2. ЗМІСТОВИЙ МОДУЛЬ 3. «Технологія
вітамінів»
Тема 15. ТЕХНОЛОГІЇ МІКРОБНОГО
СИНТЕЗУ ВІТАМІНІВ. Виробництво β-
каротину. Виробництво ергостерину.
Біотехнологія рибофлавіну.
Виробництво ціанкобаламіну.
Використання мікроорганізмів у
виробництві аскорбінової кислоти
2
3. 3.3. ТЕХНОЛОГІЇ МІКРОБНОГО СИНТЕЗУ
ВІТАМІНІВ
3.3.1. Виробництво β-каротину
Продуценти. Здатність до синтезу каротиноїдів
виявлена у багатьох мікроорганізмів –
представників різних таксономічних і фізіологічних
груп (бактерії, дріжджі, гриби, водорості).
Каротиноїди локалізуються у вигляді складних
ефірів і глікозидів у клітинній мембрані мікроорга-
нізмів або у вільному стані – у ліпідних гранулах у
цитоплазмі. Найактивнішим продуцентом
каротинів є гетероталічний мукоровий гриб
Blakeslea trispora.
3
4. 4
Бактерії Mycobacteruim phlei, M. stegmatis, M. lacticolum,
M.rubrum, M. brevicali, Mycrococcus glutamicus,
M.roseum, Actinomyces aureomonopodiales,
A.chrysomallus var. carotinoides, A. subflavus,
Streptomyces mediolani, Corynebacterium poinsetiae,
представники роду Pseudomonas
Дріжджі Rhodotorula glutinis, R. rubra, R. flava,
Sporobolomyces roseus Rhodosporidium diobovatum
Гриби Blakeslea trispora, Choanephora conjuncta,
C.cucurbitarum, C. circinans, C. heterospora,
Phycomyces blakesleeanus
Водорості Dunaliella salina, D. bardawil, представники родів
Cyanophyta, Spirulina, Chlorella
Каротинсинтезувальні організми
5. Шляхи підвищення каротиногенезу
Стимулювальний ефект на біосинтез каротиноїдів,
особливо β-каротину, спричиняє β-іонон.
Стимулююча дія β-іонону виявляється тільки за
присутності олій, причому склад ліпідів суттєво
впливає на утворення β-каротину. Він може бути
замінений на дешевшу цитрусову пульпу або
цитрусову мелясу.
Гетерокаріон B. trispora, одержаний з мутантних
(оборобкою нітрозогуанідіном) штамів SB39 і SB32,
синтезував до 39 мг β-каротину на 1 г сухої
біомаси, що на два порядки вище, ніж вихідний
штам.
5
6. У процесі культивування B. trispora спостерігається
агрегація міцелію, що суттєво утруднює процеси
масопереносу і, отже доступність як кисню, так і
поживних речовин для клітин. З метою
попередження цього явища у середовище
культивування вносять поверхнево-активні
речовини.
За останнє десятиріччя створено рекомбінантні
штами Escherichia coli – продуценти лікопіну, аста-
і зеаксантину та β-каротину. Можливості
метаболічної інженерії дали змогу здійснити синтез
різних каротиноїдів некаротиногенним штамом E.
coli.
6
7. Переваги використання цього бактеріального штаму
як продуцента каротиноїдів зумовлені високою
швидкістю росту на простих мінеральних
середови-щах і невеликою тривалістю
культивування для досягнення максимального
рівня біомаси.
7
8. Промислове виробництво кристалічного
β-каротину
Сировина. Промислове виробництво каротиноїдів
мікробного походження з використанням як проду-
цента B. trispora було налагоджено у Радянському
Союзі у 60-ті роки ХХ ст. Недоліком перших
техноло-гій біосинтезу β-каротину було
використання дефіцит-ної або дорогої харчової
сировини. Спочатку для культивування B. trispora
використовували збагачені рослинними оліями або
тваринними жирами (до 1–8 %) і поверхнево-
активними речовинами середовища. На ранніх
стадіях біосинтезу у середовища вносили
додатково стимулятори та стабілізатори каротино-
генезу (іонони, антиоксиданти іонол, сантонін,
агідол) 8
9. Пізніше рослинні олії та тваринні жири стали
частково або повністю замінювати на дешевшу
сировину – відходи миловарної, парфумерної,
молочної та олієжирової промисловості.
Нині час основною сировиною для біосинтезу β-
каротину є харчова сировина (кукурудзяне та
соєве борошно, рослині олії), відходи крохмале-
патокового виробництва (патока кукурудзяна
зелена, рідкий кукурудзяний екстракт).
Промислові штами-продуценти - B. trispora штам
ВСД-1, який порівняно з штамом К2 синтезує у 2–
2,5 рази більше каротину (8–10 г на 1 кг сухої
біомаси). (патент України № 49710А, 2002 р.)
9
10. Середовища культивування штаму ВСД-1. Для
одержання посівного матеріалу (+) і (-) форм, які
культивуються окремо, використовують
середовище такого складу (г/л):
борошно соєве – 2,3;
борошно кукурудзяне – 4,7;
KH2PO4 – 0,05;
тіамін (вітамін В1) – 0,0002;
рН середовища 6,2–6,4.
Тривалість вирощування посівного матеріалу - 48
год,
Температура культивування 28 °С
10
11. Для сумісного культивування (+) і (-) штамів на
стадії виробничого біосинтезу використовують
середовище такого складу (г/л):
зелена патока – 38,0;
кукурудзяний екстракт – 21,5;
KH2PO4 – 0,5;
тіамін (вітамін В1) – 0,002;
рН середовища 6,2–6,4
Тривалість виробничого біосинтезу – 55–65 год.
Температура культивування 28 °С. Для сумісного
культивування кількість посівного матеріалу (+)
форми штаму у 2–5 разів вища, ніж (-) форми. Це
зумовлено тим, що β-каротин утворює тільки (-)
штам, тому його кількість повинна бути більшою.
11
12. Технологія одержання кристалічного β-каротину
Нині відомо кілька варіантів виділення й
очищення β-каротину.
І варіант. Основні етапи одержання кристалічного
каротину такі:
– відокремлення міцелію;
– висушування міцелію спиртом;
– багатоступінчата екстракція каротину з неподріб-
неної біомаси неполярними органічними розчинни-
ками (н-алкани та їхні хлорпохідні); співвідношення
розчинник / біомаса = 1:5; температура 75 °С;
– відгонка розчинника і упарювання екстракту;
12
13. – охолодження екстракту і кристалізація каротину
– розбавлення одержаної суспензії кристалів
полярними розчинниками (ацетон, метанол,
етанол). Полярні розчинники відіграють роль
«висолюваль-них» агентів. Після випадіння
кристалів їх відділяють, промивають і висушують у
вакуумі.
Недоліками цього варіанту є екстракція каротину з
неподрібненої біомаси, що суттєво знижує ступінь
вилучення каротину з біомаси в органічний
екстракт; високе співвідношення
розчинник/біомаса (5:1 на кожному етапі);
кристалізація каротину при зниженій температурі з
одночасним висолюванням без
13
14. додаткового прогріву перед фільтрацією, що
призводить до співосадження разом з каротином
домішок ліпідів з біомаси, а отже, зниження якості
одержуваних кристалів;
– використання токсичних розчинників (хлор-н-
алкани, метанол) і необхідність створення ділянки
виробництва для їхньої регенерації.
14
15. ІІ варіант (патент РФ №2112808, 1998 р.) включає
такі етапи:
– відокремлення міцелію;
– висушування міцелію (у вакуумі);
– подрібнення міцелію (валкові млини);
– екстракція каротину соняшниковою олією при
температурі 95–100 °С (співвідношення екстрагент/
біомаса становить 1:1,5÷1:3. Першу екстракцію
здійснюють за перемішування упродовж 15–60 хв;
– фільтрація (фільтр-прес) з метою відділення
насиченого олійного екстракту каротину;
15
16. – двоетапна повторна екстракція залишкових
кароти-ноїдів з відпрацьованої біомаси
(безпосередньо на фільтрі) нагрітою до 60–90 °С
соняшниковою олією;
– об’єднання насичених екстрактів і оброблення
спиртом (етанол) у співвідношенні 3:1 при
темпера-турі 40–55 °С з метою їхнього очищення;
– кристалізація при температурі 10–20 °С упродовж
1–3 діб. У процесі кристалізації мікробні ліпіди
(домішки) переходять в екстракт разом з
каротином і випадають в осад одночасно з
кристалами каротину;
– фільтрування для відокремлення осаду;
16
17. – нагрівання суспензії кристалів до 40–60 °С для
додаткового очищення кристалів від домішок
(фосфоліпідів). За підвищеної температури
домішки розчиняються і легко відділяються від
осаду кристалів;
– промивання кристалів каротину етанолом у
співвідношенні 1:3÷1:25 при температурі 50–55 °С
упродовж 30 хв;
– висушування у вакуумі.
17
18. 3.3.2. Виробництво ергостерину
Продуценти. Ергостерин – основний стерин
дріжджів, на який припадає 60–90 % від інших
стеринів: вміст стеринів становить 0,2–0,5 %,
проте у деяких випадках досягає 10 % від сухої
біомаси дріжджів.
Культурні раси дріжджів зазвичай багатші на
стерини порівняно з дикими; найбільшу кількість
стеринів містять хлібопекарські та пивні дріжджі.
Найвищі кількості стеринів (понад 10 % у біомасі)
синтезують штами Saccharomyces carlsbergensis.
Крім дріжджів, продуцентами ерогостерину можуть
бути міцеліальні гриби – аспергіли і пеніцили, у
біомасі яких міститься 1,2–2,2 % ергостерину.
18
19. Умови синтезу стерину дріжджами
Важливою умовою синтезу ергостерину дріжджами
є інтенсивна аерація. В анаеробних умовах в
клітинах накопичується попередник ергостерину –
сквален. Кисень індукує синтез стеринів
активацією епоксидази сквалену – першого
ферменту біосинте-тичного шляху. Індукція
синтезу ергостерину починається за 0,03 % О2 у
газовій фазі і досягає максимуму за концентрації 2
%.
Другою важливою умовою синтезу ергостерину є
надлишок вуглецю в середовищі за ліміту азоту,
тобто високе співвідношення С/N. Так
максимальна кількість ергостерину синтезується B.
trispora за співвідношення С/N, що становить 70:1.
19
20. Стимулювальну дію на утворення стеринів
дріжджами спричиняють інгібітори гліколізу, а
також вітаміни, насамперед пантотенова кислота,
яка у складі КоА бере участь у побудові молекули
ергостерину.
Інтенсифікація синтезу ергостерину у
Saccharomyces cerevisiae
Нині велика увага приділяється підвищенню ерго-
стериногенезу у дріжджів S. сerevisiae шляхом:
– підвищення вмісту ергостерину у дріжджових кліти-
нах оптимізацією умов культивування і створенням
генно-інженерних штамів;
20
21. – підвищення концентрації біомаси дріжджів, що
також дасть змогу збільшити кількість одержаного
ергостерину.
Культивування з вуглеводним підживленням
виявилось ефективним для підвищення
концентрації дріжджів, а отже, й ергостерину. Так,
для штаму S. cerevisiae Y-E-1 початкова
концентрація глюкози у середовищі становила 60
г/л. У процесі культиву-вання, починаючи з 10-ї год
росту у середовище вносили глюкозу (загальна
кількість добавленої глюкози становила 600 г/л),
підтримуючи її концентрацію у культуральній рідині
на постійному рівні (приблизно 5 г/л).
21
22. Такий прийом дав змогу збільшити майже до 100
г/л концентрацію сухої біомаси дріжджів і майже
до 2 г/л концентрацію ергостерину.
Штам S. cerevisiae Y-E-1 вирощують на
середовищі такого складу (г/л):
глюкоза – 60 (початкова концентрація);
кукурудзяний екстракт – 15;
NaNO3 – 7,0; KH2PO4 – 6,0; MgSO4 – 3,0; CuSO4∙5H2O
– 0,2 мг/л; FeSO4∙7H2O – 1,0 мг/л; ZnSO4∙7H2O – 10,0
мг/л.
22
23. Технологія одержання кристалічного
ергостерину
Стадії виділення кристалічного ергостерину після
біосинтезу:
- сепарування культуральної рідини для
відокремлення біомаси;
- опромінення клітин ультрафіолетовими променя-
ми;
- гідроліз клітин (соляною кислотою при t =110°С)
- оброблення етанолом ( t = 75-78 °С)
- фільтрація ( t = 10-15°С)
- промивання твердого залишку водою;
23
24. - висушування;
- подрібнення;
- екстракція ергостерину етанолом ( t = 75-78 °С; 2
рази етанол 3:1)
- упарювання спиртових екстрактів (до 70 % СР)
- кристалізація ( t = 0 °С);
- промивання кристалів (69 % етанол);
- повторна кристалізація ( t = 0 °С);
- промивання кристалів (суміш спирту і бензолу
(80:20);
- висушування кристалів;
- розчинення кристалів у сірчаному ефірі;
24
25. - опромінення розчину;
- видалення сірчаного ефіру відгонкою;
- концентрування розчину вітаміну D2 ;
- кристалізація.
«Кислотний фільтрат» упарюють до 50 % вмісту
сухих речовин і використовують як вітамінний
концентрат.
Для одержання масляного концентрату D2 розчин
вітаміну після фільтрації розбавляють олією до
стандартної концентрації.
.
25
26. 3.3.3. Біотехнологія рибофлавіну
За останнє десятиліття мікробіологічний синтез
вітаміну В2 значно потіснив хімічний, який превалю-
вав у виробництві.
Продуценти. Флавіни містяться у будь-якій клітині
живого організму. Більшість видів мікроорганізмів
за вмістом флавінів не різняться від рослинних і
тваринних клітин. У клітинах флавіни перебувають
зазвичай у метаболічно активній нуклеотидній
формі. Вміст вільного рибофлавіну не перевищує 7
% загального вмісту флавінів. У процесі росту
більшість мікроорганізмів виділяє рибофлавін у
культуральну рідину. Мікроорганізми, здатні
накопичувати понад 10 мг/л рибофлавіну,
зараховано до надсинтетиків вітаміну В2.
26
27. Мікроорганізми, здатні накопичувати понад 10 мг/л
рибофлавіну, зараховано до надсинтетиків
вітаміну В2. Їх можна поділити на три групи:
слабкоактивні, які синтезують до 100 мг РФ/л,
помірно активні, які утворюють до 600 мг РФ/л, та
високоактивні, які синтезують понад 10 г РФ/л .
27
28. Флавіногенні мікроорганізми
28
Організм Причина надсинтезу
Концен-
трація РФ, мг/л
Arthrobacter globiformis
Mycobacterium stegmatis
Clostridium acetobutylicum
Bacillus subtilis
Micrococcus glutamicus
Eremothecium ashbyii
Ashbya gossypii
Aspergillus
Torulopsis candida
Candida robusta
Pichia guilliermondii
Candida famata ATCC 20850
Candida guilliermondii
Невідома
Те саме
Дефіцит заліза
Мутації регуляторних генів
Те саме + ампліфікація rib-оперона
Невідома мутація
Те саме
« «
Дефіцит іонів магнію
Дефіцит заліза
Дефіцит заліза, середовище з кальцієм
Дефіцит заліза
Невідомі мутації, умови культивування
Невідома мутація
130
135
97
600
3000
126
10000
15000
46
567
340
175
10000
3518
29. Одержання технічного кристалічного
рибофлавіну.
ёДля одержання кристалічного РФ культуральну
рідину, одержану після культивування E. аshbyii,
нагрівають до температури 95–100 °С. За таких
умов весь рибофлавін виходить з клітин. Далі
здійснюють центрифугування розчину, одержаний
супернатант охолоджують до 18–20 °С, доводять
рН до 4,5–5,0 і осаджують рибофлавін з розчину за
допомогою гідросульфіту. Після декантації осад
промивають, центрифугують, висушують і
подрібнюють.
29
30. 3.3.4. Виробництво ціанкобаламіну (В12)
Після 10 років досліджень, в яких брали участь
понад 100 вчених, повний хімічний синтез вітаміну
В12 було здійснено у 1973 р. Вудвортом і А.
Ешенмозе-ром. Хімічний синтез досить складний і
включає 70 етапів, тому на сьогодні основним
способом одержання вітаміну В12 є мікробіологічний
синтез. Щорічно у світі виробляється понад 10–12
т цього вітаміну.
30
31. Продуценти.
Здатність до синтезу вітаміну В12 виявлена у
багатьох мікроорганізмів: Agrobacterium,
Alcaligenes, Aerobacter, Azotobacter, Bacillus,
Clostridium, Corynebacterium, Flavobacterium,
Micromonospora, Mycobacterium, Nocardia,
Propionibacterium, Protaminobacter, Proteus,
Pseudomonas, Rhizobium, Salmonella,Serratia,
Streptomyces, Streptococcus, Xanthomonas.
Для промислового виробництва кобаламіну
використовують штами, піддані дії мутагенних
факторів (УФ-опромінення, етиленімін,
нітрозометилуретан, нітрозогуанідін), а також
штами, одержані методами генетичної інженерії.
31
32. Одержання вітаміну В12 за допомогою
пропіоновокислих бактерій
Біосинтез вітаміну В12 пропіоновокислими бактеріями
відбувається паралельно росту в анаеробних
умовах. Вітамін накопичується у клітинах бактерій.
Ці особли-вості враховано у процесі промислового
виробництва ціанкобаламіну. Перевагою
використання пропіоново-кислих бактерій як
продуцентів вітаміну В12 є те, що вони синтезують
істинний вітамін і переважно у біологічно активній
коензимній формі.
32
33. Існує два способи одержання вітаміну В12 з
використанням бактерій роду Propionibacterium:
анаеробний і анаеробно-аеробний. Під час
реалізації першого способу (в анаеробних умовах,
під тиском азоту) у середовище на другій стадії
ферментації (після 72 год) вносять– 5,6-
диметилбензімідазол (ДМБ). Це зумовлено тим,
що 5,6-ДМБ у клітинах пропіоновокислих бактерій
синтезується за доступу кисню. У процесі
анаеробно-аеробного способу на першій стадії
(72–80 год) штам вирощують в анаеробних умовах
(під невеликим тиском азоту і слабкому
перемішуванні) до повної асиміляції вуглеводів.
33
34. На другій стадії (80–88 год) створюють аеробні
умови (включають аерацію – 2 м3
/год і
перемішування), що забезпечує синтез 5,6-ДМБ.
Обидві стадії (анаеробну і аеробну) можна
здійснювати в одному або різних ферментаторах.
Середовища культивування. Середовища для
культивуваня пропіоновокислих бактерій і
біосинтезу вітаміну В12 містять зазвичай глюкозу чи
інвертовану мелясу (10–100 г/л), кукурудзяний
екстракт (до 100 г/л), невеликі кількості солей
заліза, марганцю і магнію, а також кобальту (10–
100 мг/л), джерело мінерального азоту –
сірчанокислий амоній. У середовище
рекомендують вносити також пантотенову кислоту,
яка стимулює синтез вітаміну В12.
34
35. Одержання кристалічного вітаміну В12
Ціанкобаламін накопичується в клітинах бактерій,
тому операції з виділення вітаміну включають такі
стадії:
– сепарацію клітин;
– екстракцію водою при рН 4,5–5,0 і температурі 85–
90°С, за присутності стабілізатора (0,25 % розчину
нітриту натрію) упродовж 1 год. За таких умов
вітамін В12 переходить у розчин;
– водний розчин охолоджують, доводять рН до 6,8–
7,0 50%-ним розчином їдкого натру. Для коагуляції
білків додають Al2(SO4)3∙18H2O i безводний FeCl3,
після чого осад відділяють фільтруванням;
35
36. – очищують розчин з використанням іонообмінних
смол СГ-1 (попередньо розчин вітаміну
підкислюють до рН 2,5–2,7), після чого здійснюють
елюцію кобаламінів розчином аміаку;
– здійснюють додаткове очищення розчину вітаміну
органічними розчинниками, випарювання й
очищення на колонці з Al2O3, після чого кобаламіни
елюють водним ацетоном;
– до водно-ацетонового розчину вітаміну додають
ацетон і витримують 24–48год при температурі 3–4
°С. Кристали вітаміну відфільтровують,
промивають безводним ацетоном висушують у
вакуумі.
36
37. В одному з варіантів одержання кристалічного
вітаміну В12 після елюції кобаламінів з іонообмінної
смоли СГ-1 в аміачний розчин вітаміну вносять
активоване вугілля, десятикратний об’єм води и
0,9 % NaCN по відношенню до маси вугілля. Після
двох годин перемішування здійснюють підкислення
маси соляною кислотою, відфільтровують вугілля
(з обов’язковим промиванням осаду) і десорбують
з вугілля вітамін ізопропіловим спиртом.
Ізопропіловий спирт упарюють і вітамін В12
піддають додатковому резорциновому очищенню
кристалізації.
37
38. Одержаня вітаміну В12 за допомогою
Pseudomonas denitrificans
Періодичне культивування бактерій здійснюють в
аеробних умовах (з аерацією – 0,2 м3
/год і
перемішуванням – до 420 об/хв) упродовж 90 год
при температурі 28–29 °С. Для одержання
посівного матеріалу використовують середовище
такого складу (г/л): бурякова меляса – 60; пивні
дріжджі – 1,0; N–Z-амін – 1,0; (NH4)2PO4 – 2,0;
MgSO4 –1,0; MnSO4 – 0,2; ZnSO4 – 0,020; MoSO4 –
0,005, рН 7,4. Тривалість вирощування інокуляту
72 год.
38
39. Склад середовища для виробничого біосинтезу
(г/л):
- бурякова меляса – 100;
- дріжджовий екстракт – 2,0;
- (NH4)2PO4 – 5,0; MgSO4 – 3,0; MnSO4 – 0,2; CoNO3 –
0,188; 5,6-ДМБ – 0,025; ZnSO4 – 0,020; Na2MoO3 –
0,005, рН 7,4.
Меляса багата на бетаїн і глутамінову кислоту, які
позитивно впливають на біосинтез вітаміну.
39
40. Виділення вітаміну. Очищений вітамін
одержують в результаті проведення таких стадій:
– культуральну рідину (3,3 л) нагрівають до 120 °С і
витримують при такій температурі 30 хв. Потім
охолоджують до 25 °С, доводять рН до 8,5,
добавляють KCN, витримують (за перемішуваня)
16 год, після чого вносять ZnCl2, доводять рН до
8,0, перемішують і фільтрують. У результаті
проведених операцій одержують фільтрат, що
містить вітамін В12;
– з фільтрату екстрагують вітамін сумішшю крезолу і
трихлористого вуглецю у співвідношенні 1:2.
Екстрак-цію здійснюють тричі, добавляючи кожного
разу су-міш екстрагентів у кількості 350 мл. У
результаті здій-снення таких операцій одержують
органічний екстракт вітаміну (органічний екстракт
40
41. • . – до органічного екстракту І добавляють н-
бутанол (500 мл), після чого здійснюють трикратну
екстракцію вітаміну водою (100 мл) і одержують
водний екстракт вітаміну;
• – водний екстракт піддають трикратній екстракції
30 мл суміші крезолу і трихлористого вуглецю у
співвідношенні 1:2, у результаті чого одержують
органічний екстракт ІІ;
• – до органічного екстракту ІІ добавляють 200 мл
ацетону і 120 мл ефіру. Так одержують
неочищений вітамін В12;
41
42. – для одержання очищеного вітаміну неочищений
препарат розчиняють у 10 мл метанолу, сорбують
на активованому алюмінії (4 г), здійснюють елюцію
2 %-ним розчином оцтової кислоти у метанолі і
осаджують ефіром. Так одержують очищений
вітамін В12 (ступінь очищення 98 %). Вихід
ціанкобаламіну становить 75 %.
42
43. 3.3.5. Використання мікроорганізмів у
виробництві аскорбінової кислоти
Синтез Рейхштейна
У 1933 р. було вперше здійснено хімічний синтез
аскорбінової кислоти (синтез Рейхштейна). І уже у
1934 р. у хімічний синтез вітаміну С з глюкози було
введено одну біохімічну реакцію, здійснювану
оцтовокислими бактеріями – високоселективне
дегідрування D-сорбіту у L-сорбозу. Крім бактерій
Gluconobacter suboxydans, для перетворення D-
сорбіту на L-сорбозу використовують також
Acetobacter xylinum і A. suboxydans.
43
44. Для цього останнього штаму необхідна наявність у
середовищі пантотенової , р–амінобензойної і
нікотинової кислот. Недоліком A. xylinum є його
чут-ливість до нікелю. Тому нікель, зв’язаний з
сорбітом (утворюється в реакції з нікелевим
каталізатором), потрібно видаляти,
використовуючи іонообмінні смо-ли. Вміст нікелю у
кукурудзяному екстракті (компо-нент поживного
середовища) можна зменшити теп-ловою
обробкою. Можна також адаптувати культуру до
високих концентрацій цього металу. Наприклад, A.
melanogenum витримує до 10 мг нікелю на л
середо-вища. У технологіях з використанням A.
suboxydans перетворенню піддають 20 %-ний
розчин сорбіту, який містить 24 мг/л нікелю.
44
45. Процес перетворення D-сорбіту на L-сорбозу
Процес здійснюють в аеробних умовах у
ферментаторах з перемішуванням. Середовище
містить сорбіт, джерело азоту та крейду.
Початкова концентрація сорбіту у середовищі
становить 10–20 % сорбіту з наступним його
внесенням до кінцевої концентрації 28–35 %. Як
джерело азоту найчастіше використовують
кукурудзяний екстракт (0,1–0,3 %). рН середовища
доводять до 5,0–6,0.
Для одержання інокуляту бактерії вирощують у
середовищі з 20 % сорбіту упродовж 20 год.
Кількість посівного матеріалу становить 3–10 % від
об’єму середовища у виробничому ферментаторі.
45
46. Виробничу ферментацію здійснюють при
температурі 30–35 °С у періодичних умовах з
інтенсивною аерацією (8–10 г О2/л∙год). Якщо
замість повітря для аерації використовують кисень
(за підвищеного тиску), тривалість ферментації
скорочується. Проте такий прийом неприйнятний
для A. melanogenum, ріст якого інгібується за
підвищених концентрацій кисню. Тривалість
ферментації становить 24 год. Вихід L-сорбози
досягає 93 %.
• Виділення L-сорбози. Культуральну рідину, що
містить L-сорбозу, знебарвлюють активованим
вугіллям, фільтрують (двічі) на фільтр-пресі,
фільтрат концентрують у вакуумі до
сиропоподібної маси, яку піддають кристалізації
при температурі 15 °С 46
47. Кристали відділяють центрифугуванням, промива-
ють льодяною водою і висушують.
Далі у синтезі Рейхштейна відбувається
конденсація L-сорбози з ацетоном. При цьому
утворюється діацетонсорбоза, яка окиснюється до
2-кето-L-гулонової кислоти (2-КЛГ) за присутності
каталіза-тора (платини). Наступна енолізація та
лактонізація супроводжуються утворенням
аскорбінової кислоти з виходом 50 %.
Оскількі понад 70 років для одержання аскорбінової
кислоти у світі використовується спосіб
Рейхштейна, незважаючи на його
енерговитратність ,нині йде пошук альтернативних
способів одержання аскорбі-нової кислоти,
зокрема, мікробіологічних.
47
48. Мікробний синтез 2-кето-L-гулонової кислоти.
В останні 20 років з використанням мікроорганізмів
було розроблено ряд підходів, що дають змогу
спростити процес одержання аскорбінової
кислоти .
Більшість цих підходів спрямовані на одержання
мікробним синтезом не самої аскорбінової кислоти,
а 2-кето-L-гулонової кислоти – ключового
інтермедіа-ту, який може бути перетворений на
аскорбінову кислоту хімічним шляхом.
Утворення 2-КЛГ з D-глюкози, D-сорбіту і L-
сорбози може здійснюватися кількома способами:
48
49. – використанням монокультур – представників родів
Gluconobacter, Acetobacter, Ketogulonicigenium,
Pseudomonas, Erwinia, Corynebacterium;
– використанням кількох культур мікроорганізмів
(змішаних культур);
– використанням рекомбінантних штамів.
Процеси, здійснювані монокультурами. У 1990 р.
було селекціоновано штам Gluconobacter
melanoge-nus IFO 3293, здатний продукувати 2-
КЛГ як з D-сорбіту, так і з L-сорбози з виходом 50 і
60 % відповідно (див. рис. 5.8, метод 2). У 2001 р.
було ізольовано два штами Ketogulonicigenium, які
перетворювали 20 г/л L-сорбози на 9,3 г/л 2-КЛГ.
49
50. Процеси з використанням кількох
мікроорганізмів
У 1969 р. китайські вчені модифікували спосіб
Рейхштейна, замінивши хімічний синтез діацетон-
2-КЛГ мікробіологічним етапом утворення 2-КЛГ. У
цьому модифікованому процесі два етапи
(утворення L-сорбози з D-сорбіту і утворення 2-
КЛГ) здійснюються різними мікроорганізмами. На
сьогодні саме такий двостадійний процес
використовується багатьма китайськими
виробниками для одержання аскорбінової кислоти.
50
51. Генетично модифіковані штами
Першим рекомбінантним штамом,
використовуваним у процесі одержання 2-КЛГ, був
штам Erwinia herbicola. Було показано, що цей
штам здійснює перетворення глюкози на 2,5-ДКГ
упродовж кількох стадій, що каталізуються різними
фермента-ми, у той час як Corynebacterium sp. для
перетвореня 2,5-ДКГ на 2-КЛГ необхідний лише
один етап. Отже, найпростіший спосіб створення
одного мікроорганіз-му, здатного перетворювати
D-глюкозу на 2-КЛГ, полягає у виділенні гена 2,5-
ДКГ-редуктази Corynebacterium sp. і введенні його
у Erwinia herbicola.
51
52. Така робота була проведена на початку−середині
80-х років ХХ ст. вченим С.Андерсоном. Це була
одна з перших робіт в області метаболічної
інженерії. За допомогою генетичних маніпуляцій
метаболічні реакції, що проходять у різних
мікроорганізмів, вдалося здійснити в одному з них.
Таку бактерію можна використовувати як фабрику
для виробництва 2-КЛГ, що замінює перші три
стадії у традиційному процесі виробництва
аскорбінової кислоти. Цей рекомбінантний штам
здатний утворювати до 120 г/л 2-КЛГ менш, ніж за
100 год (2000 р.).
52
