Il polimorfismo di lunghezza di frammento di restrizione (RFLP) è una tecnica genetica sviluppata nel 1984 per analizzare le variazioni nel DNA tra organismi. Utilizza l'estrazione e la digestione del DNA seguita da elettroforesi e analisi per identificare marcatori genetici, utile in diverse applicazioni come la paternità e medicina forense. Tuttavia, presenta limitazioni in termini di sensibilità e interpretazione, richiedendo quantità considerevoli di DNA e apparecchiature complesse.

1. S
Creato da:
• Di Iorio Sasha
• Falcone Dennis
• Cichella Carlo Alberto
• Frisoli Francesco
• Pennese Davide
• D'angelo Nunzio
• Petrilli Francesco

2. Il polimorfismo di lunghezza di frammento di restrizione (RFLP) è una tecnica
inventata nel 1984 dallo scienziato inglese Alec Jeffreys durante la ricerca
sulle malattie ereditarie. È utilizzato per l'analisi dei reticoli unici nelle
sequenze di DNA per geneticamente differenziarsi fra gli organismi. Il
polimorfismo genetico è definito come le differenze genetiche ereditate fra le
persone dentro più di 1% di popolazione normale. La tecnica del RFLP sfrutta
queste differenze nelle sequenze del DNA per riconoscere e studiare sia la
variazione intraspecies che interspecies.

4.  ESTRAZIONE DEL DNA: Per cominciare con, il DNA è estratto da sangue,
dalla saliva o da altri campioni ed è depurato.
 FRAMMENTAZIONE DEL DNA: Il DNA si digerisce facendo uso degli
enzimi di restrizione. I siti di riconoscimento di questi enzimi sono
generalmente 4 - 6 coppie di basi. Più breve la sequenza riconosciuta,
maggior il numero dei frammenti generati da digestione.
 SEPARAZIONE TRAMITE FORESI
 VISUALIZZAZIONE DELLE BANDE: Il gel è trattato con le tinture
luminescenti per rendere le bande del DNA visibili.

5. I microsatelliti o STR (Short Tandem Repeat)
Ripetizioni in tandem di brevi (2-5 bp) tratti nucleotidici
(repeat)
Il polimorfismo consiste nel diverso numero di copie della
repeat (= alleli diversi hanno lunghezza diversa)
Il numero degli alleli è generalmente elevato (talvolta molto
elevato)
Sono uniformemente distribuiti in tutto il genoma, nei primati
rappresentano ca. l’1% del genoma.

6. Piccola curiosità: Il microsatellite più frequente nell’uomo è la sequenza
dinucleotidica citosina-adenina (CA) ripetuta da 5 a 50 volte consecutive;
le ripetizioni sono presenti in media ogni 10.000 basi circa. In genere il
m. CA fiancheggia sequenze di DNA presenti una sola volta nel genoma,
dette sequenze uniche.
 Hanno la funzione di marcatori del genoma identificabili mediante
analisi molecolari. Per es., quando è presente una malattia
ereditaria, si possono identificare negli individui affetti alcuni
marcatori molecolari che vengono ereditati insieme al gene mutato
responsabile della malattia, per poi localizzare il gene sul
cromosoma e procedere al suo sequenziamento;
 Analisi di paterità: grazie ai microsatelliti possiamo escludere con
certezza la paternità di un individuo.

7. Il DNA fingerprinting
1. Estrazione del DNA
2. Digestione con enzimi di restrizione e separazione dei frammenti tramite
elettroforesi
3. Denaturazione e trasferimento su membrana
4. Ibridazione con una sonda multi-locus marcata con radioattivo
5. Autoradiografia per rilevare i frammenti a cui si è legata la sonda

9.  Paternità e maternità;
 Medicina forense;
 Identificazione personale: E’ stata presa in considerazione la
possibilità di utilizzare i DNA fingerprints come una sorta di codice a
barre per identificare gli individui. L’applicazione di questa tecnica su
larga scala nell’immediato futuro è in corso di valutazione;

10.  Potere di discriminazione elevato
 Sensibilità limitata (richiede grandi quantità di DNA  mg, cioè
ca. 106 cellule)
 Tecnica lunga e non automatizzabile
 Analizza DNA a elevato peso molecolare: non adatto per
campioni degradati
 Pattern multi-bande di non facile interpretazione (base
molecolare del polimorfismo non nota)
 Problemi per l’interpretazione statistica (una corrispondenza che
valore statistico, e quindi probatorio, ha?)