Εργαστηριακή διάγνωση των Gram (+) σπορογόνων αναερόβιων μικρ/σμων

1. ΑΝΑΕΡΟΒΙΟΙ ΜΙΚΡ/ΣΜΟΙΑΝΑΕΡΟΒΙΟΙ ΜΙΚΡ/ΣΜΟΙ
CLOSTRIDIUMsp.CLOSTRIDIUMsp.
ΑΝΑΕΡΟΒΙΟΙ ΜΙΚΡ/ΣΜΟΙΑΝΑΕΡΟΒΙΟΙ ΜΙΚΡ/ΣΜΟΙ
CLOSTRIDIUMsp.CLOSTRIDIUMsp.
Βασιλική Χ. Πιτυρίγκα
Επικ. Καθ. Μικροβιολογίας,
Ιατρική Σχολή
Email: vpitiriga@med.uoa.gr

2. ΑΝΑΕΡΟΒΙΑ ΜΙΚΡΟΒΙΑ ΕIΝΑΙ…
Τα μικρόβια που αναπτύσσονται σε:
 Ατμόσφαιρα πτωχή σε Ο2 ή χωρίς οξυγόνο
 Σε χαμηλό οξειδοαναγωγικό δυναμικό

3. ΑΝΑΕΡΟΒΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ
ΑΡΧΗ:
 ΑερόβιαΑερόβια βακτήριαβακτήρια -- ΟΞΕΙΔΩΣΗ→
Τελικός δέκτης e το Ο2.
 Γλυκόζη→ co2 και H2O-
 ΑναερόβιαΑναερόβια βακτήριαβακτήρια -- ΖΥΜΩΣΗ→
Τελικός δέκτης e οι ανόργανες
ουσίες (θειϊκά, ανθρακικά, νιτρικά
άλατα).
 Γλυκόζη → πυροσταφυλικό οξύ
ATP 32ATP 32
ATP 2ATP 2

5. ΑΠΟΥΣΙΑ ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΩΝ
ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ
 Δισμουτάση του υπεροξειδικού ανιόντος: O2 + O2
+ 2H+ →
H2O2 + O2
 Καταλάση : 2H2O2
→
2H2O+ O2
 Υπεροξειδάση του Κυτοχρώματος C
→ διάσπαση Η2Ο2+οξείδωση οργανικών ουσιών
ΒακτηριακοΒακτηριακο
ς θανατοςς θανατος

6. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΣΕ ΥΓΡΟ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ
1: Υποχρεωτικώς αερόβια αναπτύσσονται στην κορυφή του σωληναρίου.
(Pseudomonas aeruginosa).
2: Υποχρεωτικώς αναερόβια (Clostridium tetani). O2 <0.05%
3: Δυνητικά αναερόβια κυρίως στην κορυφή (Ο2) αλλά και χωρίς οξυγόνο (Escherichia
coli, Staphylococcus aureus).
4: Μικροαερόφιλα στην κορυφή αλλά όχι επιφανειακά (Ο2 σε συγκεκριμένη
ποσότητα). <21% O2; typically 2-10% O2
5: Αεροανεκτικά (Aerotolerant) αναερόβια δεν χρησιμοποιούν Ο2 αλλά δεν
επηρεάζονται από αυτό.

7. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ
ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ
 Gram(+) βακτήρια σπορογόνα (Clostridiumsp)
 Gram(+) βακτήρια μη σπορογόνα (Actim o m yce s sp,
Pro pio nibacte rium sp, Lacto bacillus sp, )
 Gram(+) κόκκοι
(Pe pto stre pto co ccus sp, Pe pto co ccus sp. )
 Gram(-) κόκκοι
(Ve ilo ne lla sp. )
 Μη σπορογόνα Gram(-) βακτήρια
(Bacte ro ide s sp. , Fuso bacte rium sp. , Po rphyro m o nas )

8. ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΑ
 Οικογένεια Clo stridiace ae
 203 είδη
 5 υποείδη
 Gram (+)
 Βακτηρίδια μεγάλα, ευθέα, ή
και με ελαφρά κάμψη-σχήμα
ατρακτοειδές
 Βλαστικές μορφές-σπόροι
 Ισχυρές εξωτοξίνες και ένζυμα
 Δυνητικά παθογόνα-εξαιρετικά
παθογόνα-αβλαβή
σαπροφυτικά
Κλωστηρ =άτρακτος
αδράχτι

9. ΕΝΔΟΣΠΟΡΙΑ
Ωοειδείς-σφαιρικοί
Κεντρικοί , τελικοί ή
υποτελικοί
Προκαλούν ή όχι
διόγκωση κυττάρου
 Υποτελικοί →
Clostridium
botulinum
 Κεντρικοί → C.
perfringens, C.
botulinum
 Σφαιρικοί τελικοί →
Clostridium tetani

10. ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΑ
 Αυστηρά αναερόβια, (C.
novyii type A, C.
hemolyticus)
Ορισμένα:
 μικροαερόφιλα (C.
tertium, C. histolyticum),
 Αεροανεκτικά
 Κινητά μέσω βλεφαρίδων
(εκτός C. perfringens C.
ramosum C.
innocuum)
 Gram(+)
 Gram (-) (C. ramosum C.
Innocuum)
 Αποχρωματισμός παλιών
καλλιεργημάτων (C. tetani
C.difficile C. septicum)
 Gram ποικίλα
(variable)
 Gram(+)
 Gram (-) (C. ramosum C.
Innocuum)
 Αποχρωματισμός παλιών
καλλιεργημάτων (C. tetani
C.difficile C. septicum)
 Gram ποικίλα
(variable)
Καταλάση (-)
Οξειδάση (-)

11. ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ
Εκτεταμένη διασπορά στη φύση:
 Έδαφος (κοπριά)
 Πεπτικό σωλήνα άνθρωπου και
ζώων ως φυσιολογική χλωρίδα
 Σε αυξημένα φορτία σε κόπρανα
νεογνών
 Νερά υπονόμων
 Γλυκό νερό ιζήματα θαλάσσιων
νερών
 Τρόφιμα

12. ΤΟΞΙΝΕΣ
 ΙΣΧΥΡΕΣ εξωτοξίνες και ένζυμα:
 Λεκιθινάση
 Κολλαγενάση
 Υαλουρονιδάση
 Δεσοξυριβονουκλεάση
 Νευραμινιδάση
 Αιμολυσίνες
 Αντιγονικές –παραγωγή αντισωμάτων –
ταυτοποίηση ταξινόμηση κλωστηριδίων

13. ΚΛΙΝΙΚΑ ΣΗΜΑΝΤΙΚΑ ΕΙΔΗ
 Ομάδα υπεύθυνη για αεριογόνο γάγγραινα
 Κλωστηρίδιο το διαθλαστικό ή Clostridium
perfringens
 Κλωστηρίδιο το σηπτικό ή Clostridium septicum
 Κλωστηρίδιο το ιστολυτικό C. histo lyticum
 Κλωστηρίδιο το οιδηματογόνο ή Clostridium
oedematiens
 Κλωστηρίδιο της αλλαντιάσης ή Clostridium
botulinum
 Κλωστηρίδιο του τετάνου ή Clostridium tetani
 Κλωστηρίδιο το δύσκολο ή Clostridium difficile

14. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΒΑΣΕΙ ΤΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ
ΖΥΜΩΤΙΚΟΣ
 Σακχαρολυτικά –ζύμωση
σακχάρων
 Προϊόντα μεταβολισμού : οξέα, CO2 H2-
 Απουσία δυσοσμίας
 Πρωτεολυτικά –αποικοδόμηση
πρωτεϊνών –
 προϊόντα μεταβολισμού: πτητικά λιπαρά
οξέα, αμίνες, υδρόθειο
 Ρευστοποιουν πηγμα ορου αιματος ή
πηγμα γαλακτος
 Δυσοσμία
Ωστόσο ορισμένα
είδη:
• Πρωτεολυτικά+
ζυμωτικά (C. sporogens, C.
perfringens)
• Αζυμωτικά –μη
πρωτεολυτικά

15. ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΑΠΟ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΑ
 Ενδογενείς:
 Πηγή: χλωρίδα του ασθενούς
 Εξωγενείς:
 Πηγή: περιβάλλον
 Μεικτές (ενδοεξωγενεις)
 C. difficile

16. Συνθήκες ανάπτυξης λοιμώξεων από
CLOSTRIDIA
 Διαταραχή ισορροπίας εντερικής φυσιολογικής χλωρίδας
αερόβιων- αναερόβιων
 Σε περιοχές του σώματος με:
 Ιστική καταστροφή (νέκρωση) (τραύμα) ή
 Ελαττωμένη αιματική ροή
Επικρατεί
 Υποξία και
 Ελαττωμένο οξειδοαναγωγικό δυναμικό
Ευνοϊκές
συνθήκες για
ανάπτυξη
αναεροβίων

17. ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ
 Χειρουργικές επεμβάσεις παρακάμψεις, συρίγγια,
τραύματα, κατακλίσεις)
 Συστηματικές ή τοπικές νόσοι (σκληρόδερμα, λέμφωμα,
Σ. διαβήτης)
 Τροφικές ελλείψεις (ασιτία, υπολευκωματιναιμία,
αλκοολισμός)
 Φάρμακα (αντιβιοτικά)

18. ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ
 Αεριογόνος γάγγραινα
 Σηπτικές λοιμώξεις
 Τροφικές δηλητηριάσεις
 C. perfringens + C. botulinum
 Αλλαντίαση: C. botulinum
 Τέτανος: C. tetani
 Ψευδομεμβρανώδης κολίτιδα
–διάρροια εξ αντιβιοτικών
C.
Pe rfring e ns
(80%)
 C. novyi
 C. septicum
 C. fallax
 C. tertium
 C. histolyticum
 C. bifermentans
 C. sporogenes

19. ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΣΕ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ
 Πενικιλλίνη
 Ερυθρομυκίνη
 Τετρακυκλινη
 Βανκομυκίνη
 Κινολόνες
 Καρβαπενέμες
 Μετρονιδαζόλη
 Κλινδαμυκίνη
 Χλωραμφαινικόλη
 Penicillin + clindamycin > single therapy with metronidazole,
clindamycin, rifampin or penicillin.
 Penicillin + metronidazole <
Stevens DL et al. Antimicrob Agents Chemother 1987;31:312-6Stevens DL et al. Antimicrob Agents Chemother 1987;31:312-6

20. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ
ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ

21. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ
CLOSTRIDIA
ΔΥΣΧΕΡΗΣ
 Απαιτείται:
 Καταλληλότητα του δείγματος:
 Ορθή συλλογή, μεταφορά
 Ειδικός εργαστηριακός εξοπλισμός-Συνθήκες
απουσίας Ο2
 Εμπειρία στην επεξεργασία των δειγμάτων
 Θρεπτικές απαιτήσεις μικρ/σμών -Αργή
ανάπτυξη
 Άμεση επεξεργασία δειγμάτων (εντός 2 ωρών)-
 Αν όχι, διατήρηση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος

22. ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ
ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ:
 Ιστορικό ασθενούς
 Προσεκτική παρατήρηση βλάβης
 Λήψη ιδανικού δείγματος
 Σωστή μεταφορά δειγμάτων στο εργαστήριο
 Λήψη αιμοκαλλιεργειών

23. ΛΗΨΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ
 Αποστήματα: καθαρισμός της επιφάνειας του τραύματος με
70% αιθυλική αλκοόλη, ιωδιούχο διάλυμα
 Αφού στεγνώσει ξανά με 70% αιθυλική αλκοόλη.
 Διάνοιξη τραυματος με νυστερι
 Λήψη υλικού με σύριγγα
ΑΡΙΣΤΟ ΥΛΙΚΟΑΡΙΣΤΟ ΥΛΙΚΟ::
ΒΙΟΨΙΕΣ +ΒΙΟΨΙΕΣ +
ΥΓΡΟ ΣΕΥΓΡΟ ΣΕ
ΣΥΡΙΓΓΑΣΥΡΙΓΓΑ

24. ΠΥΟΝ, ΑΠΟΣΤΗΜΑ – ΒΑΘΥ ΤΡΑΥΜΑ

25. ΛΗΨΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ-ΑΝΤΙΣΗΨΙΑ
ΝΑ ΑΠΟΦΕΥΓΕΤΑΙ Η ΛΗΨΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΜΕ ΣΤΥΛΕΟ:
 Όχι αντιπροσωπευτικό δείγμα
 Επιμόλυνση από επιφάνεια του τραύματος
Ωστόσο επειδή είναι ο συνήθης τρόπος...
 Στυλεός: βαμβάκι με κοκκία άνθρακα/ίνες
αλγινικού ασβεστίου
 Υλικό μεταφοράς με χαμηλό οξειδοαναγωγικό
δυναμικό. (Cary-Blair, e.g. BBL™ Port-a-cul™
or Anaerobic Systems ATM

26. ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΙΣΤΟΥ ΓΙΑ ΑΝΑΕΡΟΒΙΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ

27. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ-ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ
Α. Κλινικές πληροφορίες
Β. Μακροσκοπική-μικροσκοπική εξέταση κλινικού
δείγματος
Δ. Καλλιέργεια απομόνωση μικ/σμου
από:
 σηπτικές φλεγμονές,
 κόπρανα
Ε. Ταυτοποίηση (προκαταρκτική-τελική)

28. Α. ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ
 Λοίμωξη κοντά σε επιφάνεια
βλεννογόνου
 Δυσοσμία εξιδρώματος ή εκκρίματος
 Νέκρωση ιστών και δημιουργία
αποστημάτων
 Αέριο στους ιστούς ή τα εκκρίματα
 Γάγγραινα
 Λοίμωξη μετά από χρήση αντιβιοτικών
δραστικών έναντι των αεροβίων (πχ
αμινογλυκοσιδών)

29. B.ΜΑΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ
ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ
 Μαύρα, πυώδη ή αιματηρά εξιδρώματα
 Δυσοσμία
 Πιθανόν φθορισμός (έκθεση σε λάμπα φθορισμού)
 Παραγωγή αερίου

30. Γ. ΑΜΕΣΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΤΟΥ
ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ
 Νωπό: Μικροσκόπηση σε Phase contrast και σε
σκοτεινό πεδίο:
 Παρατήρηση των σπόρων
 Εκτίμηση κινητικότητας

31. ΑΜΕΣΗ ΧΡΩΣΗ GRAM: ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ
 Gram (+) βακτηριδία μεγάλα με τετραγωνισμένα
άκρα, σπορογονα ή μη
 Απουσία λευκοκυττάρων
 Παρουσία μυϊκών ινών
 Συνύπαρξη πολλών ειδών μικροβίων
 Gram (+) βακτηριδία μεγάλα με τετραγωνισμένα
άκρα, σπορογονα ή μη
 Απουσία λευκοκυττάρων
 Παρουσία μυϊκών ινών
 Συνύπαρξη πολλών ειδών μικροβίων
ΕΙΚΟΝΑ ΜΥΟΝΕΚΡΩΤΚΗΣ
ΑΕΡΟΓΟΝΟΥ ΓΑΓΓΡΑΙΝΑΣ
Gram stain
 Αμφίβολη: αποχρωματισμός σε παλιά
καλλιεργήματα
 Δ.Δ. Clo stridium spe cie s Bacte ro ide s≠

32. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ
 C. perfringens: Gram (+)
βακτηρίδια μεγάλα με
τετραγωνισμένα άκρα χωρίς
σπόρους
 C. septicum: Μακρύ λεπτό
πολύμορφο νηματοειδές με
υποτελικούς ωοειδείς σπόρους
 C. novyi: Mεσαίου μεγέθους με
υποτελικούς ωοειδείς σπόρους
 C. difficile: Μακρύ λεπτό, με
υποτελικούς ωοειδείς σπόρους

33. Clostridium tetani

34. ΧΡΩΣΕΙΣ ΕΝΔΟΣΠΟΡΙΩΝ
 Schaeffer–Fulton stain (malachite green
+0.5% safranin)
 Moeller stain (Carbol fuchsin + Methylene blue)

37. Δ. ΚΑΛΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ - ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ
 Παρουσία αιμίνης (5 μg/ml) και βιταμίνης Κ
(1μg/ml)
 Στερεά- ζωμοί
 Ιδανικά υλικά τα λιγότερο εκτεθειμένα σε Ο2→
φρέσκα, προανηγμένα
* Φρέσκα ή προανηγμένα: υγρά → βρασμός, στερεά →
διατήρηση σε αναερόβιες συνθήκες

38.  Columbia αγαρ
 CDC anaerobe blood
agar
 ΒΑ: Brucella agar +
5 % αίμα+ Κ1 +
αιμίνη
 Schaedler blood agar
 Απαραίτητο το τεστ
αεροβιωσης –
αναπτύσσονται και
αερόβια
 Ζωμός από εκχύλισμα καρδιάς
και εγκεφάλου (brain heart
infusion) εμπλουτισμενος με
κυστείνη
 Columbia ζωμός
 TB: Θειογλυκολικός ζωμός με
ή χωρίς δείκτη+ Κ1 + αιμίνη+
τρίμματα μαρμάρου
 Ζωμός με κρέας κιμά
 Chopped meat carbohydrate
 Chopped meat -glycose
ΚΟΙΝΑ*ΚΟΙΝΑ*ΚΟΙΝΑ*ΚΟΙΝΑ* ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΤΙΚΑΕΜΠΛΟΥΤΙΣΤΙΚΑΕΜΠΛΟΥΤΙΣΤΙΚΑΕΜΠΛΟΥΤΙΣΤΙΚΑ
* Αίμα : προβάτου, ίππου, κουνελιού

39. ΕΚΛΕΚΤΙΚΑ-ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΤΙΚΑΕΚΛΕΚΤΙΚΑ-ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΤΙΚΑ
 EYA (Egg yolk agar)-κροκός αυγού + λακτόζη
 PEA (Phenylethyl alcohol Agar): Αιματούχο άγαρ
προβάτου
 Εξουδετερώνει τον ερπυσμό
 CCFA (Cycloserine-cefoxitin fructose agar)
 Clostridium difficile agar
 Trypto se Sulphite Cyclo se rine (TSC)
 Shahadi Fe rg uso n Pe rfring e ns (SFP) ag ar

40. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ
Συνδυασμός θρεπτικών υλικών
 Υγρών – στερεών
 Κοινών - εκλεκτικών

42. ΕΠΩΑΣΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ
 Jars → 48h (όχι
νωρίτερα)
 Θάλαμοι αναερόβιων
συνθηκών → ανά 24h
 Φάκελοι επώασης ανά
24h

43. ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΥΠΑΡΞΗΣ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΣΤΗΝ
ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ-ΖΩΜΟΙ
Α) Θρεπτικός ζωμός Cooked Meat
• Θόλωση μετά από 48h →μικροβιακή ανάπτυξη
• Πρωτεόλυση
- μαύρη ή γκρίζα βλεννώδης περιοχή στον πυθμένα
-ελάττωση της ποσότητας του κρέατος
-οσμή σάπιου κρέατος
-μάζες κρυστάλλων τυροσίνης που μεγαλώνουν όσο μένουν
στην καλλιέργεια→ χιονισμένη επιφάνεια π.χ. C. histolyticum
-αέριο
• Σακχαρόλυση
- αέριο
- αλλαγή χρώματος (ροζέ) λόγω αναγωγής της αιματίνης
• Λιπόλυση
- βουτυρώδης αφρός στην επιφάνεια του ζωμού

44. ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΥΠΑΡΞΗΣ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ-
ΣΤΕΡΕΑ ΘΡ. ΥΛΙΚΑ
 Άσχημη μυρωδιά με
το άνοιγμα της jar
 Παρατήρηση στα
στερεά υλικά
 Στα κοινά: ανάπτυξη
πολλών ειδών
 Στα εκλεκτικά υλικά:
Ανάπτυξη αναερόβιων
 Μέγεθος
 Όψη
 Επιπλέον χαρακτηριστικά
• Χρωστική,
• Φθορισμός
• Αιμόλυση,
• Οσμή

45. Ε. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ
Α) ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΗ
Β) ΤΕΛΙΚΗΒ) ΤΕΛΙΚΗ

46. ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ:
Clostridium sp (από καθαρό καλλιέργημα)
 Χρώση Gram
 Περιγραφή της
αποικίας-οσμή
 Έλεγχος κινητικότητας
 Έλεγχος αεροβίωσης
 Δίσκοι ειδικής
περιεκτικότητας
(Vancomycin 5 μg, Kanamycin
1000 μg, Colistin 10 μg)
 Αναγωγή νιτρικών
 Λιπάση –Λεκιθινάση
 Παραγωγή ινδόλης
 Καταλάση
 Φθορισμός
 Παραγωγή ουρεάσης
 Δοκιμασία παραγωγής
σπόρων (alcohol
shock)
 Ανάστροφη CAMP
 Nagler test

47. ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΗ
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ

48. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΙΚΙΩΝ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ
 Μεγάλες ριζοειδείς
(Clostridium sp)
 Μεγάλες αποικίες με
διπλή ζώνη αιμόλυσης
(C. perfringens, C.
novyi )
 Ερπύζουσες αποικίες
(C. septicum, C.
tetani, C. sordellii, C.
sporogenes)
 Χαρακτηριστική οσμή
(στάβλου αλόγων, C.

50. ΧΡΩΣΗ GRAMαπό καλλιέργημα:
Clo stridium te tani

51. BOX
CARS
BOX
CARS

52. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΜΕ ΔΙΣΚΟΥΣ ΕΙΔΙΚΗΣ
ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ (SPECIAL POTENCY DISKS)
 Βlood Αgar.
 Colistin (10 μg),
 kanamycin (1 mg),
 vancomycin (5 μg) στο πρώτο
τεταρτημόριο
 Αναερόβια επώαση x 48h /
35o C
 Ανάγνωση : ≤10mm R,
≥10mm S
 Gram(+) anaerobes: Vanc:
S-Col: R
ΔΙΑΦ. ΔΙΑΓΝΩΣΗΔΙΑΦ. ΔΙΑΓΝΩΣΗ GG
(+) /G(-)(+) /G(-)
ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ
(ΑΜΦΙΒΟΛΗ(ΑΜΦΙΒΟΛΗ ΧΡΩΣΗΧΡΩΣΗ
GRAMGRAM))

54. ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ
EYA (Egg yolk agar)
 Λεκιθινάση → λευκή,
αδιαφανής κάτω και
γύρω από την αποικία
 Λιπάση → ιριδίζουσα
επιφάνεια
 Πρωτεόλυση → διαυγής
άλως γύρω από την
αποικία

56. ΛΕΚΙΘΙΝΑΣΗ (+) C. perfringens

61. ΤΕΛΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ
 Πλήρες βιοχημικό προφίλ - Συστήματα βιοχημικής
ταυτοποίησης
 Παρουσία ενζύμων- Ενζυμικά συστήματα ταυτοποίησης
αναεροβίων
 Προσδιορισμό λιπαρών οξέων κυτταρικού τοιχώματος-
Fatty Acids Methyl Ester(FAME) Analysis
 Προσδιορισμό λιπαρών οξέων/τελικών προϊόντων
μεταβολισμού- Αέρια υγρά χρωματογραφία
 Προσδιορισμό τοξινών
 Πλήρες βιοχημικό προφίλ - Συστήματα βιοχημικής
ταυτοποίησης
 Παρουσία ενζύμων- Ενζυμικά συστήματα ταυτοποίησης
αναεροβίων
 Προσδιορισμό λιπαρών οξέων κυτταρικού τοιχώματος-
Fatty Acids Methyl Ester(FAME) Analysis
 Προσδιορισμό λιπαρών οξέων/τελικών προϊόντων
μεταβολισμού- Αέρια υγρά χρωματογραφία
 Προσδιορισμό τοξινών

62. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΤΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ
 Βιοχημικές διαδικασίες
(σάκχαρα, ινδόλη, ουρία,
ζελατίνη)
 ΑΡΙ20Α(BioMerieux,
Inc.)
 Minitek (BD
Biosciencens)
Προβλήματα
 Αναερόβια επώαση του
strip (24 – 48h)
 Αντίδραση ινδόλης
ψευδώς θετική
 Απαιτούνται επιπλέον
δοκιμασίες (πχ.
καταλάση)
 Ορισμένα σακχαρολυτικά
αλλοιώνουν τους δείκτες
→ δυσκολία στην
ανάγνωση

63. ΕΝΖΥΜΑΤΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ
ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ
Δράση των προσχηματισμένων
βακτηριακών ενζύμων
 Anaerobe ANI card (BioMerieux, Inc.)
 Rapid ID 32A (BioMerieux, Inc.)
 Rapid Anaerobe ID (Dade MicroScan,
Inc.)
 Crystal Anaerobe ID kit (BD
Biosciences)
 RapID – ANA (Remel, Inc.)

64. ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ
 ∆εν απαιτούν μικροβιακή ανάπτυξη
 Επώαση αερόβια
 Ταυτοποίηση σε 4h
 Καλή ταυτοποίηση απαιτητικών / α-σακχαρολυτικών
 Πολλά στελέχη ταυτοποιούνται χωρίς επιπλέον βιοχημικές

66. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΞΙΝΩΝ
 Τοξίνη Α C. difficile (ELISA, ανοσοχρωματική)
 Τοξίνες Α και Β C. difficile (ELISA,
ανοσοχρωματική)
 Τοξίνη Β C. difficile (κυτταροκαλλιέργεια)
 Τοξίνες Α, Β, ∆ιαδική (PCR)
 Τοξίνες C. botulinum (PCR)
 Αδρανοποίηση τοξινών σε πειραματόζωα μετά από
έγχυση αντιτοξινων

67. ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ
Commercial identification Systems
 Pulsed- Field Gel Electrophoresis (PFGE),
 Fluorescent Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP),
 16S rDNA gene sequencing,
 PCR- restriction fragment length Polymorphism (PCR-
RFLP),
 Microarray analysis,
 Multiple-Locus Variable-Number Tandem-Repeat
Analysis (MVLA),
 whole-genome sequencing (WGS)
 Matrix-Assisted LaserDesorption/Ionisation - Time of
Flight (MALDI-TOF)

68. CLOSTRIDIUMCLOSTRIDIUM
PERFRINGENSPERFRINGENS

69. Clostridium perfringens
Κλωστηρίδιο το διαθλαστικό
 Μεγάλο (2.4μm πλατος-19.0μm
μηκος), ορθογώνια άκρα
 Gram (+)
 Ακίνητο
 Αεροανεκτικό (aerotolerant)
 Έλυτρο:
 Ναι στο σημείο της λοίμωξης
 Όχι στα θρεπτικά υλικά
 Στις ιστικές φλεγμονές δεν
παράγει σπόρους
 Σπόροι ωοειδείς, κεντρικοί ή
υποτελικοί δεν προκαλούν
διόγκωση

70. Clo stridium
pe rfring e ns
 Το Clo stridium που
απομονώνεται πιο συχνά
 Η 3η συχνότερη αιτία τροφικής
δηλητηρίασης UK και USA
 Generation time: 6,3 ‘ σε
thioglycollate broth (20 -50°C-
optimum 45°C)

71. ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΟΙ ΤΥΠΟΙ
 5 αντιγονικοί τύποι A-E
 με βάση την ικανότητα ειδικών αντι-ορών να
εξουδετερώνουν τις θανατηφόρες τοξίνες
 Τύπος Α: αεριογόνο γάγγραινα
 Τύποι B, D, και E: εντερίτιδα και
εντεροτοξιναιμία στα βοοειδή και στα
πρόβατα
 Τύπος C: νεκρωτική εντεροκολίτιδα στον
άνθρωπο

72. 73
Clostridiaperfringens α-toxin
Α-toxin
 Φωσφολιπάση
 Λεκιθινάση: Διασπά τη λεκιθίνη του αυγού
(lecithinase C)
 Υδρολυσίνη: Διασπά τις κυτταρικές μεμβράνες
RBC, WBC και μυϊκών ινών

73. 74
Clostridiaperfringens
β-to xin - Α2 υποτύπος
 Εντεροτοξίνες
θ-to xin
 Αιμολυσίνη
Ένζυμα
 Κολλαγενάση
 Δεσοξυριβονουκλεάση
 Υαλουρονιδάση
 Πρωτεάσες

74. ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ
 Τροφική δηλητηρίαση
 Αεριογόνος γάγγραινα
 Νεκρωτική εντεροκολίτιδα

76. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ
 Μικροσκοπική εξέταση κλινικού δείγματος με
χρώση Gram
 Καλλιέργεια, απομόνωση-ταυτοποίηση
 Κόπρανα
 Σηπτικές φλεγμονές
 Ανίχνευση τοξίνης
Σωστή ΛΗΨΗ
και
ΜΕΤΑΦΟΡΑ
κλινικού
δείγματος!!!

77. ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ
 Κοινά
 Cooked meat broth
 Thiglyclolate broth
 Εκλεκτικά
 Trypto se Sulphite (TS) ag ar
 Trypto se Sulphite
Cyclo se rine (TSC)
 TSC-egg yolk agar
 Shahadi Fe rg uso n Pe rfring e ns
(SFP) ag ar anaerobic jar 24 h at 35°C
Μαύρες
αποικίες
Μαύρες
αποικίες

78. ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΑΠΟΙΚΙΩΝ
 Αποικίες 2 – 4 mm,
 Ημιδιαφανείς, κυκλικές
ομαλές μερικές με
γραμμώσεις
 β- αιμόλυση
 Ορισμένα είδη →
βλεννώδεις αποικίες

79. ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΤΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ
 Motility-nitrate agar
(buffered)
 24 h at 35°C
ΑΚΙΝΗΤΟΑΚΙΝΗΤΟ

80. Ανάστροφη δοκιμασία CAMP (Reverse CAMP
test)
Sheep blood agar 37o C for 24-48 hours in anaerobic conditions
Alpha- toxin produced by C. perfringens interacts
with CAMP factor and produce synergistic hemolysis

81. NAGLERS
ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ
 Η παραγωγή λεκιθινάσης
αναστέλλεται παρουσία
αντιορου της α-τοξινης
 Egg yolk agar
 Μισή επιφάνεια : 2-3
σταγόνες αντιτοξίνης
 37ο
C x 48h
Α-τοξίνη του Cl.perfringens
Α-τοξίνη του Cl.perfringens

82. ΔΙΠΛΗ ΖΩΝΗ ΑΙΜΟΛΥΣΗΣ (Target hemolysis)
 Αιματούχο προβάτου,
κονίκλου, βοός,
 Στενή ζώνη της πλήρους
αιμόλυσης : θ-τοξίνη
 Ευρεία ατελής ζώνη της
αιμόλυσης: α-τοξίνη
 >24 h επώαση
μειώνεται το φαινόμενο

83. Lactose-gelatin media
 24 hours x 37ºC.
 Έλεγχος παραγωγής αερίου
 Ζύμωση λακτόζης-Χρώμα από κόκκινο σε
κίτρινοκίτρινο
 Ψύξη 1 h - 5°C – έλεγχος για
ρευστοποίηση
 Αν ρευστοποίηση (+): επιπλέον 24 h at
35°C και επανελεγχος.
Clostridiumperfringens
 Non-motile bacteria
 blackcolonies in Tryptose Sulfite
Cicloserine Agar
 liquefy gelatine in 48 hours
 24 hours x 37ºC.
 Έλεγχος παραγωγής αερίου
 Ζύμωση λακτόζης-Χρώμα από κόκκινο σε
κίτρινοκίτρινο
 Ψύξη 1 h - 5°C – έλεγχος για
ρευστοποίηση
 Αν ρευστοποίηση (+): επιπλέον 24 h at
35°C και επανελεγχος.
Clostridiumperfringens
 Non-motile bacteria
 blackcolonies in Tryptose Sulfite
Cicloserine Agar
 liquefy gelatine in 48 hours

84. 89
Cooked meat broth
 Παραγωγή
αερίου
 Δεν πέπτει το
κρέας –
σακχαρολυτικό

85. 90
Litmus milk
 Ζυμώνει τη λακτόζη →
παραγωγή οξέος και
αερίου → Παραγωγή
πήγματος γάλακτος

86. CLO STRIDIUM
DIFFICILE

87.  Αυστηρά αναερόβιο βακτήριο
 Περίτριχο, κινητό
 Gram (+)
 Σπορογόνο
 Ωοειδής υποπολικοί σπόροι
 Εξωτοξίνες
•
Τοξίνη Α: Εντεροτοξίνη
•
Τοξίνη Β: Κυτταροτοξίνη
•
Δυαδική τοξίνη (binary toxin):
•
20% των στελεχών

88. CLOSTRIDIUMDIFFICILE
Το κύριο αίτιο λοιμώδους διάρροιας σε νοσηλευόμενους παγκοσμίως.
ΕΝΔΟΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΟΣ
ΑΠΟΙΚΙΣΜΟΣ
ΕΞΩΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΟΣ
Περιβάλλον
– Τρόφιμα
SOS
5-70% βρέφη <=1 έτους-φυσ. χλωρίδα
SOS
5-70% βρέφη <=1 έτους-φυσ. χλωρίδα

89. ΚΥΡΙΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ ΓΙΑ
CDAD
 Παρατεταμένη
νοσηλεία
 Ηλικία >65
 Σοβαρή υποκείμενη
νόσος
 Καταστολή έκκρισης
γαστρικού οξέος
XΡΗΣΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝXΡΗΣΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ

90. •
IgG προστατευτική
αντιτοξίνη A
ΣΥΧΝΕΣ ΟΙ ΥΠΟΤΡΟΠΕΣΣΥΧΝΕΣ ΟΙ ΥΠΟΤΡΟΠΕΣΣΥΧΝΕΣ ΟΙ ΥΠΟΤΡΟΠΕΣΣΥΧΝΕΣ ΟΙ ΥΠΟΤΡΟΠΕΣ

91. ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΔΟΚΙΜΑΣΙΑ
ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ
ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ
PCR-LAMPPCR-LAMP
ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ γλουταμινικής
δευδρογενάσης immunoassay
ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ γλουταμινικής
δευδρογενάσης immunoassay
ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ
ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ
ΔΙΑΓΝΩΣΗ

92. ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ ΕΛΕΓΧΟΥ
Ο έλεγχος περιορίζεται σε ασθενείς:
–
Ασθενείς >1έτος
–
Ιστορικό λήψης αντιμικροβιακών
–
Διαρροϊκό σύνδρομο
–
>=3 διαρροϊκές κενώσεις /24 h

93. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ
Αύξηση ευαισθησίας
 Προεμπλουτισμός σε υγρά θρεπτικά υλικά
 Προεργασία: shock αιθανόλης –θέρμανση
(καταστροφή των βλαστικών μορφών)
 Αναερόβια προ-επώαση
 Επεξεργασία με ταυροχολικό Να –
(εκβλάστηση σπόρων)
CCFA agar (cycloserine cefoxitine fructose
agar)
Gold standard

94. ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ
 Κοινά
 CDC anaerobe blood agar
 Εκλεκτικά- διαφοροποιητικά
 Egg Yolk
 Phenylethyl alcohol blood agar
(PEA): αναστέλλει τον ερπυσμό
γενικα των κλωστηριδιων
 BBL™ Clostridium difficile Selective
Agar
 Cycloserine –Cefoxitin Fructose
Agar. Κίτρινες αποικίες με κίτρινο
φθορισμό

95. Cycloserine –Cefoxitin Fructose
Agar
 Αποικίες μεγάλες κιτρινωπές
χαμηλές κυκλικές ριζοειδείς
προσεκβολές
 Οσμή κρεσόλης
 Sensitivity 2000 bacteria/g
of stool
ΤΟΞΙΝΟΓΟΝΟΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΤΟΞΙΝΟΓΟΝΟΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ
Έλεγχος παραγωγής τοξίνης
Επιβεβαιωτικά τεστ
EIA–PCR–τεστ κυτταροτοξικότητας

96. Πλεονεκτήματα
• Ταχείες
• Οικονομικές
• Ευκολη διαδικασία
• Φτηνός εξοπλισμός
Μειονεκτήματα
Επηρεάζονται από:

Παρεκκλίσεις από διαδικασίες
πρωτοκόλλου

Λανθασμένες τεχνικές εκτέλεσης

Λάθος χειρισμός δείγματος
Χρήζουν επιβεβαιωτικά τεστ
ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ
•
Παρουσία τοξίνης C. diff A και B ή/και GDH
στα κόπρανα
Ευαισθησία-ειδικότητα:
Μεγάλες διακυμάνσεις

97. Ανίχνευση γλουταμινικής δευδρογενάσης
(EIAs for GDH)
•
Μεταβολικό ένζυμο
•
Παράγεται από την πλειοψηφία στελεχών C.
Difficile- τοξινογόνα και μη στελέχη
•
Ευαισθησία υψηλή ~88–90%
SCREENINGSCREENING
TESTTEST -1-1ΟΟ
ΒΗΜΑΒΗΜΑ
ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ

98. Two-step or three-step testing
algorithm
 Μη ικανοποιητική απόδοση των μεμονωμένων
δοκιμών
 Εισαγωγή εξεταστικών αλγόριθμων σε δύο ή τρία
στάδια
 Αρχική διαλογή με τεστ ανοσοχρωματογραφίας
 ανίχνευση C. difficile GDH ή τοξίνες Α-Β
 (+) δείγματα: Επιβεβαιωτικά τεστ
 Τοξινογόνο καλλιέργεια
 PCR
 Τεστ κυτταροτοξικότητας

99. Βήμα 1: Ανίχνευση GDHΑνίχνευση GDH
Βήμα 2: Κ-τοξινογόνος ΚαλλιέργειαΚ-τοξινογόνος Καλλιέργεια
+
- ΑΠΟΥΣΙΑ
CD
-+
NON
TOXIGENIC
STRAIN
TOXIGENIC
CD STRAIN
Two-Step Test

100. CANCERIntratumoral injectionCANCERIntratumoral injection
of of ClostridiumnovyiClostridiumnovyi-NT spores induces-NT spores induces
antitumorresponsesantitumorresponses
CANCERIntratumoral injectionCANCERIntratumoral injection
of of ClostridiumnovyiClostridiumnovyi-NT spores induces-NT spores induces
antitumorresponsesantitumorresponses
 The researchers first made sure they genetically modified
the bacteria to make it less toxic, then used it to infect
tumors (direct injection) that were growing in live patients:
16 pet dogs and one human. The human patient’s tumor
that was treated with bacteria shrank, while other tumors in
the patient’s body continued to grow. Three of the dogs
were cured of cancer completely, and three others saw
their tumors shrink by at least 30 percent.
 C. novyi is that it only operates in oxygen-free (anerobic)
environments. This held true when researchers found some of
the tumors who supported oxygen didn’t show any sign of
shrinking.
 The research suggests that bacteria, when engineered to
reduce toxicity, can be a viable fighting tool against cancer,
one with less destructive side effects than chemotherapy.
 The researchers first made sure they genetically modified
the bacteria to make it less toxic, then used it to infect
tumors (direct injection) that were growing in live patients:
16 pet dogs and one human. The human patient’s tumor
that was treated with bacteria shrank, while other tumors in
the patient’s body continued to grow. Three of the dogs
were cured of cancer completely, and three others saw
their tumors shrink by at least 30 percent.
 C. novyi is that it only operates in oxygen-free (anerobic)
environments. This held true when researchers found some of
the tumors who supported oxygen didn’t show any sign of
shrinking.
 The research suggests that bacteria, when engineered to
reduce toxicity, can be a viable fighting tool against cancer,
one with less destructive side effects than chemotherapy.
Ref: Nicholas J. Roberts, et al. Sci Transl Med 13 August
2014:
Vol. 6, Issue 249, p. 249