XI Lezione - Arabo LAR Giath Rammo @ Libera Accademia Romana
Dna finger print (2)
1. S
Creato da:
• Di Iorio Sasha
• Falcone Dennis
• Cichella Carlo Alberto
• Frisoli Francesco
• Pennese Davide
• D'angelo Nunzio
• Petrilli Francesco
2. Il polimorfismo di lunghezza di frammento di restrizione (RFLP) è una tecnica
inventata nel 1984 dallo scienziato inglese Alec Jeffreys durante la ricerca
sulle malattie ereditarie. È utilizzato per l'analisi dei reticoli unici nelle
sequenze di DNA per geneticamente differenziarsi fra gli organismi. Il
polimorfismo genetico è definito come le differenze genetiche ereditate fra le
persone dentro più di 1% di popolazione normale. La tecnica del RFLP sfrutta
queste differenze nelle sequenze del DNA per riconoscere e studiare sia la
variazione intraspecies che interspecies.
3.
4. ESTRAZIONE DEL DNA: Per cominciare con, il DNA è estratto da sangue,
dalla saliva o da altri campioni ed è depurato.
FRAMMENTAZIONE DEL DNA: Il DNA si digerisce facendo uso degli
enzimi di restrizione. I siti di riconoscimento di questi enzimi sono
generalmente 4 - 6 coppie di basi. Più breve la sequenza riconosciuta,
maggior il numero dei frammenti generati da digestione.
SEPARAZIONE TRAMITE FORESI
VISUALIZZAZIONE DELLE BANDE: Il gel è trattato con le tinture
luminescenti per rendere le bande del DNA visibili.
5. I microsatelliti o STR (Short Tandem Repeat)
Ripetizioni in tandem di brevi (2-5 bp) tratti nucleotidici
(repeat)
Il polimorfismo consiste nel diverso numero di copie della
repeat (= alleli diversi hanno lunghezza diversa)
Il numero degli alleli è generalmente elevato (talvolta molto
elevato)
Sono uniformemente distribuiti in tutto il genoma, nei primati
rappresentano ca. l’1% del genoma.
6. Piccola curiosità: Il microsatellite più frequente nell’uomo è la sequenza
dinucleotidica citosina-adenina (CA) ripetuta da 5 a 50 volte consecutive;
le ripetizioni sono presenti in media ogni 10.000 basi circa. In genere il
m. CA fiancheggia sequenze di DNA presenti una sola volta nel genoma,
dette sequenze uniche.
Hanno la funzione di marcatori del genoma identificabili mediante
analisi molecolari. Per es., quando è presente una malattia
ereditaria, si possono identificare negli individui affetti alcuni
marcatori molecolari che vengono ereditati insieme al gene mutato
responsabile della malattia, per poi localizzare il gene sul
cromosoma e procedere al suo sequenziamento;
Analisi di paterità: grazie ai microsatelliti possiamo escludere con
certezza la paternità di un individuo.
7. Il DNA fingerprinting
1. Estrazione del DNA
2. Digestione con enzimi di restrizione e separazione dei frammenti tramite
elettroforesi
3. Denaturazione e trasferimento su membrana
4. Ibridazione con una sonda multi-locus marcata con radioattivo
5. Autoradiografia per rilevare i frammenti a cui si è legata la sonda
8.
9. Paternità e maternità;
Medicina forense;
Identificazione personale: E’ stata presa in considerazione la
possibilità di utilizzare i DNA fingerprints come una sorta di codice a
barre per identificare gli individui. L’applicazione di questa tecnica su
larga scala nell’immediato futuro è in corso di valutazione;
10. Potere di discriminazione elevato
Sensibilità limitata (richiede grandi quantità di DNA mg, cioè
ca. 106 cellule)
Tecnica lunga e non automatizzabile
Analizza DNA a elevato peso molecolare: non adatto per
campioni degradati
Pattern multi-bande di non facile interpretazione (base
molecolare del polimorfismo non nota)
Problemi per l’interpretazione statistica (una corrispondenza che
valore statistico, e quindi probatorio, ha?)
Editor's Notes
e i prodotti ottenuti vengono incubati con un enzima di restrizione in grado di riconoscere una sequenza specifica e di catalizzare una reazione di taglio al suo interno
Per esempio, se c'è una breve sequenza di GAGC che si presenta ripetutamente in un campione di DNA. L'endonucleasi della restrizione che riconosce la sequenza di GAGC taglia il DNA ad ogni ripetizione del reticolo di GAGC.
Se un campione ripete la sequenza di GAGC 4 volte mentre un altro campione la ripete 2 volte, la lunghezza dei frammenti generati dall'enzima per i due campioni sarà differente.