2. Il DNA fingerprinting è stato ultilizzato per la
prima volta come tecnica di identificazione nel
1985.
Originariamente utilizzato per rilevare la
presenza o meno di malattie genetiche, è in
seguito risultato utile per le indagini criminali.
La prima prova per una condanna criminale,
basata su test del DNA negli Stati Uniti, si è
presentata nel 1988. Nelle indagini criminali, le
impronte digitali del DNA sono state derivate
dalle prove raccolte sulla scena del crimine, e
confrontate con le impronte digitali del DNA dei
sospetti. La prova del DNA può condannare o
meno un sospettato.
3. Il Dna finger-printing è un metodo di identificazione che consiste nel comparare
frammenti di DNA provenienti da diversi individui. La prima operazione da
eseguire è estrarre un campione di Dna da un tessuto o da un liquido del corpo. Il
campione deve essere ora suddiviso utilizzando enzimi di restrizione. Il processo
avviene in tre fasi:
Digestione;
Elettroforesi;
Colorazione.
4. Il campione deve essere ora suddiviso
utilizzando enzimi di restrizione, la
cosiddetta digestione, i siti di restrizione
sono i punti dove gli enzimi di restrizione
vanno a tagliare, la differenza che si
evidenzierà sarà la frammentazione: due
Dna uguali produrranno lo stesso
numero di frammenti con lo stesso peso
molecolare.
5. Il campione di DNA raccolto viene amplificato selettivamente tramite PCR
(Polymerase Chain Reaction): una miscela contenente il DNA campione, dei primer,
dei singoli nucleotidi e la polimerasi estratta da batteri termoresistenti viene
scaldata prima a 94° C, causando la denaturazione del DNA poi raffreddata a 45° C,
permettendo ai primer di legarsi al DNA campione, e infine riscaldata a 72° C,
temperatura alla quale la polimerasi sintetizza una nuova sequenza di DNA tra i
primer. Si produce così, su ogni filamento di DNA originale, un filamento “copia”,
frammentato in corrispondenza dei primer. Siccome i primer si legano alle
estremità degli STR o VNTR, di lunghezza diversa da individuo a individuo, anche i
frammenti prodotti avranno lunghezze caratteristiche per ogni individuo. Questo
ciclo di temperature viene ripetuto decine di volte, in modo da amplificare il DNA
(riprodurlo esponenzialmente).La miscela di frammenti ottenuta dalla PCR deve
essere separata per poter distinguere i frammenti di diversa lunghezza.
6.
7. I campioni di Dna precedentemente preparati sono posti nella cella elettroforetica.
Essa consiste in una vaschetta con due elettrodi alle estremità, nel mezzo della
quale vi è l’alloggiamento per una lastrina quadrata di gel. Tutto questo è immerso
in una soluzione di TBE. Il TBE è una soluzione tampone a pH 8; questo ambiente
rende il DNA carico negativamente ed in grado dunque di essere attirato dal polo
positivo. TBE sta per TRIS (un gruppo di composti), Acido Borico (HBO2) ed EDTA
(etilen di-ammino tetra acetico). Il gel è composto di acqua distillata
e agaribosio (0,8% in peso), uno zucchero che a questa concentrazione crea una
matrice, una sorta di rete, che gelifica la soluzione. Se il mezzo è sufficientemente
viscoso le molecole più piccole (che offrono meno resistenza) migreranno più
rapidamente delle molecole più grandi.
8.
9. ‘'Short Tandem Repeat’’ sono polimorfismi di lunghezza, legati al numero variabile
di unità ripetitive presenti nei diversi alleli. In relazione alle piccole dimensioni
della sequenza di base, possiedono un’ unità di ripetizione comprese tra le due e le
sette paia di basi, con lunghezza massima di circa 350 paia di basi. I microsatelliti
sono distribuiti uniformemente su tutto il cromosoma e ricorrono ogni 10.000
nucleotidi. Attualmente si conoscono migliaia di loci STR, molti di essi sono
sufficientemente caratterizzati dal punto di vista molecolare e sono utilizzati per la
mappatura fisica del genoma umano o come marcatori di malattie genetiche.
10. ‘’Variable number of tandem repeats’’ che in genetica molecolare indica una
sequenza di DNA (ca 20 nucleotidi) ripetuta in tandem, presente in numero
variabile in punti specifici del genoma. Le variazioni nel numero delle ripetizioni
creano frammenti di DNA di diversa lunghezza dopo la digestione con enzimi di
restrizione. Ogni individuo pertanto presenterà frammenti di diversa lunghezza che
è possibile riconoscere con specifiche sonde molecolari. In tal modo si analizzano le
cosiddette impronte del DNA, metodo utile, per es., per il riconoscimento della
paternità.
11. Un campione di DNA genomico viene trattato con enzimi di restrizione e
successivamente sottoposto ad elettroforesi su gel di agarosio o
pilicrilammide. Nel gel sarà possibile osservare una striscia continua; il
DNA ha tantissimi punti di taglio, quindi sul gel si troveranno tantissimi
frammenti che migreranno con velocità diverse in base al diverso peso
molecolare.
Il gel viene immerso in una soluzione per denaturare il DNA; solitamente si
tratta di una soluzione molto diluita di NaOH per un tempo pari a 15
minuti.Il gel viene coperto da un foglio di nitrocellulosa a carica positiva e
sopra di questo viene posta una pila di fogli assorbenti.
Per capillarità la soluzione tenderà ad attraversare il gel, il foglio di
nitrocellulosa e risalirà nei fogli assorbenti. I sali trascinano i segmenti di
DNA perfettamente in verticale, depositandoli sullo strato di nitrocellulosa
con il quale i segmenti instaurano legami elettrostatici (dovute al fosfato
negativo).
12. Il foglio di nitrocellulosa viene separato dal gel e vengono saturate le
cariche positive con DNA eterologo (solitamente DNA da salmone);
processo di preibridizzazione.
Il foglio di nitrocellulosa viene quindi immerso in una soluzione
contenente una sonda marcata (fluorescente o radioattiva) che
ibridizza con sequenze di DNA complementari presenti sul foglio,
identificandole. A seguito del lavaggio della nitrocellulosa per
eliminare le sonde non ibridate, si fa una lastra fotografica che metta
in evidenza dove la sonda ha legato il DNA genomico.
