X. laevis è un importante organismo modello in biologia evolutiva dello sviluppo, tossicologia, etologia, neurobiologia, endocrinologia e biologia dei tumori; grazie alle recenti tecniche di Genome editing, ha acquisito una posizione rilevante anche nel campo della Genetica.
X. laevis è un importante organismo modello in biologia evolutiva dello sviluppo, tossicologia, etologia, neurobiologia, endocrinologia e biologia dei tumori; grazie alle recenti tecniche di Genome editing, ha acquisito una posizione rilevante anche nel campo della Genetica.
I progressi tecnologici raggiunti nel campo delle strategie di sequenziamento degli acidi nucleici ("Next Generation Sequencing", NGS) permettono oramai di ottenere con facilità le informazioni contenute all’interno dell’intero genoma umano. Ma solo una piccola percentuale (stimata a 1,6%) del genoma umano viene tradotto nelle proteine che fanno funzionare il corpo umano. Il sequenziamento esomico ("Whole exome sequencing") si concentra proprio sulle parti del genoma che codificano le proteine ("i geni") perché la ricerca di varianti in tali regioni permette di trovare le modificazioni funzionali delle proteine che sono associate a malattie. Dovendo sequenziare solo circa 1/60 dell’intero genoma si ha la possibilità di avere una migliore accuratezza e di ridurre tempi e costi del sequenziamento. Per questo motivo il sequenziamento esomico è diventato uno dei metodi di diagnosi genetica più utilizzato dai medici (sopratutto nel caso in cui non ci siano ipotesi sui geni coinvolti nella malattia).
I progressi tecnologici raggiunti nel campo delle strategie di sequenziamento degli acidi nucleici ("Next Generation Sequencing", NGS) permettono oramai di ottenere con facilità le informazioni contenute all’interno dell’intero genoma umano. Ma solo una piccola percentuale (stimata a 1,6%) del genoma umano viene tradotto nelle proteine che fanno funzionare il corpo umano. Il sequenziamento esomico ("Whole exome sequencing") si concentra proprio sulle parti del genoma che codificano le proteine ("i geni") perché la ricerca di varianti in tali regioni permette di trovare le modificazioni funzionali delle proteine che sono associate a malattie. Dovendo sequenziare solo circa 1/60 dell’intero genoma si ha la possibilità di avere una migliore accuratezza e di ridurre tempi e costi del sequenziamento. Per questo motivo il sequenziamento esomico è diventato uno dei metodi di diagnosi genetica più utilizzato dai medici (sopratutto nel caso in cui non ci siano ipotesi sui geni coinvolti nella malattia).
2. IN COSA CONSISTE IL DNA
FINGERPRINTING
• Confrontare sequenze di DNA provenienti da due
campioni diversi
• Diverse applicazioni, sia in campo forense, sia nello studio
di malattie genetiche e di eventuali parentele
• La probabilità che due persone in un dato istante abbiano
lo stesso materiale genetico è praticamente nulla.
3. LE PRINCIPALI FASI DEL DNA
FINGERPRINTING
•Digestione con enzimi di restrizione
•Elettroforesi
•Marcatura ed analisi
4.
5. DIGESTIONE
• Trattazione con enzimi,
detti di restrizione
• Scissioni in specifici
punti lungo il filamento,
detti «siti di restrizione»
6. L’enzima può separare il
materiale con un taglio netto
(estremità «blunt ends») o
trasversale al filamento stesso
(estremità «sticky ends»)
7. ELETTROFORESI
• I vari frammenti possiedono una
carica negativa (gruppi fosfato nel
DNA)
• Dimensioni diverse tra i vari
frammenti
• Vaschetta con gel d’agarosio ,
campo elettrico e il bromuro di
etidio,
• I frammenti percorrono distanze
diverse
8.
9. MARCATURA
• Processo di blotting : nitrocellulosa
(+)
• Materiale genetico risale dalla vasca
• Vengono introdotte delle piccole
sequenze di DNA, dette sonde,
marcate con fosforo radioattivo o
sostanze fluorescenti
10.
11. ANALISI
• Come mai le bande differiscono?
Esiste il polimorfismo, che è
caratterizzato da:
1. RFLP
2. SNP
3. STR/VNTR
12. POLIMORFISMO
• Il polimorfismo di una particolare sequenza genetica è tale se
incide almeno sull’1% della popolazione
• Le sequenze polimorfiche possono essere osservate prima
del confronto con altri campioni o possono essere rilevate
nel processo.
• I caratteri polimorfici vengono trasmessi su due alleli
secondo le leggi di Mendel
13. RFLP
• Sequenze diverse, gli enzimi riconosceranno siti diversi su cui
effettuare la scissione del materiale genetico
• Questo fenomeno è detto RSP (restriction site polymorphism,
polimorfismo dei siti di restrizione)
• Vengono generati frammenti di lunghezza diversa, detti RFLP
(restriction fragment length polymorphism, polimorfismo da
lunghezza dei frammenti di restrizione).
14.
15. SNP
• Polimorfismo SNP (single nucleotide
polymorphism, polimorfismo da singolo
nucleotide)
• Un singolo nucleotide differisce più volte lungo il
materiale genetico.
• Se il corrispondente nucleotide è diverso da tutti
gli altri campioni allora si può escludere il
campione dal confronto
• Utile per creare sonde complementari specifiche
per il processo di marcatura.
16. STR/VNTR
• STR o micro-satelliti (short tandem repeat, brevi ripetizioni consecutive) e le
VNTR o mini-satelliti (variable number tandem repeat, ripetizioni a numero
variabile)
• Sequenze di basi di diversa lunghezza che sono ripetute consecutivamente
• Diversi individui potrebbero condividere la stessa sequenza, ma ripetuta un
numero diverso di volte
• La probabilità che due persone abbiano lo stesso profilo STR è di circa una su
10^13.
17. • Viene sfruttata la PCR (polymerase chain reaction)
• DNA polimerasi e primer, marcati
• Duplicazione rapida di materiale genetico
• Grande quantità di materiale => individuare rapidamente il numero di ripetizioni e
la sequenza che viene ripetuta
• Alcuni STR sono specifici del cromosoma Y => Y-STR