Postepy Hig. Med. Dosw. - 2004.-58.- P.321-332
22
Sidney M. M. Jr. Enzymes of Arginine Metabolism // J. Nutr.- 2004.- 134, N 10.- P-2743S-2747S
23
Stechmiller J.K., Childress B., Porter T. Arginine immunonutrition in critically ill patients: a clinical dilemma// Am. J. Crit. Care.- 2004.- 13, N 1.- P.17-23
24
Tsao P.S., Theilmeier G., Singer A.H., Leung L.L., Cooke J.P. L-arginine attenuates platelet reactivity in hypercholesterolemic rabbits// Arterioscler Thromb.- 1994.-14.- Р.1529–1533
25
Witte M.B., Barbul A. Arginine physiology and its implication for wound healing// Wound Rep. Reg.-2003.- 11, N 6.- P.- 419-23
26
Yu Y.M., Burke J.F., Tompkins R.G., Martin R., Young V.R. Quantitative aspects of interorgan relationships among arginine and citrulline metabolism// Am. J. Physiol.-1996.-271, N 6, Pt 1.- P. E1098-1109
Рис.1. Сигнал ЭПР мононитрозильного комплекса ДТК-Fe2+-NO в ткани печени крыс.
Табл. 1. Содержание нитритов и нитратов (суммарно), креатина в моче и сыворотке крови крыс при действии препарата «Тивортин».
Группы животных
Сыворотка крови
Суточная моча
(NO2+NO3) мкг/мл
Креатинин
мг/мл
(NO2+NO3)
/креатин
·10-3
(NO2+NO3)·диурез,
мкг
Креатинин
мг/мл
(NO2+NO3)
/креатин
·10-3 , 1/мл
Контроль (группа1)
3,13+,18
9,22+0,37
0,34+0,02
80,3+4,0
1,31+0,11
62+5
L-Аргинин (группа 2)
5,00+0,63*
8,77+0,40
0,57+0,03*
157+32*
1,30+0,12
121+11*
Прим.: *- статистически достоверные различия в сравнении с контрольной группой (p<0,05)
Табл.2. Результаты ЭПР-исследования образцов ткани печени крыс
Параметры, отн.ед.
Группы животных
Контроль
L-Аргинин
Ловушка-NO
1+0,18
1,26+0,18*
Цитохром Р-450
1+0,07
0,97+0,13
Mn2+-центры
1+0,08
1,6+0,29*
Cu2+-центры
1+0,17
1,31+0,11*
Митох. Q-своб.радикалы
1+0,08
1,13+0,04*
Mo+7-центры
1+0,26
1,12+0,19
Митох. ЖСЦ
1+0,04
0,93+0,09
Прим.: *- статистически достоверные различия в сравнении с контрольной группой (p<0,05)
Аргинин: биологическое действие, влияние на синтез оксида азота
Дмитренко Н.П., к.б.н. Кишко Т.О., Шандренко С.Г.
Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И.Медведя МОЗ Украины
Проведен обзор механизмов биологического действия аргинина. Исследовано влияние препарата “Тивортин”, содержащего L-аргинин, на эндогенный синтез NO. Установлено, что перитониальная инъекция крысам раствора препарата приводит к усилению образования NO в организме, что сопровождается увеличением содержания нитритов и нитратов в моче и крови. По данным ЭПР-спектроскопии увеличивается содержание NO в ткани печени, усиливается функциональная активность митохондрий.
АРГІНІН: БІОЛОГІЧНА ДІЯ, ВПЛИВ НА СИНТЕЗ ОКСИДА АЗОТУ.
Дмитренко М.П., к.б.н. Кішко Т.О., Шандренко С.Г.
Інститут екогігієни та токсикологии ім. Л.І.Медведя МОЗ України.
Проведено огляд механізмів біологічної дії аргініну. Досліджено вплив препарату “Тівортін”, який містить L-аргінін, на ендогенний синтез NO. Встановлено, що перитоніальна ін'єкція щурам розчину препарату призводить до підсилення утворення NO в організмі, що супроводжується підвищенням рівня нітритів та нітратів в сечі та крові. За даними ЕПР-спектроскопії збільшується вміст NO в тканині печінки, підсилюється функціональна активність мітохондрій.
ARGININE: BIOLOGICAL EFFECT, INFLUENCE ON NITRIC OXIDE SYNTHESIS
Dmitrenko M.P., Kishko T.O., Shandrenko S.G.
Medved's Institute of ecohygiene and toxicology.
Arginine biological effect was reviewed. “Tivortine” medication influence on endogenous NO synthesis has been investigated on the rats experiment. Peritoneal injection of the medication leads to NO synthesis intensification, that was determined with the increasing level of nitrite and nitrate in urine and blood samples. The increasing NO level in liver tissues and the mitochondrial functional activity intensification have been revealed by EPR investigation.
