2. 2
Tujuan isolasi
Pengertian, prinsip dan hasil
Prosedur kerja isolasi
Memelihara biakan murni
3
Di alam berbagai jenismikroba hidup ‘bersama’
dalam komunitas– jarang sekali suatu jenis mikroba
hidupsendirian, tetapi selalu hidupdalam
campuran populasi
untuk dapat mempelajari mikroba khususnya dalam
laboratorium, diperlukan suatu biakan mikroba
yang dibutuhkan tanpa kontaminasi dari mikroba
lain ‐ biakan murni
3. 3
Cara untuk memindahkan mikroba tertentu dari
lingkungannya, dan menumbuhkannya dalam suatu
medium buatan
Prinsip: memisahkan satu jenis mikroba dari
komunitasnya, yang terdiri dari campuran bermacam‐
macam mikroba
Hasil: kultur murni atau biakan murni
Biakan murni adalah kumpulan individu mikroba yang
berasal dari pembiakan suatu individu (sel) dengan
jenis (gen) dan karakter yang sama.
Secara prinsip metode ini dimulai dengan
menyiapkan medium pertumbuhan berupa
lempeng agar pada Petri dish
Sebelum di tanam pada lempeng agar populasi sel
mikroba dijarangkan (misalnya dengan teknik
pengenceran sedemikian rupa), sehingga individu
sel mikroba dapat tumbuh menjadi koloni terpisah
satu dengan lainnya.
Memilih koloni‐koloni yang terpisah untuk
dipindahkan ke medium pertumbuhan yang baru.
4. 4
Sampel yang terdiri atas berbagai campuran
sel mikroba
Sel-sel dijarangkan melalui pengenceran
atau penebaran pada medium agar
Inkubasi
Sel berkembang biak menjadi banyak sel
Mikroba menjadi dapat dilihat dengan mata
telanjang dalam bentuk koloni yang dapat
dipisahkan I dipindahkan ke medium baru
1. Pengambilan sampel
2. Pengenceran
3. Penanaman
4. Pemisahan
5. Identifikasi
6. Kultivasi
5. 5
Komunitas mikroba dapat ditemukan di berbagai habitat:
tanah, air, udara bahkan pada atau dalam tubuh mahluk
hidup yang lain
Sumber: berbagai bahan (padat atau cair): tanah, air,
tanaman atau pangan
Diambil secukupnya dan ditempatkan dalam wadah yang
sudah disterilisasi
Diberi label yang jelas dan keterangan tentang tempat,
waktu, sumber dan keterangan lainnya
Disimpan dalam kontainer khusus yang meminimalisasi
kegiatan lanjut dari mikroba di dalam bahan sampel
Teknik serial dilutions (pengenceran berseri atau
bertingkat)
Diperlukan untuk memperjarangjumlah individu
(sel, spora, organ lainnya) dari mikroba dalam
bahan yang akan ditanam
Dasar melakukan pengenceran adalahmenurunkan
kerapatan sel mikroba sehingga pada suatu saat
hanya ditemukan satu sel di dalam tabung
7. 7
Cara ini tidak menggunakanlempeng agar
tetapi membiarkanmedia agar tetap cair yaitu
pada suhu 45oC sebelum digunakan
Secara aseptik suspensi inokulum hasil
pengenceran diteteskan ke dalam petri
kosong, diikuti penuangan media agar cair
yang sudah disiapkan, dicampur merata
dengan cara memutar petri secara mendatar
sampai media agar mengeras, dan selanjutnya
diinkubasikan
8. 8
Tujuan utamadari penggoresan ini adalah untuk
mendapatkankoloni‐koloni bakteri yang terpisah‐pisah
dengan baik
Dengan jarumOse diambil inokulum kemudian digoreskan
berulang pada permukaanlempeng agar dalam cawan petri
dengan berbagai arah/cara.
Dengan penggoresan yang sempurnaakan dihasilkan koloni
yang terpisah‐pisah
9. 9
Setetes inokulum diletakkan di permukaanlempeng agar
dalam cawan petri, dan
dengan menggunakanbatang kaca yang bengkok (trigaldsky)
dan steril disebarkan merata di permukaanmedium
diinkubasikan
10. 10
Setelah masa inkubasi (2‐3 hari) banyak koloni
yang tumbuh, ada yang berhimpitan ada yang
terpisah‐pisah
Dengan loop atau jarum ent ambil satu koloni
yang terpisah dan encerkan dalam tabung
berisi air steril, campur secara merata,
kemudian ditanam kembali dalam medium
yang baru
Langkah ini diulang dua atau tiga kali sampai
didapatkan biakan yang murni
Amati sifat dan karakteristik koloni dan sel biakan murni,
CATAT dengan TELITI
Bandingkan dengan ciri‐ciri mikroba yang terdapat pada
BUKU PEDOMAN BAKU
Beri label nama dan keterangan lain yang diperlukan.
Biakan murni sudah dapat dipergunakan bagi pekerjaan
lanjutannya.
11. 11
21
Setelah tahap identifikasi akan diperoleh –
BIAKAN INDUK (PRIMARY CULTURE)
1. DISIMPAN
2. DIGUNAKAN
Jika dipergunakan untuk keperluan kajian dan
lainnya, dari biakan induk diturunkan –
BIAKAN TURUNAN (SUB‐CULTURE)
22
12. 12
Tujuan kultivasi atau pembiakan yang utama adalah
memperbanyak inokulum.
Kultivasi dilakukandengan cara memidahkan
sedikit inokulumyang berasal dari biakan induk ke
dalam medium tumbuhsteril (padat atau cair) yang
ditempatkan pada suatu wadah misalnya cawan‐
Petri, botol, tabung reaksi atau lainnya, yang
disesuaikan dengan tujuan pembiakan.
23
1. Simpan pada suhu rendah – mengurangi aktifitas
metabolisme
2. Liofilisasi
o Dibekukan secara cepat – pada media susu kering + CO2 – ampul –
simpan pada suhu rendah
3. Diremajakan secara reguler
24
13. 13
1. Arti pertumbuhan
2. Kurva pertumbuhan
3. Waktu generasi
4. Mengukur pertumbuhan
5. Sistem penumbuhan mikroba
25
Pertumbuahan secara umum dapat didefinisikan sebagai
pertambahan secara teratur semua komponen di dalam sel hidup.
Tumbuh ‐ bertambahnya ukuran (size): panjang, luas, volume, berat
maupun kandungan bahan tertentu pada suatu individu,
Kembang ‐ bertambahnya kuantitas: jumlahatau kerapatan sel atau
individu dalampopulasi
26
14. 14
1. berdimensisatu, misalnya: pertambahan panjang, diameter, jari‐jari, dan
jumlah sel.
2. berdimensi dua, misalnya: pertambahanluas,
3. berdimensi tiga, misalnya: pertambahan volume, berat segar, berat kering.
Pertumbuhan juga meliputi:
1. Pertambahan komponen seluler,
misalnya: RNA, DNA, dan protein dan
2. Peningkatan kegiatan metabolismesecaralangsung, misalnya:
kebutuhanO2, CO2, dan lainnya.
27
Pada organisme uniseluler ‐‐ pertambahan jumlah
sel, yang juga berarti pertambahan jumlah
organisme yang membentuk koloni atau suatu
biakan
Pada organisme multiseluler ‐‐ peningkatan jumlah
sel per organisme, dimana ukuran organisme
menjadi lebih besar, panjang atau berat
16. 16
1. Pada jamur yang multiseluler, terdapat
pertumbuhan yang menambah ukuran massa,
volume tubuh atau jumlah komponen sel-
pembelahan filamentus.
2.Pembelahan atau pertumbuhan filamentus–
PERTUMBUHAN UJUNG - TERJADI PADA
sel tubulus, yaitu pada UJUNG HIFA
hasil pembelahan tidak terpisah melainkan
tetap menjadi bagian utuh dari organ itu
Akibat bertambahnya jumlah sel – individu ‐
perkembangan populasi
Satu sel tumbuh (sampai ukuran tertentu) – membelah –
membelah ‐‐‐ membentuk koloni: dengan jumlah individu
sel yang berlipat
Contoh: bakteri dan khamir
Sel tumbuh dan kemudian membelah ‘biner’
▪ 1 2 4 8 16 32 64 ……… Dst
▪ 20
21 22 23 24 25 26
32
17. 17
PEMBELAHAN SEL – Reproduksi Sel Uniseluler
1. Terdapat 2 jenis pembelahan sel yaitu pembelahan
biner dan pertunasan (budding).
2. Pembelahan biner adalah pembelahan yang
menghasilkan 2 sel sama besar,
3. Pertunasan adalah pembelahan yang menghasilkan
2 sel yang tidak sama besar (sel yang besar disebut
induk dan sel yang kecil disebut anak).
Bakteri, khamir atau mikroba uniseluler
lainnya
1. Ditumbuhkan dalam suatu medium yang
terbatas sampai waktu tertentu (kultur sistem
tertutup)
2. Jumlah sel diukur secara reguler
3. Hasil pengukuran digambar sebagai grafik
hubungan waktu dengan populasi sel
4. Diperoleh – kurva pertumbuhan
34
19. 19
37
1. Fase lamban – Lag Phase (a)
Tidak/belum ada pertumbuhan
Ukuran sel bertambah
Berapa lama?
Kondisi sel saat ditanam/diinokulasikan
Lingkungan medium sebelumnya
Jumlah sel hidup
38
20. 20
2. Fase logaritmik – Exponential Phase (b,c)
o Jumlah sel meningkat cepat – hasil pembelahanbiner
o Waktu generasi pendek
o Aktivitas metabolismekonstan
o Keadaan pertumbuhan seimbang
3. Fase tetap – Static / Stationary Phase (d,e)
Kecepatan tumbuh mendekali nol
Jumlah sel tetap, seimbangantara yang baru dan yang
mati
Akibat: kompetisi – nutrien terbatas
39
4. Fase kematian – Lethal Phase (f)
Jumlah sel hidup sangat menurun, sel mati
meningkat cepat‐ exponential
Penyebab:
▪ Nutrien habis
▪ Senyawa toksik – hasil metabolisme bertambah
banyak
▪ Enzim otolitik – bunuh diri (?)
40
21. 21
41
1. Faktor internal – species
Sifat toleransiterhadap lingkungan baru
Kebutuhan nutrisi
Daya reproduksi
2. Faktor eksternal
Lingkunganfisik dan kimia
Komposisinutrisi medium
Faktor biotik
Kompetisi inter dan intra‐species
42
22. 22
Waktu yang dibutuhkan untuk sel membelah
diri, atau populasi bertambah – dua kali lipat
– doubling time
Berbeda antar species mikroba
• Escherichia coli – 17 menit
• Bacillus megaterium– 35 menit
• Rhizobium meliloti– 108 menit
• Saccharomycescerevisiae – 2 jam
• Treponema pallidum – 34 jam
43
Dari hasil pembelahan sel secara biner:
• 1 sel menjadi 2 sel
• 2 sel menjadi 4 sel 21 menjadi 22 atau 2x2
• 4 sel menjadi 8 sel 22
menjadi 2
3
atau 2x2x2
Dari hal tersebut dapat dirumuskan menjadi:
44
N: jumlah sel akhir,
N0: jumlah sel awal,
n: jumlah generasi
N = N0 2n
23. 23
• pada generasike‐1 N1 = N0 x 21
• pada generasike‐2 N2 = N0 x 22
• pada generasike‐3 N3 = N0 x 23
• …………………………….
• pada generasike‐n N = N0 x 2n
log N = log N0 + n log 2
n log 2 = log N – log No
WaktuGenerasi G
t= waktu pemeliharaan
45
0.301
)
N
Log
-
N
(Log
n
2
Log
)
N
Log
-
N
(Log
n
0
0
0
N
Log
-
N
Log
x t
0.301
G
n
t
G
JAMUR – koloni
1. Diameter
2. Bobot biomas
3. Analisiskimia
1) Khitin
2) Asam lemak
3) CO2
4) nitrogen
46
24. 24
A. TOTAL SEL
1. Mikroskopik – acara praktikum
1) Cara BREED
2) Cara PETROFF‐HAUSER
Haemositometer
2. Turbidimeter – sel dalam suspensi
1) Kalorimeter
2) Spektrofotometer
3) Nefalometer
B. SEL HIDUP – diencerkan – ditumbuhkan
1. Plate count
2. Filtration
3. Most Probable Number (MPN)
47
Breed’s Method
Contoh:
1. Larutan susu yang mengandungbakteri
2. Ambil secara aseptik 0.1 ml
3. contoh disebar di daerah slide (gelas benda) ‐ 1 cm2. –
kering‐anginkan
4. Staining – preparat diberikancat bakteri – proses
5. Amati di bawah mikroskopperbesarankuat
6. Hitung jumlahbakteri yang teramati
7. Ekstrapolasikanuntuk menghitungjumlah total bakteri
dalam bahan
48
26. 26
Dasarnya: semakin turbid (keruh) semakin banyak sel
Terhitung juga sel yang mati.
Perhitungan berdasarkan % transmisi cahaya yang
menembus, contoh melalui photoelectric cells.
Juga tertulis dalam bentuk ekspresi logaritme absorbansi
(optical density atau OD).
Sewaktu sel dalam fase pertumbuhan logaritme, plot
absorbansi menunjukkan garis lurus.
Alat yang digunakan untuk mengukur jumlah sel disebut
SPEKTROFOTOMETER atau KOLORIMETER,
NEFALOMETER.
51
a. No turbidity = < 107 cells/ml
b. Slight = 107 – 108 cells/ml
c. High = 108 – 109 cells/ml
d. Very High = > 109 cells/ml
27. 27
Suatu metode statistikauntuk menghitung jumlah sel dari
suatu contoh.
Dasarnya: semakin besar jumlah sel semakin sering
pengenceran diperlukan untuk menurunkan densitas sampai
tidak lebih daripada 1 sel untuk setiap contoh yang diukur.
Butuh beberapa tabung dengan mediayang diperlukan
Dihitung jumlah tabung yang menunjukkan adanya
pertumbuhan, kemudian dicocokkan dengan tabel yang
tersedia.
MPN hanya menyatakan 95% kemungkinan bahwa populasi
terletak pada kisaran tertentu.
53
Filtrasi digunakan untuk sterilisasi bahan tidak tahan panas, seperti
beberapa media kultur, enzim, vaksin, dan larutan antibiotik.
Saat ini filter membran terdiri dari bahan ester selulosa atau polimer
plastik.
Ukuran lubang filter dari 0.22‐0.45 μm ditujukan untuk menyaring
bakteri; dan 0.01 μm ditujukan untuk menyaring virus, bahkan untuk
beberapa protein besar.
54
