2. ЗМІСТОВИЙ МОДУЛЬ 2. «Технології
отримання ферментних препаратів»
Тема 6. ІММОБІЛІЗОВАНІ ФЕРМЕНТНІ
ПРЕПАРАТИ. Матеріали для іммобілізації
ферментів. Методи іммобілізації.
Застосування іммобілізованих ферментів.
Ферментні сенсори в медицині.
2
3. Причини неможливості широкого використання
існуючих ферментних препаратів в медицині:
• низька стабільність при зберіганні;
• швидка інактивація під впливом внутрішнього
середовища організму;
• сильні імунологічні реакції,
• висока вартість (за рахунок високого ступеня
очищення) і неможливість регенерації.
Ці недоліки можна усунути використовуючи
імобілізовані ферментні препарати.
3
4. Процес імобілізації біологічного матеріалу
визначається включенням біоселективних
молекул до ізольованої фази, яка відокремлена від
фази вільного розчину, але яка може
обмінюватися з нею молекулами субстратів,
продуктів, ефекторів або інгібіторів.
1. Історія технології імобілізації ферментів
• 1916 рік - Нельсон Дж. і Грифін Є. показали, що
інвертаза, адсорбована на вугіллі, зберігає свою
каталітичну активність;
• 1939 рік - Пфанмюллер Дж. і Шлейх Г. отримали
перший патент на застосування адсорбованих на
дерев'яній стружці протеолітичних ферментів для
обробки шкір.
4
5. • 1949 рік - Майкл і Юерс використали азидну
похідну сполуки карбоксиметилцелюлози для
імобілізації низки білків;
• 1954 рік - Грубховер Н. і Шляйт Д.
запропонували діазопохідні поліаміностиролу для
імобілізації пепсину, амілази й карбоксипептидази.
У середині 1960-х р. були опубліковані перші праці
з аналітичного застосування імобілізованих
ферментів.
5
6. Імобілізовані ферменти у порівнянні із звичайними
мають низку істотних переваг:
• гетерогенний каталізатор (фермент) можна
легко відокремити від реакційного середовища,
що дає змогу зупинити в необхідний момент
реакцію, застосувати його повторно та
отримати чистий продукт, не забруднений
ферментом;
• використання імобілізованих каталізаторів
робить можливим проведення ферментативного
процесу безперервно, наприклад у проточному
реакторі, і регулювання швидкості каталізованої
реакції та виходу продукту зміною швидкості
протоку;
6
7. • імобілізація ферментів дає можливість
регулювати їх каталітичну активність,
змінюючи властивості носія під впливом деяких
фізичних чинників, таких як світло, звук, тощо;
• імобілізація та/чи модифікація ферментів
полегшує цілеспрямовану зміну властивостей
каталізатора, включаючи специфічність,
залежність каталітичної активності від рН,
іонного складу та інших параметрів середовища.
7
8. 2. Матеріали, що використовуються для
імобілізації ферментів
Матеріали, що використовуються для імобілізації
ферментів, повинні мати наступні властивості:
нерозчинність, висока хімічна і біологічна
стійкість, значна гідрофільність, проникність
для кофакторів, субстратів та продуктів реакції.
Жоден із відомих носіїв не відповідає в повному
обсязі цим вимогам. Але існує досить значна
кількість носіїв придатних для імобілізації певних
ензимів в конкретних умовах. За походженням
носії поділяють на: органічні і неорганічні.
Імобілізацію на полімерних носіях поділяють на
природні та синтетичні.
8
9. Серед природних полімерів виділяють: білкові,
полісахаридні та ліпідні носії.
Переваги: доступність, поліфункціональність і
гідрофільність.
Недоліки – висока вартість та швидка біодеградація.
З полісахаридів для імобілізації найчастіше
використовують целюлозу, декстран, агарозу та їх
похідні.
Серед білків практичне значення в якості носіїв
ферментів мають структурні білки, а саме
кератин, колаген і продукт переробки колагену –
желатина.
9
10. Серед синтетичних носіїв виділяють поліметиленові,
поліамідні і поліефірні. Найпоширенішими є
полімери на основі стиролу, акрилової кислоти,
полівінілового спирту. Більшість синтетичних
полімерів мають достатню міцність і можуть бути
виготовлені в різних фізичних формах (труби,
волокна, гранули).
В якості носіїв неорганічної природи, які часто
використовують для адсорбції ферментів: оксид
алюмінію, бентоніт, карбонат кальцію, гель
фосфату кальцію, вугілля, целюлоза, глина,
колаген, конканавалін А-сефароза, пористе скло,
гідроксиапатит, каолін,, силікагель. Основна
перевага неорганічних носіїв – легкість регенерації.
10
11. Реагенти, які найчастіше застосовують при
імобілізації, – це багатофункціональні агенти
(глутаровий альдегід, гексаметилдіазоціанат), що
утворюють ковалентні зв'язки між
біокаталітичними частинками чи білками, а також
різні полімери (поліакриламід, поліфенол), які
формують структури, подібні до сітки для
захоплення та утримання біологічного матеріалу.
Використовують також органічні електропровідні
полімери. Їхньою перевагою є те, що під час
імобілізації біологічного об'єкта на електроді
утворюється поверхня, яка має електричний
контакт з металевим або вуглецевим провідником.
11
12. Такі полімери можна отримати в різних хімічних
процесах, а саме за реакцією Зиглера-Натта для
поліацетилену, одержання органометалевих
компонентів (політіофену), окиснення мономерів,
тощо.
Для додаткових зовнішніх мембран, що виконують
функції дифузійного контролю, механічного
захисту для зменшення впливу інтерферуючих
частинок, застосовують різні комерційні полімери:
полівінілхлорид, поліетилен, поліметакрилат,
нафіон, поліуретан.
12
13. 3. Методи імобілізації ферментів
Існують два принципово різних методи імобілізації
ферментів:
• без виникнення ковалентних зв’язків між
ферментом і носієм (фізичні методи імобілізації);
• з утворенням ковалентних зв’язків між ними
(хімічні методи імобілізації).
3.1. Фізичні методи імобілізації:
• адсорбція ферментів на нерозчинних носіях;
• імобілізація ферментів шляхом включення в гель;
• імобілізація ферментів в напівпроникні структури
(мікрокапсулювання та включення ферментів в
ліпосоми).
13
14. Найбільш простий фізичний метод імобілізації
ферментів - це адсорбція на нерозчинному носії.
Процедура імобілізації полягає у змішуванні за
певних умов ферменту та носія, інкубації та
відокремленні нерозчинного компоненту суміші від
розчинного центрифугуванням або фільтруванням.
Недолік методу - фермент може зв'язуватися з
носієм недостатньо міцно. Незначні зміни
експериментальних умов: рН, іонної сили,
температури та природи розчинника, – все це
може призвести до десорбції ферменту з носія.
Десорбцію ферменту може викликати також
субстрат.
14
15. У ідеальному випадку імобілізація ферментів не
повинна призводити до втрати каталітичної
активності. В цілому, адсорбція – м'який метод
імобілізації, який, як правило, слабко впливає на
каталітичну активність ферментів.
3.2. Хімічні методи імобілізації
Метод імобілізації ферментів за допомогою
ковалентного зв'язування заснований на утворенні
хімічного зв'язку між молекулами ферменту та
носія. При цьому важливо, щоб амінокислоти,
необхідні для проявлення каталітичної активності
ферментів, не брали участі в ковалентному
зв'язуванні з носієм.
15
16. Уникнути цього складно, тому ковалентна
імобілізація звичайно призводить до зниження
ферментативної активності. Цьому можна
запобігти, якщо проводити імобілізацію в
присутності субстрату, який захищає активний
центр.
Матеріали, які використовуються для ковалентної
імобілізації ферментів: агароза (сефароза),
целюлоза, декстрин (сефадекс), скло, сополімери
поліакриламіду, поліаміностирол.
Для ковалентного приєднання носій потрібно
попередньо активувати. Активований носій може
реагувати з певними групами молекули ферменту.
16
17. 3.2.1. Адсорбція за допомогою іонного зв'язування
з ДЕАЕ-(диетиламиноетил) та КМ
(карбоксиметил) –сефадексом
Перед адсорбцією сефадексу дають набрякнути у
відповідному водному буфері, а потім додають
фермент. Вибір буферу визначається
властивостями ферменту, який імобілізують.Як
приклад, інвертазу пекарських дріжджів можна
адсорбувати на аніонообміннику ДЕАЕ-сефадекс
А-50, якому попередньо дали набрякнути чи
врівноважитися в 10 мМ натрій-фосфатному
буфері, рН 7,0. Слід звернути увагу на те, що для
адсорбції ферментів потрібно використовувати
буферні розчини з низькою іонною силою.
17
18. 3.2.2. Адсорбція ферментів на афінних носіях
Носії афінного типу – це адсорбенти, які мають
спорідненість щодо групи близьких сполук. Вони
доступні у вигляді комерційних уже імобілізованих
препаратів, у яких вони ковалентно приєднані до
різних типів сефарози, яка представляє собою
сферичні частинки гелю агарози. Наприклад, ,
конканавалін А-сефароза представляє собою
конканавалін А (Кон А), зв'язаний із сефарозою 4В
бром ціановим методом. Може бути використана
для очистки глікопротеїнів, які містять ці сахариди.
Глікоферменти, які містять залишки маннози та
глюкози, можуть бути імобілізовані адсорбцією на
Кон А-сефарозі.
18
19. З іншими типами афінних носіїв слід ознайомитись
(Буценко Л.М., Пенчук Ю.М., Пирог Т.П. Технології
мікробного синтезу лікарських засобів. Навч.посіб.-
К.:НУХТ, 2010, стр. 200).
3.2.3. Ковалентне (хімічне) приєднання до
сефарози, целюлози та поліакриламіду
Прикладом такого методу імобілізації є ковалентне
приєднання целобіози до сефарози, яка
активована бромціаном (БЦ), та інвертази до
целюлози та поліакриламіду. Активація сефарози
заснована на реакції між БЦ і гідроксильними
групами носія. Утворювані в результаті цього
імідокарбонатні групи здатні реагувати з вільними
аміногрупами ферменту.
19
20. Приєднання інвертази до мікрокристалічної
целюлози засновано на активації природних носіїв
(наприклад, целюлози) солями перехідних металів
(наприклад, хлоридом титану), які доступні як
комерційні препарати. При імобілізація
біокаталізаторів необхідно звернути особливу
увагу на рівномірність суспендування комплексу
мікрокристалічна целюлоза-фермент перед
відбором проби для визначення активності.
Фермент, адсорбований на целюлозі та зв'язаний
із нею ковалентно, може бути видалений
промиванням комплексу буфером, який містить 1,0
М NaСl.
20
21. До поліакриламідних носіїв, доступним у вигляді
комерційних препаратів, належать носії типу
ензакрил. Вони представляють собою сополімери
акриламіду та різних похідних акриламіду
(наприклад, ензакрили АА та АН, які містять
ароматичні та гідразидні залишки відповідно).
Після активації вони здатні ковалентно зв'язувати
білки.
21
22. 3.2.4. Імобілізація біокаталізаторів
металохелатним методом
З метою проведення імобілізації швидко та в
достатньо звичайних умовах, можна
використовувати властивість перехідних металів
утворювати хєлатні комплекси. Хоча є широкий
вибір перехідних металів, найбільш підходящими
для даного випадку властивостями володіють
титан і цирконій, оксиди яких нетоксичні.
22
23. 3.2.5.Імобілізація ферментів включенням їх у гель
Недоліком попередніх методів імобілізації є необхід-
ність використання великої кількості каталізаторів.
Крім того, хімічна модифікація, якої зазнають
ферменти в процесі імобілізації, може небажаним
чином змінювати їх каталітичні та інші властивості.
З цієї причини клітини чи ферменти відділяють від
решти об'єму включенням у носій чи інкапсулюван-
ням. Каталізатор можна включати в полімерну
сітку, наприклад, поліакриламідного гелю чи гелю
альгінату кальцію, шляхом проведення
полімериза-ції чи реакції поперечного зшивання
гелю в присут-ності ферментів або клітин.
23
24. Схожими методами є інкапсулювання в ліпосоми,
нейлонові чи колодієві мембрани, а також їх
фізичне відмежування від інших компонентів у
апаратах для ультрафільтрації. Для полегшення
роботи з частин-ками, які містять каталізатор, їм
надають, як це можливо, сферичну форму.
Поліакриламід – носій, що частіше за інші
використовується для включення ферментів, – не
характеризується іонообмінними властивостями,
тому при імобілізації рН-профіль активності
ферменту практично не змінюється.
24
25. 3.2.6. Імобілізація ферментів шляхом
мікрокапсулювання
На відміну від інших методів імобілізації, розглянутих
вище, при мікрокапсулюванні головним є
утримання розчину, що оточує фермент, а не
створення фізичних і хімічних сил, необхідних для
імобілізації. Імобілізуються повністю вихідний
розчин, який містить фермент, а не окремі
молекули ферменту. При мікрокапсулюванні
використовують штучні капсули з мембранами,
подібними до мембран природних клітин.
25
26. За допомогою мембран здійснюється контроль
розмірів молекул, що потрапляють усередину
клітини чи тих, що виходять із неї. Великі
молекули, такі як ферменти та білки, утримуються
всередині мікро-капсули, тоді як малі молекули
субстрату та продукту можуть вільно дифундувати
через синтетичну мембрану. Однією з переваг
мікрокапсулювання перед рівномірним
включенням ферменту є велика площа поверхні,
що припадає на одиницю активності
імобілізованого ферменту, що дозволяє
використовувати високі концентрації ферменту у
вихідному розчині та досягати високої
ефективності дії імобілізованого ферменту.
26
27. Оскільки присутність у розчині ферменту не впливає
на процес утворення мембран, можна одночасно
мікрокапсулювати різні ферменти, клітини чи
біомолекули, що дозволяє здійснювати
багатостадійні реакції.
На сьогодні мікрокапсульовані продукти вже існують
у вигляді комерційних препаратів, причому їх
внутрішній вміст звичайно представляє собою чи
органічний розчинник, який містить олію чи
парфум, чи водне середовище, проте не проявляє
каталітичну активність.
27
28. Діаметр мікросфер може бути від декількох мікрон
до декількох тисяч мікрон, а товщина мембрани -
від сотень ангстрем до декількох мікрон. Можна
мікрокапсулювати в різних поєднаннях ферменти,
кофактори з відповідними ферментами для їх
регенерації, білки, цілі клітини, іонообмінні смоли,
частинки активованого вугілля та магнітні
частинки. Можливе включення маленьких
мікрокапсул у великі (наприклад, маленькі
мікросфери, які містять каталазу, включені у великі
мікросфери з мембраною із бутадієнового каучуку).
28
29. При інкапсулюванні ферменти стикаються з
органічним розчинником і мономерами, які можуть
їх легко денатурувати. Для того, щоб захистити
фермент від інактивації, перед
мікрокапсулюванням його звичайно змішують з
полімерами, такими як бичачий сироватковий
альбумін (БСА), гемоглобін або поліетиленімін
(ПЕІ). Концентрація емульгатора, що
використовується для утворення мікросфер у
органічному розчиннику, також помітно впливає на
збереження активності ферменту. Активність
мікрокапсульованої аргінази швидко спадає до
нуля при зниженні концентрації емульгатора від
0,1 до 0,01% (за об'ємом).
29
30. 4.Застосування імобілізованих ферментних
препаратів
Імобілізовані ферменти можуть використовуватися
як лікарські препарати для лікування
захворювань, для діагностики захворювань та для
створення специфічних медичних матеріалів.
Імобілізація лікарських препаратів має за мету:
1) пролонгація їхньої дії;
2) посилення терапевтичної дії;
3) надання нових властивостей лікарській речовині
(наприклад, здатність індукувати інтерферон).
30
31. В медицині можуть також використовуватися
імобілізовані поліферментні системи. Вони
складаються з двох чи декількох ферментів, які
закріплено на одному носії, і взаємодіють таким
чином, що продукт однієї ферментативної реакції є
субстратом для наступної.
31
32. Визначати пеніцилін в біологічних рідинах можна
за допомогою імобілізованої пеніцилінази. Метод
базується на гідролізі пеніциліну пеніциліназою,
що ковалентно зв’язана із пористим склом. При
цьому утворюється пеніциланова кислота, яка
визначається потенціометрично. За використання
колонок з імобілізованим ферментом в інтервалі
концентрацій пеніциліну 0,08 – 0,50 ммоль
спостерігається лінійна залежність між показами
потенціометру і вмістом антибіотика в
досліджуваному розчині. Система є стабільною
протягом 8 місяців при 5°С.
32
33. В сучасній хірургії нині використовуються
синтетичні матеріали, до яких висуваються вимоги
високої механічної міцності, еластичності та
можливості включення в поверхневий шар
біологічно активних молекул (антикоагулянтів,
ферментів, антисептиків). Включення лікарських
засобів в поверхневі шари медичних матеріалів
успішно здійснюється шляхом їх імобілізації на
поверхнях штучних протезів (кровоносних судин,
клапанів серця), а також інших медичних виробів і
інструментів – катетерів, хірургічних волокон,
перев’язувальних матеріалів, протиопікових
пов’язок, стоматологічних протезів.
33
34. Найширше методи імобілізації використовують для
створення матеріалів, що безпосередньо
контактують з кров’ю. До цих матеріалів, крім
звичайних вимог (нетоксичність,
неканцерогенність, стійкість до дії біологічних рідин
і стерилізації), висувають і специ-фічні вимоги, а
саме тромборезистентість. Одержання таких
матеріалів визначає успіх у ство-ренні штучного
серця з автономним живленням, удос-коналенні
апаратів штучного кровообігу, штучної нир-ки,
протезів кровоносних судин і штучних клапанів
серця. На поверхні матеріалів імобілізують
антикоа-гулянти та ферменти, які створюють
перепону для адгезії і агрегації тромбоцитів або
каталізують гідролі-тичне розщеплення фібрину,
що призводить до лізису тромбу. 34
35. 35
Фермент Носій Метод імобілізації Використання
Алкогольдегідрогеназа нейлон ковалентний визначення
етанолу в
біологічних рідинах
Лактатдегідрогеназа поліакриламід включення в гель визначення
молочної кислоти в
крові
Дезоксирибонуклеаза полімерні
матеріали
ковалентний лікування
запальних
процесів
Уреаза нейлон
(колодій)
мікрокапсулювання зниження вмісту
сечовини в крові
Аспарагіназа нейлон
(колодій)
мікрокапсулювання лікування
пухлинних
процесів
β-оксистероїд-
дегідрогеназа
целюлоза ковалентний визначення
тестостерону
Використання імобілізованих ферментних препаратів в
медицині
36. Імобілізація тромболізуючих ферментів (трипсин,
хімотрипсин, плазмін, стрептокіназа) може бути
здійснена методом включення цих ферментів до
структури гідрогелей, сформованих на поверхні
протезів, що контактують з кров’ю. Наприклад,
трипсин і гепарин можуть бути імобілізовані в
структурі гелів сополімерів вінілового спирту і
полісиліксанів, сформованих на поверхні виробів із
титану (штучні клапани серця).
36
37. 5. Ферментні сенсори в медицині
Сенсори — це прилади, що дозволяють
здійснювати якісний чи кількісний аналіз в
реальному масштабі часу з мінімальною
додатковою пробопідго-товкою.
Біосенсори — аналітичні пристрої, до складу яких
входять біохімічні елементи, що реагують з
речовинами, які визначаються, і знаходяться в
безпосередньому контакті з трансдьюсером
(датчиком), який перетворює біохімічний сигнал в
електричний і відповідно в цифровий.
37
38. Трансдьюсер — датчик (перетворювач сигналу), який
перетворює біохімічний сигнал за участю
біологічного компоненту сенсору в електричний.
Це може бути електрод, оптоволокно,
пьєзокристал. Електрохімічні сенсори становлять
80% всіх біосенсорів.
Перший універсальний перетворювач сигналу —
скляний рН-метричний електрод, який і сьогодні
використовується у потенціометричних
біосенсорах, з’явився у1922 році. У 1956 році
Кларк запропонував конструкцію кисневого
електроду на основі платини, що вкрита
газопроникною мембраною, який у поєднанні з
глюкозооксидазою використали для вимірювання
глюкози у крові.
38
39. В цьому електроді фермент глюкооксидаза
каталізувала реакцію окислення глюкози до
глюколактону. Фермент знаходився у водному
розчині між двох діалізних мембран, закріплених
на поверхні кисневого датчику. Перетворення, які
відбуваються в такому сенсорі, можна представити
схемою:
39
40. Крім вимірювання вмісту глюкози, медичні
біосенсори використовують для визначення
сечовини, молочної та сечової кислоти, гліцеридів
жирних кислот, амінокислот, фосфотиділхолінів,
низку інших метаболітів. Біосенсори
використовують також в мікробіологічній
промисловості, еколого-аналітичному контролі,
контролі харчових продуктів та інше.
Ферментні сенсори містять чисті препарати
ферментів чи біологічні препарати (гомогенати
тканин чи мікробних клітин), які виявляють
каталітичну активність. У відповідності до
принципу функціонування ферментні сенсори
підрозділяють на субстратні та інгібіторні.
40
41. Субстратні біосенсори призначені для визначення
специфічних субстратів ферментативних реакцій.
Прикладом є визначення глюкози за допомогою
глюкооксидази, сечовини — уреази.
Серед специфічних субстратів ферментів
біомедичного призначення необхідно відзначити
молочну кислоту (лактат), а також продукт її
відновлення — піровиноградну кислоту (піруват).
Ці метаболіти переходять один в інший в
залежності від редокс-статусу біологічного
середовища під дією лактатдегідрогенази.
41
42. Це NAD-залежна оксидоредуктаза, активність якої і
напрям реакції залежить від співвідношення
концентрацій окисленої та відновленої форм
кофактору NAD/NADH. Вміст лактату є маркером
функціонально анаеробного стану м’язів і одним з
параметрів оцінки загального стану хворого у
післяопераційний період, спортсменів після
значних фізичних навантажень.
Інгібіторні сенсори призначені для визначення
речовин, що знижують активність ферменту.
Наприклад сенсори для визначення
фосфорорганічних пестицидів, що знижують
активність ацетилхолінестерази.
42
43. Імобілізація ферментів дозволяє значно
збільшити термін їхнього зберігання, робить їх
більш стійкими до агресивних впливів
внутрішнього середовища організму, дозволяє
зберігати початкову активність ферменту
впродовж тривалого часу.
Процеси імобілізації ефективні для створення
лікарських препаратів пролонгованої дії,
дозволяють зменшити дозу та частоту введення
препаратів, захищають тканини від подразнюючої
дії ліків.
43
44. Зараз до 85% світового ринку біосенсорів
припадає на випуск глюкометрів. На сьогодні 11
компаній випускають 33 моделі глюкометрів, які
відрізняються за виконанням біосенсорної частини,
вимогами до потрібного об’єму крові, часу
вимірювання, вартості. За даними медичної
статистики кількість хворих на цукровий діабет
постійно зростає і до 2025 року становитиме 300
млн. осіб. На долю розвинених країн припадає
близько 17% кількості хворих, що дозволяє
розраховувати на стабільний ріст ринку
відповідних вимірювальних пристроїв, в тому числі
і глюкометрів.
44
