HPLC merupakan teknik kromatografi cair kinerja tinggi yang digunakan untuk memisahkan senyawa berdasarkan interaksi antara fase diam dan fase gerak. Teknik ini memiliki berbagai kegunaan seperti analisis kuantitatif dan kualitatif, pemisahan senyawa organik dan anorganik, serta menentukan kadar senyawa tertentu. Komponen utama HPLC terdiri atas pompa, kolom, detektor, dan komputer untuk merekam

1. HIGH PERFORMA
LIQUID
CHROMATOGRAPH
Indriyanti Widya
Department of Pharmacy, Health Faculty
University of Darussalam Gontor
2016

2. HISTORICAL
 Historically, high-performance liquid
chromatography (HPLC) can be traced back to
the amino acid analyzers of the early 1960s. By
1975, liquid chromatographic instrumentation
was described in the United States
Pharmacopeia.
 Since that time, HPLC has become the most
popular chromatographic technique in the
pharmaceutical laboratory

3. DEFINITION
 Merupakan teknik pemisahan senyawa dengan
cara melewatkan senyawa melalui fase diam
(stationary phase) dengan menggunakan fase
gerak (mobile phase) mengaliri semua ini
 Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom
atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga
akan mempengaruhi kekuatan interaksi senya-
wa dengan fase diam dan fase gerak

4.  Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu
retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak
 Kedua hal ini berguna untuk :
 analisis kualitatif digunakan informasi tR,
 analisis kuantitatif digunakan informasi luas
 area/tinggi puncak kromatogram

5. QUANTITATIVE AND QUALITATIF ANALYSIS

6. USABILITY HPLC
 Pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun
senyawa biologis
 Analisis ketidakmurnian (impurities)
 Analisis senyawa tidak mudah menguap (non volatile)
 Penentuan molekul-moleku netral, ionik, maupun zwitter ion
 Isolasi dan pemurnian senyawa
 Pemisahan senyawa-senyawa yg strukturnya hampir sama
 Pemisahan senyawa-senyawa dlm jml sekelumit (trace
elements)
 Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu

7. EXCESS HPLC
 KCKT dapat dipakai untuk senyawa non volatile dan
senyawa berbobot molekul tinggi.
 KCKT dapat dipakai untuk senyawa anorganik yg sebagian
besar non volatile.
 KCKT biasanya dilakukan pada suhu kamar sehingga
aman bagi senyawa yg tidak tahan panas
 Pada KCKT kemungkinan intaraksi antara fase gerak dan
fase diam besar sekali (mencakup antaraksi ikatan hidrogen
dan reaksi ion)  proses pemisahan lebih optimal
 Fase gerak pada KCKT dapat diubah dengan mencampur
pelarut dalam berbagai gradient
 Dapat digunakan untuk menganalisis beberapa senyawa
sekaligus (secara simultan)

8. SHORTAGE OF HPLC
 Sulit untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali
jika HPLC dihubungkan dg spektrometer massa
 Jika sampel yang digunakan sangat kompleks,
maka resolusi (pemisahan) yg baik sulit
diperoleh

9. RESOLUTION
 Tingkat pemisahan komponen dalam suatu
campuran dengan metode kromatografi
direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan
 Untuk hasil pemisahan yang baik, puncak-puncak
dalam kromatogram harus terpisah secara
sempurna dari puncak lainnya dengan sedikit
tumpang tindih (overlap) atau tidak tumpang tindih

11. RESOLUTION
 Resolution is a measure of the effective separation of
adjacent analyte peaks.
 Resolution of two peaks is aided by thermodynamic
factors, which give rise to partitioning and separation
(ie-K), and it is countered by kinetics, which can give
rise to additional dispersion of a peak, making
otherwise well separated peaks merge with each other.

13. COMPONENTS OF HPLC
INSTRUMENTS
 1.Wadah fase gerak
 2.Sistem penghantaran fase gerak = Pompa
 3.Alat utk memasukkan sampel
 4.Kolom
 5.Detektor
 6.Wadah penampung buangan fase gerak
 7.Tabung penghubung
 8.Suatu komputer atau integrator atau perekam

15. CAUTION
 Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan
degassing (penghilangan gas)
 Pelarut yang digunakan harus dengan
kemurnian tinggi (HPLC grade)

16. SYUKRON