Περιγραφή των βασικότερων εργαστηριακών μεθόδων στη διάγνωση των λοιμώξεων

1. ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ
ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ
Βασιλική Πιτυρίγκα
Ιατρός Βιοπαθολόγος,
Eπικ. Καθ. Μικροβιολογίας Ε.Κ.Π.Α.
Email: vpitiriga@med.uoa.gr

2. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ
 Υπάρχει μικροοργανισμός ή όχι?
 Ποιος είναι?
 Είναι ευαίσθητος σε αντιμικροβιακά ή όχι?
Βασικός στόχος ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ
ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ-ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ-ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ
ΜΙΚΡ/ΣΜΟΥ

3. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ
Χρησιμοποιούνται δοκιμασίες που στηρίζονται σε :
 Μορφολογικά χαρακτηριστικά (Μορφολογία στη
χρώση Gram)
 Καλλιεργητικά χαρακτηριστικά
 Μεταβολικές ιδιότητες Βιοχημική ταυτοποίηση
 Έλεγχο διαφόρων αντιγονικών παραγόντων
Ορολογική ταυτοποίηση / τυποποίηση
 Την ανίχνευση χαρακτηριστικών αλληλουχιών
βάσεων στο γενετικό υλικό των μικροοργανισμών
Μοριακή ταυτοποίηση / τυποποίηση

4. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΝΩΠΟΥ
ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ
ΑΜΕΣΗ ΑΝΑΖΗΤΗΣΗ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ

5. ΑΜΕΣΗ ΑΝΑΖΗΤΗΣΗ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ
Μικροσκόπηση
 Νωπό
 Κεχρωσμένο παρασκεύασμα
Τι μελετάμε?
 Παρουσία ή όχι
μικροοργανισμών
 Μορφολογία-σχήμα
 Διάταξη
 Δομή

6. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΝΩΠΟΥ
ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ
Μικροσκόπηση κλινικού
δείγματος χωρίς
επεξεργασία
Με NaCl 0,85%
Για εξέταση ζώντων
μικρ/σμών

7. Πλεονεκτήματα
 Ταχεία-ανέξοδη διαδικασία
 Απουσία ή ελάχιστα artifacts
 Ζωντανοί και κινούμενοι
μικρ/σμοί
 Φυσικά χρώματα
 Δυνατότητα ταχύτατης
διάγνωσης. Πχ. τριχομονάδωση
Μειονέκτημα: στεγνώνει εύκολα

8. ΜΕΘΟΔΟΣ ΚΡΕΜΑΣΤΗΣ ΣΤΑΓΟΝΑΣ
(HANGING DROP METHOD)
 Σκοπός: Έλεγχος
κινητικότητας
μικροβίων
 Ζώντες μικρ/σμοι
 Διαχωρισμός παθητικής
και τρομώδους κίνησης
Brown από την
ενεργητική κίνηση με
συγκεκριμένη
κατεύθυνση/ταχύτητα

9. HANGING DROP METHOD
Πλεονεκτήματα:
 Διάταξη- σχήμα -
κινητικότητα μικρ/σμών
• Η προσθήκη βαζελίνης
επιβραδύνει την
αφυδάτωση του
δείγματος.
Μειονεκτήματα:
 Πολύ επικίνδυνη για
ιδιαίτερα παθογόνα
μικρόβια

10. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΝΩΠΟΥ
ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ
Με διάλυμα ΚΟΗ 10%
 Λέπια δέρματος, νύχια, τρίχες
 Διαλύει την κερατίνη και τα
περισσότερα οργανικά
υποστρώματα του κλινικού
δείγματος εκτός από τους μύκητες
(χιτίνη κυτταρικού τοιχώματος)
 Η διαύγαση του κλινικού δείγματος
ενισχύεται με θέρμανση
http://www.mycology.adelaide.edu.au
http://www.microbelibrary.org

11. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΝΩΠΟΥ
ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ
Αντίδραση εξοίδησης του ελύτρου
(Neufeld’s quellung reaction)
• Με ορό που περιέχει ομόλογο αντικαψιδικό αντίσωμα
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae
• Μικροσκόπηση με x1000
ΤΕΧΝΙΚΗ:
Σε αντικειμενοφόρο πλάκα πυκνό εναιώρημα από το
καλιέργημα
Ή το παθολογικό υλικό (πολλές σταγόνες)+τους
πολυδύναμους αντί-ορούς κατά των αντιγόνων του
ελύτρου, καλυπτρίδα, σε τρυβλίο με βρεγμένο βαμβάκι,
στον κλίβανο 37ΟC για 30 min.
Μικροσκοπούμε για διόγκωση των κυττάρων σε σχέση με το
μάρτυρα.
http://cid.oxfordjournals.org

12. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΝΩΠΟΥ
ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ
Σκοτεινό οπτικό πεδίο
(Dark field examination)
• Treponema palidum: λευκά
διαθλαστικά σωμάτια που
κινούνται
• Εξίδρωμα από το συφιλιδικό
έλκος μικροσκόπηση με x400 ή
x1000 και συμπυκνωτή
σκοτεινού πεδίου
http://helid.digicollection.org

13. MΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ ΑΝΤΙΘΕΣΗΣ ΦΑΣΗΣ
(PHASE CONTRAST)
 Παρατήρηση ζώντων ευκαρυωτικών κυττάρων/
μικροοργανισμών (κυτταρικά οργανίδια)
 Δε συνιστάται για τη παρατήρηση μονιμοποιημένων και χρωματισμένων
τομών ιστών
Ενδοσπόρια μυκήτων

14. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΝΩΠΟΥ
ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ
Κυανό του μεθυλενίου

15. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΝΩΠΟΥ
ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ
Με διάλυμα ιωδίου
(Lugol’s iodine, αραιωμένο 1:5)
• Κόπρανα: πρωτόζωα ή ωάρια
ελμίνθων
 χρωματίζονται οι πυρήνες
και τα κυτταροπλασματικά
στοιχεία
• Κοκκία αμύλου
Κύστεις Entamoeba coli
(http://www.atlas-protozoa.com)

16. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΝΩΠΟΥ
ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ
Με σινική μελάνη ή νιγροσίνη
(India Ink Preparation)
• Ανίχνευση των ελυτροφόρων
κυττάρων
• Cryptococcus neoformans
• Σε ΕΝΥ, πτύελα, άλλες εκκρίσεις
• Το έλυτρο δεν προσλαμβάνει τα
σωματίδια του άνθρακα της
σινικής μελάνης, έτσι
δημιουργείται μια διαυγής άλως
γύρω από τα κύτταρα
Έλυτρο Klebsiella pneumoniae
http://inst.bact.wisc.edu

17. ΧΡΩΣΕΙΣ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ

19. Χρωστικές
Φέρονται με τη μορφή σκόνης ή κρυστάλλων
 Φυσικές
• Ζωικής
• Φυτικής προέλευσης (αιματοξυλίνη, καρμίνιο)
 Τεχνητές (με τη μορφή αλάτων)
• Βασικές
• Όξινες
• Ουδέτερες
 Χρωστικά διαλύματα
• Μητρικά διαλύματα: κορεσμένα διαλύματα χρωστικών σε
αιθυλική αλκοόλη 950
• Υδατικά διαλύματα: αραίωση μητρικών διαλυμάτων με
αποσταγμένο νερό

20. Χρωστικές
Βασικές:
 Αποτελούνται από θετικό ιόν -αυξόχρωμη ομάδα
(cationic auxochrome)
 κυανό του μεθυλενίου,
 κρυσταλλικό ιώδες,
 κυανό της τολουϊδίνης,
 ιώδες της γεντιανής,
 πράσινο του μαλαχίτη,
 σαφρανίνη,
 θειονίνη,
 βασική φουξίνη

21. Χρωστικές
Όξινες:
 Αποτελούνται από αρνητικό ιόν-αυξόχρωμη ομάδα
(anionic auxochrome)
 κυανό του μεθυλίου,
 όξινη φουξίνη,
 ηωσίνη

22. ΧΡΩΣΤΙΚΕΣ
Ουδέτερες:
 Προέρχονται από ανάμιξη βασικής και όξινης
χρωστικής
 Για τη χρώση και του πυρήνα και του
κυτταροπλάσματος (χρώση παρασίτων και
αίματος)
 Romanowsky: ηωσίνη και κυανό του μεθυλενίου
 Giemsa: ηωσίνη και κρυσταλλικό ιώδες

23.  Τα περισσότερα μικρόβια χρωματίζονται
με τις βασικές χρωστικές της ανιλίνης
 περιέχουν μεγάλο ποσό ριβονουκλεϊνικών
οξέων και
 η βακτηριακή επιφάνεια είναι αρνητικά
φορτισμένη και απωθούνται οι όξινες
χρωστικές

24. ΧΡΩΣΕΙΣ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ
 Απλές (βασικές χρωστικές)
 κυανό του μεθυλενίου, βασική φουξίνη,
κρυσταλλικό ιώδες
 Μορφολογία των βακτηρίων (σχήμα, διάταξη)
 Σύνθετες (συνδυασμός χρωστικών)
 Ειδικές
 Ανάδειξη τμημάτων των μικροοργανισμών ή
οργανιδίων (ενδοσπόρια, μαστίγια, έλυτρα)

25. ΧΡΩΣΕΙΣ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ
 Θετικές: χρωματίζονται τα κύτταρα
των βακτηρίων
◦ Απλές: κυανό του μεθυλενίου
◦ Σύνθετες: Gram, Ziehl-Neelsen
Corynebacterium diphtheriae
Mycobacterium tuberculosisStreptococcus pyogenes

26. ΧΡΩΣΕΙΣ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ
 Αρνητικές: χρωματίζεται το περιβάλλον
του βακτηρίου ενώ το κύτταρο
παραμένει άχρωμο
◦ Διάλυμα σινικής μελάνης ή νιγροσίνης
Cryptococcus neoformans

28. ΧΡΩΣΗ GRAM-ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ
Gram (-) Gram (+)
Gram (-)
 Μεγαλύτερη παθογονικότητα
 Παρουσία ενδοτοξινών (λιποπολυσακχαρίτες
εξ. μεμβράνης)
Gram (+)
 Πιο μικρής παθογονικότητας λοιμώξεις
 Το κυτταρικό τοίχωμα πιο ευάλωτο σε ένζυμα
του οργανισμού (λυσοζύμη)
 Πιο εύκολη αντιμετώπιση με αντιμικροβιακά

29. ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ GRAM
POSITIVE
 Παχύ στρώμα
πεπτιδογλυκάνης (παχιά
άκαμπτη δομή).
 Η πεπτιδογλυκάνη
(μουρείνη) αποτελείται
από επαναλαμβανόμενους
δισακχαρίτες
συνδεδεμένους με
πολυπεπτίδια
 τειχοϊκά οξέα
-αρνητικό φορτίο
-αντιγονική ειδικότητα

30. GRAM NEGATIVE ΒΑΚΤΗΡΙΑ
 Έχουν λεπτό στρώμα
πεπτιδογλυκάνης που
συνδέεται με λιποπρωτείνες
της εξωτερικής μεμβράνης
και βρίσκεται στον
περιπλασμικό χώρο.
 Εξωτερική μεμβράνη από
λιποπολυσακχαρίτες–LPs,
λιποπρωτείνες,
φωσφολιπίδια
(αρνητικό φορτίο, αντιγονική
ειδικότητα)
 Όχι τειχοϊκά οξέα.

31. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΧΡΩΣΗΣ
Διαφορετική χημική και δομική σύσταση του κυτταρικού τοιχώματος:
 Προσθήκη δυο χρωστικών διαδοχικά Κρυσταλλικό ιώδες (Crystal
violet) + Διάλυμα ιωδίου (Lugol )
 Σχηματίζεται μέσα στο κύτταρο ένα αδιάλυτο σύμπλοκο ιωδίου-
κρυσταλλικού ιώδους,
 Αποχρωματισμός με αλκοολούχο διάλυμα
 Gram (-) βακτήρια: Εξουδετέρωση εξ. μεμβράνης από αλκοόλη,
απομάκρυνση συμπλόκου
 Gram (+) βακτήρια: αφυδάτωση κυττάρου με την αλκοόλη,
κλείνουν οι πόροι των τοιχωμάτων και το σύμπλοκο εγκλωβίζεται.
 Προσθήκη σαφρανίνης

32. ΧΡΩΣΗ GRAM
Χρωστικές:
Αποχρωματισμός με οινόπνευμα
1. Κρυσταλλικό ιώδες (Crystal violet)
2. Διάλυμα ιωδίου (Lugol )
3. Σαφρανίνη (Safranine)
Παραγωγή
συμπλόκου

34. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
 Gram-θετικά
μικροοργανισμοί –μπλε
 Gram-αρνητικά
μικροοργανισμοί -
κόκκινο/ροζ
 Gram ποικίλλοι
(variable)
μικροοργανισμοί
 Δύσκολα χρωματιζόμενοι
μικροοργανισμοί
 Μη χρωματιζόμενοι
μικροοργανισμοί

35. Ευρήματα- εκτίμηση
ΤΗΣ ΧΡΩΣΗΣ GRAM
Περιγραφική ως προς τη μορφολογία
 Σχήμα— round (cocci) rods (bacilli)
 Μέγεθος, μικροβιακό φορτίο, διάταξη
 Παρουσία ενδοκυττάριων μικροοργανισμών
 Παρουσία RBC και WBC
 Gram (+) κόκκοι: σε ζευγάρια, σε αλυσίδες σε συστάδες
 Gram (+) κοκκοβακτηρίδια, βάκιλλοι, βακτηρίδια
κορυνόμορφα σε σχηματισμούς ή κινέζικα γράμματα
 Gram (-) διπλόκοκκοι βακτηρίδια νηματοειδή βακτηρίδια
κοκκοβακτηρίδια με πολυμορφισμό
 Βλαστοκύτταρα μυκήτων με εκβλαστήσεις /υφές

36. ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ-ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ ΧΡΩΣΗΣ
 Μικρές συγκεντρώσεις του μικροοργανισμού δεν είναι σπάνιες
(πρώιμη ή υπό θεραπεία μηνιγγίτιδα).
 Άτυπες μορφολογίες μικροβίων μετά από λήψη αντιβιοτικών -
Γερασμένα ή τραυματισμένα βακτηρίδια που είναι κανονικά gram-
θετικά εμφανιζονται gram-μεταβλητά ή ακόμα και gram-negative,
πιθανώς επειδή οι τοίχοι κυττάρων τους είναι πιό διαπερατοί στον
αποχρωματίσμό. Το αντίθετο δεν συμβαίνει σε Gram-αρνητικά
βακτηρια.
 Παρατήρηση περισσότερων του ενός πεδίων –αναζήτηση
περισσότερων ειδών μικροοργανισμών
 Προσεκτικός έλεγχος του πεδίου. Μικροί πολυμορφικοί Gram-
negative οργανισμοί, όπως του Haemophilus ή των Bacteroides,
συχνά παραβλέπονται ειδικά όταν συνυπάρχουν Gram-θετικά
βακτήρια.
 Παρουσία ή απουσία WBC στην Gram: Δείκτης λήψης επαρκούς
ποσότητας δείγματος από σημείο φλεγμονής.
 Η Nocardia και ο Actinomyces: βάφονται αχνά Gram-θετικά

37. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ
 Αποτελέσματα από κοινού με άλλα κλινικά και εργαστηριακά
ευρηματα.
 Επιβεβαίωση ευρημάτων με άλλες τεχνικές (e.g., special stains,
direct antigen tests, inclusion of selective media, etc.)
 Προσεκτική εκτέλεση διαδικασίας και εφαρμογή κριτήριων στην
ερμηνεία. Χρειάζεται εμπειρία!
 Εφαρμογή πρόσθετων χρώσεων σε απουσία ευρημάτων σε πυώδη
δείγματα
 Δείγματα με Gram (+) μικρόβια, και αρνητική καλλιέργεια:
επιμόλυνση αντιδραστηρίων, αντιβιοτική λήψη, απαιτητικού
μικροβίου
 Παρουσία μυκήτων στη χρώση-ασυμφωνια με κλινική εικόνα-υποψια για
επιμόλυνση αντιδραστηρίων
http://www.med-chem.com/pages/lab_procedures/pdf/gram_stain.pdf

38. ΚΛΙΝΙΚΗ ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΧΡΩΣΗΣ GRAM
 Άμεση αναγνώριση μικροοργανισμού (πιο
γρήγορη από την καλλιέργεια)
 Αξιολόγηση καλλιέργειας
 Καθοδήγηση της θεραπευτικής αγωγής
 Συμβολή στην πρόγνωση και θεραπεία

39. ΧΡΩΣΗ Ziehl-Neelsen οξεάντοχη
Οξεάντοχες χρώσεις
Οξεαντοχή είναι η φυσική ιδιότητα ορισμένων
μικροοργανισμών να μην αποχρωματίζονται κατά
τη διαδικασία της χρώσης κατόπιν επεξεργασίας
με οξέα

41. ΧΡΩΣΗ Ziehl-Neelsen οξεάντοχη
 Franz Ziehl (1859 to 1926), μικροβιολόγος και
 Friedrich Neelsen (1854 to 1894), παθολόγος.
Αντιδραστήρια
 Φαινικούχος φουξίνη
 Οξινισμένη αλκοόλη (με πυκνό HCl)
 Κυανούν του μεθυλενίου

43. ΧΡΩΣΗ Ziehl-Neelsen οξεάντοχη
Αρχή
Το μυκολικό οξύ όταν χρωματίζεται εν θερμώ με μια βασική
χρωστική ουσία (φαινικούχο φουξίνη) σχηματίζει ένωση που
δεν αποχρωματίζεται με ισχυρά οξέα

44. ΚΛΙΝΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ
 Πτύελα
 Βρογχοκυψελιδικά εκπλύματα
 Ούρα
 ΕΝΥ
 Υγρό παρακέντησης ορογόνων κοιλοτήτων
 Αίμα (σπανιότερα)

48. Χρώση Ziehl-Neelsen
Τα μυκοβακτηρίδια αποκτούν ένα ζωηρό κόκκινο χρώμα, η
μορφολογία χαντρών –κοκκίων οφείλεται στην ανομοιογένεια
της έντασης της χρώσης

50. ΧΡΩΣΗ Ziehl-Neelsen οξεάντοχη
Περιορισμοί
 Μικρή ευαισθησία <70%. Αριθμός μικροβίων στο δείγμα >50.000/ml
(μετά από εμπλουτισμό χαμηλότερο όριο ανίχνευσης)
 Διάγνωση και άλλων οξεάντοχων μικροβίων (νοκάρδιες)
 Ειδικότητα μικρότερη της καλλιέργειας (τα νεκρά κύτταρα
χρωματίζονται ενώ δεν καλλιεργούνται).
 Δεν διαχωρίζει τα μυκοβακτηρίδια
 Δεν υπάρχει δυνατότητα ελέγχου της ευαισθησίας του
μυκοβακτηριδίου στα φάρμακα.
Πλεονεκτήματα
 Σε δείγματα στείρα μικροβιακής χλωρίδας η ανίχνευση είναι
απολύτως διαγνωστική
 Ταχύτερη της καλλιέργειας
 Ιδιαίτερα βοηθητική στην παρακολούθηση της θεραπείας
(προηγείται της κλινικής βελτίωσης)

51. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ
 Artifacts
 Πρόσμιξη τροφών
 Επιμολύνσεις
 Λάθη στις τεχνικές
εμπλουτισμού και
χρώσεων
 Ακατάλληλο κλινικό δείγμα
 Ανεπαρκής ποσότητα
 Συνθήκες και χρόνος
φύλαξης
 Μικρός αριθμός
μυκοβακτηριδίων
 Ανεπαρκής χρόνος
 Έλλειψη εμπειρίας
 Λάθη στον εμπλουτισμό, στις
χρώσεις και χρωστικές
Ψευδώς θετικά Ψευδώς αρνητικά

52. ΑΛΛΕΣ ΟΞΕΑΝΤΟΧΕΣ ΧΡΩΣΕΙΣ
 Τροποποιημένη Zielh–Neelsen
Αποχρωματισμός με Η2SO4 2 -3 %
διάλυμα αποχρωματισμού μικρότερης
οξύτητας
Nocardia, Rhodococcus, Tsucamurella,
Gordonia, Diezia
 Κατά Kinyoun
Ιδιαίτερο διάλυμα φαινικούχου
φουξίνης (μεγαλύτερη συγκέντρωση
φαινόλης και βασικής φουξίνης)
 Όχι θέρμανση
 Αποχρωματισμός με Η2SO4 1 %

53. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ

54. ΚΑΛΛΙΕΡΓΗΤΙΚΑ
(ΘΡΕΠΤΙΚΑ) ΥΛΙΚΑ
 Τεχνητά υλικά που περιέχουν θρεπτικές
ουσίες και παράγοντες κατάλληλους για την
ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των
μικροβίων

55. ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΓΙΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ
 Απομόνωση μικροβίων σε καθαρό καλλιέργημα.
 Ανάδειξη μακροσκοπικών χαρακτηριστικών.
 Παραγωγή ικανής ανάπτυξης για προετοιμασία
αντιγόνικων τεστ.
 Προσδιορισμός ευαισθησίας σε αντιβιοτικά.
 Εκτίμηση των ζώντων μικροβίων
 Φύλαξη μικροβίων για μεγάλο χρονικό διάστημα

56. ΚΛΙΝΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ
 Αίμα
 ΕΝΥ
 Ουρά
 Κολπικά, ουρηθρικά
 Φαρυγγικά πτύελα, βρογχικές εκκρίσεις κλπ.
 Τραύματα, πύον
 Ιστικά παρασκευάσματα

57.  Τεχνητά θρεπτικά υλικά
 Κυτταροκαλλιέργειες (βακτήρια, ιοί)
 Εμβρυοφόρα αβγά (ιοί)
 Πειραματόζωα (βακτήρια, μύκητες,
ιοί, παράσιτα)
Στην καθημερινή πράξη χρησιμοποιείται
μόνο η καλλιέργεια σε τεχνητά θρεπτικά
υλικά

58. πεπτόνες (τρυπτόζη, τρυπτόνη, πρωτεόζη)
εκχύλισμα κρέατος (Bacto-Beef-Extract)
εκχύλισμα μυκήτων (Yeast Extract)
Σάκχαρα (τροφή ή μελέτη βιολογικών ιδιοτήτων)
άγαρ (στερεωτικό ζωμού, όχι τροφή για
μικρόβια)
αναγωγικές ουσίες (αναερόβιο περιβάλλον)
Θειογλυκολικό ή θειοθειϊκό Na, κυστεΐνη,
ασκορβικό οξύ
εκλεκτικές ουσίες ή εκλεκτικά μίγματα
(χρωστικές, άλατα, pH, αντιβιοτικά,
εμπλουτιστικές ουσίες)
χρωματομετρικοί δείκτες (ερυθρό της φαινόλης,
ιώδες της βρωμοκρεσόλης, ουδέτερο ερυθρό)
ΠΡΩΤΕΣ ΥΛΕΣ ΘΡΕΠΤΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝ

59. ΔΙΑΚΡΙΣΗ ΘΡΕΠΤΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝ
ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ
ΣΥΣΤΑΣΗ ΣΥΝΘΕΣΗ
ΥΓΡΑ ΣΤΕΡΕΑΗΜΙΡΡΕΥΣΤΑ ΚΟΙΝΑ ΕΙΔΙΚΑ ΣΥΝΘ.ΤΑΥΤΟΠ.
ΘΡΕΠΤΙΚΟΣ ΖΩΜΟΣ - ΑΓΑΡ ΕΚΛΕΚΤΙΚΑ
ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΤΙΚΑ
ΔΙΑΧΩΡΙΣΤΙΚΑ
ΣΥΝΤΗΡΗΤΙΚΑ

60. ΔΙΑΚΡΙΣΗ ΘΡΕΠΤΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝ
Σύσταση
 Υγρά (χωρίς άγαρ)
 θρεπτικός ζωμός
 θειογλυκολικός ζωμός
 αλκαλικό πεπτονούχο νερό
 Ημίρρευστα (άγαρ 0.3-0.5%)
 motility άγαρ, Stuart
 Στερεά (άγαρ 1.5-2%)
 αιματούχο
 σοκολατόχρωμο
 MacConkey άγαρ
 Mueller-Hinton άγαρ

61. Υγρά θρεπτικά υλικά
(θρεπτικά συστατικά + απεσταγμένο νερό) δεν περιέχουν άγαρ.
Διάχυτη ανάπτυξη μικροβίων
 Προετοιμασία εναιωρημάτων,
 Καλλιέργειες στείρων βιολογικών υγρών (αίμα)
 Τεμάχια ιστού από χειρουργεία
Στερεά θρεπτικά υλικά
(θρεπτικά συστατικά + απεσταγμένο νερό + άγαρ σε αναλογία 1,5-2%)
Απομονωμένες αποικίες
 Μορφολογία αποικιών
 Παραγωγή χρωστικών
 Αιμόλυση
Ημίρρευστα θρεπτικά υλικά
(θρεπτικά συστατικά + απεσταγμένο νερό+ άγαρ σε αναλογία 0,5%).
 Π.χ.: υλικά ελέγχου κινητικότητας

62.  Υγρά υλικά
 Μεγαλύτερη ευαισθησία-εμπλουτισμός
 Πρέπει να καλλιεργηθούν σε στερεά υλικά
για ταυτοποίηση
 Ψευδώς θετικά!
 Στερεά υλικά
 Ποσοτικοποίηση μικροβίων
 Δυνατότητα οπτικής ταυτοποίησης

63. ΔΙΑΚΡΙΣΗ ΘΡΕΠΤΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝ
 ΜΗ ΕΚΛΕΚΤΙΚΑ: Δεν περιέχουν αναστολείς. Eπιτρέπουν την ανάπτυξη
των περισσοτέρων μικροοργανισμών (αιματούχο & σοκολατόχρωμο
άγαρ)
 ΕΚΛΕΚΤΙΚΑ: Περιέχουν ανασταλτικές ουσίες. Eπιτρέπουν την ανάπτυξη
των βακτηρίων εκλεκτικά (MacConkey άγαρ, KVLB άγαρ)
 ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΤΙΚΑ: Περιέχουν ουσίες που καταδεικνύουν ιδιότητες
των βακτηρίων (MacConkey άγαρ, Chapman)
 ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΤΙΚΑ: Περιέχουν ουσίες που καταστέλλουν την ανάπτυξη
συγκεκριμένων βακτηρίων και προάγουν την ανάπτυξη άλλων (ζωμός
σεληνίτη)
 ΣΥΝΤΗΡΗΣΗΣ: Περιέχουν συστατικά για επιβίωση μικροβίων για
μεγάλο χρονικό διάστημα (Stuart, Amies, Cary-Blair,Skim milk, Brucella
broth, Γλυκερόλη)
Σύνθεση

64. ΜΗ ΕΚΛΕΚΤΙΚΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ
ΥΛΙΚΑ
 Αιματούχο (αίμα προβάτου, ίππου,
ανθρώπου)
(για όλα τα δείγματα)
 Gram (+) βακτήρια
 Gram (-) βακτήρια
 α, β, γ αιμόλυση
 Σοκολατόχρωμο (για δείγματα από
στείρες περιοχές, γεννητικό,
αναπνευστικό σύστημα) (C02,5-10%)
 Gram (+) βακτήρια,
 Gram (-) βακτήρια
 H. influenzae,
 N. gonorrhoeae

65. ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ
Περιέχουν ουσίες που καταστέλλουν την ανάπτυξη
συγκεκριμένων βακτηρίων και προάγουν την
ανάπτυξη άλλων (ζωμός σεληνίτη)
Χρησιμοποιούνται:
Για την απομόνωση μικροβίων από μικτές χλωρίδες
Για να αναπτυχθούν μικρόβια που είναι απαιτητικά
ως προς τις θρεπτικές ανάγκες τους.
Π.χ:
Selenite F Broth – για την απομόνωση των
Salmonella και Shigella
Alkaline Peptone Water – για το Vibrio
cholerae

66. ΕΚΛΕΚΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ
 Περιέχουν ανασταλτικές ουσίες
 Eπιτρέπουν την ανάπτυξη των βακτηρίων εκλεκτικά
Π.χ.:
 Mac Conkey’s medium για τα gram (-)
βακτηρίδια
 SS agar για τη σαλμονελλα-σιγκελα
 TCBS – για το V. cholerae

67. TCBSMac Conkey’ s άγαρ

68. ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΤΙΚΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ
 Περιέχουν ουσίες που καταδεικνύουν μακροσκοπικά
ιδιότητες των βακτηρίων (Mac Conkey άγαρ,
Chapman)
 Πχ.: Mac Conkey’s υλικό
Διαχωρίζει τα μικρόβια που ζυμώνουν τη λακτόζη
από αυτά που δεν τη ζυμώνουν.

69.  Ζυμούντα τη λακτόζη– Ρόζ αποικίες
 Μη ζυμούντα τη λακτόζη– άχρωμες αποικίες

70. SS άγαρ: Εκλεκτικό και διαφοροποιητικό
Αναπτύσσονται:
 Salmonella: άχροες
αποικίες με μαύρο κέντρο
 Shigella: άχροες αποικίες
 Αναστέλλονται: τα
περισσότερα
εντεροβακτηριακά
 Θειοθειικό Na: πηγή S
βακτήρια που παράγουν
H2S μαύρες αποικίες

71.  Salmonell
a
 Shigella

72. ΧΡΩΜΟΓΟΝΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ (ΔΕΙΚΤΕΣ)
 Διαφοροποιητικά υλικά.
 Περιέχουν ειδικά χρωμογόνα υποστρώματα που
όταν έρθουν σε επαφή με τα ένζυμα του
μικροβίου ή μύκητα παράγουν χρώμα.
 Συμβάλλουν στην προκαταρκτική ταυτοποίηση.

76. Θρεπτικά υλικά σακχάρων
 Θρεπτικά υλικά που περιέχουν συστατικά
ζύμωσης.
 Πχ.: γλυκόζη, αραβινόζη,λακτόζη,κλπ.
 Τα υλικά περιέχουν 1% σάκχαρα σε
πεπτονούχο νερό.
API 50 Test

77. ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ
 Υλικά για τη μεταφορά μικροβίων.
 Ορισμένα ευαίσθητα μικρόβια δεν επιβιώνουν
αν η μεταφορά τους δεν γίνει με θρ. υλικά
 Πχ.:
 Stuart’s medium – ημίρρευστο άγαρ,
δεν περιέχει θρεπτικά συστατικά,
 Buffered glycerol saline

78. Η ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗΣ
ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ
Σημαντικές παράμετροι:
 Λήψη σωστού δείγματος
 Επιλογή κατάλληλων θρεπτικών υλικών
 Τρόπος ενοφθαλμισμού κλινικών δειγμάτων
 Επιλογή συνθηκών επώασης
 Ερμηνεία καλλιέργειας
 Προκαταρκτική ταυτοποίηση

79. ΕΠΙΛΟΓΗ ΚΑΤΑΛΛΗΛΩΝ
ΘΡΕΠΤΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝ
Στερεό θρεπτικό υλικό πάντα
Επιπρόσθετα: Υγρό θρεπτικό υλικό
ΠΟΤΕ εκλεκτικά υλικά μόνα τους,
ΠΑΝΤΑ σε συνδυασμό με μη εκλεκτικά.

80. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
 Υγρό θρεπτικό υλικό
Α) Θόλωση
Β) Υμένιο
Γ) Ίζημα
 Στερεό θρεπτικό υλικό
Α) Ανάπτυξη αποικιών
Β) Μεταβολές στο θρεπτικό υλικό
(αιμόλυση, παραγωγή χρωστικής,
βλέννης κλπ.)

81. ΜΑΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΑΠΟΙΚΙΩΝ
Παρατηρούνται:
 Το μέγεθος
 Το σχήμα
 Το ύψος (χαμηλή, φουσκωτή)
 Το χρώμα
 Η περιφέρεια (πχ. δαντελωτή, ερπύζουσα)
 Η σύσταση (πχ. βλεννώδης)
 Η όψη της επιφάνειας
 Οι μεταβολές στο θρεπτικό υλικό

83. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΑΙΜΑΤΟΣ...ΠΟΤΕ;
 Υποψία σήψης, μηνιγγίτιδας, οστεομυελίτιδας,
αρθρίτιδας, βακτηριακής πνευμονίας (Αιφνίδια
μεταβολή Θερμ. ή αριθμού σφύξεων ± ρίγος,
υπόταση, κακουχία)
 Υποψία ενδοκαρδίτιδας (ιστορικό διαλείποντος
πυρετού και καρδιακό φύσημα)
 Υποψία τυφοειδούς, βρουκέλλωσης
 Διερεύνηση ΠΑΑ

84. ΠΟΣΟΤΗΤΑ
 Ενήλικες 10-20 ml
(χαμηλή βακτηριαιμία,
≤ 1 cfu/ml)
 Νεογνά 1-3 ml
(υψηλή βακτηριαιμία,
10-1000 cfu/ml)

85. ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ -BACT/ALERT 3D
COMBO
 Η επώαση, ανακίνηση και
ανάγνωση (κάθε 10’) των
φιαλών γίνονται αυτόματα.
 Σε θετικά δείγματα, το
σύστημα ειδοποιεί οπτικά και
ηχητικά τον χρήστη.
 το σύστημα προσδιορίζει
αυτόματα τα αρνητικά
δείγματα.
 Το σύστημα διαχειρίζεται κάθε
φιάλη ξεχωριστά -νέες φιάλες
μπορούν να εισαχθούν ανά
πάσα στιγμή.
 Η επεξεργασία των ανωνύμων
φιαλών γίνεται χωρίς
ιδιαίτερες απαιτήσεις.

86. Touch, Scan, and Load
Μια οθόνη αφής επιτρέπει την χρήση του
χωρίς την πληκτρολόγηση εντολών για
εργασίες όπως η φόρτωση και η εκφόρτωση
φιαλών.
Με την τοποθέτηση των φιαλών στο σύστημα
δεν απαιτούνται άλλοι χειρισμοί δείγματος
έως την έκδοση του αποτελέσματος.

87. ΑΡΧΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ
BACT/ALERT 3D
COMBO
 Χρωματομετρική μέθοδος
 Οι μικροοργανισμοί μεταβολίζουν τα
θρεπτικά υποστρώματα του ζωμού με
αποτέλεσμα την παραγωγή CO2
 Το CO2 μειώνει το pH
 Αλλαγή χρώματος του ανιχνευτή- δείκτη
(μεμβράνη σιλικόνης +δείκτη χρωμογόνο) από
γκρι-πράσινο σε κίτρινο.
 Μία φωτοδίοδος (LED) προβάλλει φως
πάνω στον ανιχνευτή, ανιχνεύοντας
αλλαγές στο χρώμα του
 Το φως που αντανακλάται μετράται από
ένα φωτοανιχνευτή.
 Όσο πιο κίτρινο τόσο περισσότερο φως
αντανακλάται.

88. ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Τα αποτελέσματα των μετρήσεων ελέγχουν
 η ταχύτητα ανάπτυξης CO2, η
 η επιτάχυνση της ανάπτυξης CO2 και
 η αρχική τιμή συγκέντρωσης CO2
 Ανάλογα με τον ρυθμό ανάπτυξης του μικροβίου, ο
εντοπισμός θετικού δείγματος μπορεί να επιτευχθεί
σε λιγότερο από 1 ώρα.
Ψευδώς θετικά αποτελέσματα:
Παρουσία μεγάλου αριθμού WBC στο δείγμα

89. Αντιδραστήρια BacT/ALERT 3D
Φιάλες καλλιέργειας SA
 ανάκτηση και την ανίχνευση αερόβιων μικροοργανισμών
(βακτήρια και μύκητες) από αίμα και άλλα φυσιολογικώς στείρα
σωματικά υγρά (έως 10ml).
 40 ml συμπληρωμένου ζωμού που περιέχει πολύπλοκα
υποστρώματα αμινοξέων και υδατανθράκων σε κεκαθαρμένο
ύδωρ.
Φιάλες καλλιέργειας SN
 ανάκτηση και ανίχνευση αναερόβιων μικροοργανισμών
(βακτήρια) από αίμα και άλλα φυσιολογικώς στείρα σωματικά
υγρά (έως 10ml).
 40 ml συμπληρωμένου ζωμού που περιέχει αναγωγικούς
παράγοντες και άλλα πολύπλοκα υποστρώματα αμινοξέων και
υδατανθράκων
Φιάλες καλλιέργειας FA
 Χρησιμοποιούνται για βελτιωμένη ανάκτηση και ανίχνευση
αερόβιων και προαιρετικών αναερόβιων μικροοργανισμών
(βακτήρια και μύκητες) από αίμα και άλλα φυσιολογικώς στείρα
σωματικά υγρά (έως 10ml).
 30 ml συμπληρωμένου ζωμού που περιέχει ενεργοποιημένο
ζωάνθρακα, (για δέσμευση αντιβιοτικών και άλλων ουσιών)
πολύπλοκα υποστρώματα αμινοξέων και υδατανθράκων
Φιάλες καλλιέργειας FN
 Ανάκτηση και ανίχνευση αναερόβιων μικροοργανισμών από αίμα
και άλλα φυσιολογικώς στείρα σωματικά υγρά (έως 10ml).
 40 ml συμπληρωμένου ζωμού που περιέχει ενεργοποιημένο
ζωάνθρακα, (για δέσμευση αντιβιοτικών και άλλων ουσιών)
πολύπλοκα υποστρώματα αμινοξέων και υδατανθράκων σε
κεκαθαρμένο ύδωρ.

90. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ BacT/ALERT 3D
Φιάλες καλλιέργειας PF (Παιδιατρικά Δείγματα)
 Ανάκτηση και ανίχνευση αερόβιων και προαιρετικών
αναερόβιων μικροοργανισμών (βακτήρια και μύκητες)
από το αίμα (έως 4ml).
 20 ml συμπληρωμένου ζωμού που περιέχει
ενεργοποιημένο ζωάνθρακα, πολύπλοκα υποστρώματα
αμινοξέων και υδατανθράκων
Φιάλες επεξεργασίας MP
 Ανίχνευση μυκοβακτηρίων από σωματικά κλινικά
δείγματα που έχουν υποστεί εξουδετέρωση (π.χ. πτύελα).
 10 ml συμπληρωμένου ζωμού Middlebrook 7H9
Φιάλες αιμοκαλλιέργειας MB
 Ανάκτηση και ανίχνευση μυκοβακτηρίων από αίμα και
στείρα υγρά (έως 5ml).
 29 ml συμπληρωμένου ζωμού Middlebrook 7H9 με SPS

91. ΒΙΟΧΗΜΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ-ΕΙΔΙΚΕΣ
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΤΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΕΣ

92. ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΧΡΗΣΙΜΕΣ ΣΤΗΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ
Πρωταρχικό ρόλο στην ταυτοποίηση παίζει
Η Βιοχημική ταυτοποίηση στην οποία εκμεταλλευόμαστε :
• τις μεταβολικές ιδιότητες των μικροοργανισμών όπως η
διάσπαση διαφόρων υποστρωμάτων
• παραγωγή ενζύμων
• Συνδυασμός όλων των βιοχημικών χαρακτηριστικών
• Ταυτοποίηση του ΜΚ εφαρμόζοντας γνωστούς αλγορίθμους

93. ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΑ ΒΙΟΧΗΜΙΚΑ ΤΕΣΤ ΚΑΙ
ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ
Παρέχουν επιπρόσθετα στοιχεία για την
ταυτοποίηση των μικροβίων.
Περιλαμβάνουν:
 Δοκιμασία καταλάσης
 Δοκιμασία οξειδάσης
 Δοκιμασία οπτοχίνης
 Δοκιμασία βακιτρακίνης
 Δοκιμασία ινδόλης
 Δοκιμασία κοαγκουλάσης(πηκτάσης)
 Δοκιμασία ουρεάσης
 Δοκιμασία θερμοευαίσθητης νουκλεάσης
(DNασης)
 Μεταβολισμός κιτρικών

94. ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΚΟΑΓΚΟΥΛΑΣΗΣ(ΠΗΚΤΑΣΗΣ)
 Ελέγχει την ικανότητα των σταφυλοκόκκων να
προκαλούν πήξη του πλάσματος με τη βοήθεια
του ενζύμου κοαγκουλάση που παράγουν σε δύο
μορφές την συνδεδεμένη στο κυτταρικό τοίχωμα
(clumbing factor) και την ελεύθερη που
ελευθερώνεται από το (ΜΚ)
 Χρησιμοποιούμε:
*δοκιμασία πλακός για τη συνδεδεμένη
(εναιώρημα σταφυλοκόκκου + αναραίωτο
πλάσμα ή αντιδραστήριο με σωματίδια
latex)
 (+): παραγωγή κροκίδων
----------------------------------
*δοκιμασία σωληναρίων για την ελεύθερη
(εναιώρημα σταφυλοκόκκου + αραιωμένο
κατάλληλα πλάσμα ανθρώπου ή εμπορικού
σκευάσματος με πλάσμα κονίκλου, επώαση 4 ω)
 (+): παραγωγή πήγματος

95. ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ
 Ελέγχει την παρουσία του ενζύμου
καταλάση Στα βακτήρια που
χρησιμοποιούν οξυγόνο στην
αναπνοή τους, παραγεται
υπεροξείδιο υδρογόνου Η2Ο2. Η
καταλάση καταλύει την αντίδραση
2 Η2Ο2 Η2Ο + Ο2
Διαδικασία:
 Χρησιμοποιούμε Η2Ο2 3% και μικροβιακό
καλλιέργημα σε αντικειμενοφόρο πλάκα
 (+) : παραγωγή φυσαλίδων

96. ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΟΞΕΙΔΑΣΗΣ
 Ελέγχει αν ο (ΜΚ) διαθέτει το ένζυμο
cytochrome oxidase, απαραίτητο στην
μετατροπή
NADH σε NAD+ H2O
 Χρησιμοποιούμε
ο-phenylendiamine hydrochloride
σε διάλυμα, δισκία, ταινίες ή
ραβδία και φρέσκες αποικίες
 (+) : μπλε χρώμα σε 10’

97. ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΟΠΤΟΧΙΝΗΣ
 Ελέγχει την ευαισθησία ενός (ΜΚ) στην
οπτοχίνη (=ethyl
hydrocupreinehydrochloride), που
ενεργοποιεί αυτολυτικά ένζυμα του (ΜΚ) και
προκαλείται λύση του.
 Χρησιμοποιούμε αιματούχο αγαρ, δισκία
οπτοχίνης, επώαση σε CO2 5% για 24 ώρες
 (+): ζώνη αναστολής => 10 χιλ
 Χρήσιμη στη αδρή διάκριση
πνευμονιοκόκκων / α-αιμολυτικών
στρεπτοκόκκων.

98. ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΒΑΚΙΤΡΑΚΙΝΗΣ
 Ελέγχει την ευαισθησία ενός (ΜΚ)
στο αντιβιοτικό βακιτράκινη
 Χρησιμοποιούμε αιματούχο αγαρ,
δισκία βακιτρακίνης, επώαση για 24
ώρες.
 (+): αναστολή ανάπτυξης.
 Χρήσιμη στη διάκριση β
αιμολυτικού στρεπτοκόκκου ομάδας
Α (GAS) από άλλους β-αιμολυτικούς
στρεπτοκόκκους.

99. ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΙΝΔΟΛΗΣ
 Ελέγχει την ικανότητα του (ΜΚ) να
παραγει το ένζυμο τρυπτοφανάση που
υδρολύει το αμινοξύ τρυπτοφάνη σε
ινδόλη και αλδεύδη
 Χρησιμοποιούμε :
*πεπτονούχο ζωμό με 1% τρυπτοφάνη
*επώαση 18-24 ω
*αντιδραστήριο Kovacs (p dimethyl amino
benzaldehyde, amyl alcohol, HCL)
 (+): ροζ δακτύλιος στην επιφάνεια
(πχ E.coli )
 (-): άχρωμος δακτύλιος στην
επιφάνεια (πχ Klebsiella spp)

100. ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΟΥΡΕΑΣΗΣ
 Ελέγχει την ικανότητα των (ΜΚ) να
διασπούν την ουρία σε δύο μόρια
αμμωνίας, με το ένζυμο ουρεάση που
διαθέτουν, με αποτέλεσμα την αύξηση του
pH του υλικού
 Χρησιμοποιούμε:
*Θρ. ζωμό με ουρία και δείκτη ερυθρό της
φαινόλης, σε pH 6.8
*επώαση 18-24 ω σε 35-370C
 (+):ροζ χρώμα από την αλλαγή του
δείκτη με την αύξηση του pH σε 8.4
Πχ. Proteus spp,
Helicobacter/campylobacters

101. ΕΜΠΟΡΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ
 Έχουν ακρίβεια, μεγάλη διάρκεια ζωής
 Είναι εύκολα στη χρήση
 Δίνουν ξεκάθαρα αποτελέσματα ΑΡΚΕΙ ΝΑ ΕΜΒΟΛΙΑΖΟΝΤΑΙ ΜΕ
ΚΑΘΑΡΟ ΚΑΙ ΦΡΕΣΚΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΗΜΑ
API - bioMerieux
[20 και 32 δοκιμασιών,διάφορα είδη ]
BBL Crystal – Becton
Dickinson

102. ΗΜΙΑΥΤΟΜΑΤΑ ΚΑΙ ΑΥΤΟΜΑΤΑ
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΤΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ
 Αποτελούνται από το όργανο εμβολιασμού, το όργανο επώασης και τον υπολογιστή
για την εισαγωγή των δημογραφικών στοιχείων του ασθενούς και την ανάγνωση των
αποτελεσμάτων
 Χρησιμοποιούν μεγάλο αριθμό υποστρωμάτων, έως και 96, κλεισμένα σε κάρτες
(Vitek) ή πλάκες (Phoenix, Microscan), τα οποία αποτελούν τα Panels των διαφόρων
συστημάτων
 O εμβολιασμός γίνεται εύκολα και προτυπωμένα, με μικρή ανθρώπινη παρέμβαση
 Κατά την επώαση γίνεται συνεχής παρακολούθηση της αντίδρασης η οποία είναι
χρωματομετρική ή φθοριομετρική
 Το τελικό αποτέλεσμα δίνεται σε 2-12 ώρες

103. ΕΜΠΟΡΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΑΥΤΟΜΑΤΗΣ
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ
 Vitek System
-bioMerieux Vitek Inc
 Phoenix System
-Becton Dickinson

104. ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΛΕΓΧΟΥ ΤΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ
ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ

105. ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΛΕΓΧΟΥ ΤΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ
ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ
 Μέθοδος διάχυσης δίσκων αντιβιοτικών σε άγαρ
(Kirby-Bauer μέθοδος)
 Μέθοδοι αραίωσης αντιβιοτικών σε υγρά και στερεά
θρεπτικά υλικά
 Προσδιορισμός της ελάχιστης ανασταλτικής
πυκνότητας του αντιβιοτικού (ΕΑΠ, Minimum
Inhibitory Concentration, MIC)
 Προσδιορισμός της ελάχιστης βακτηριοκτόνου
πυκνότητας (ΕΒΠ, Minimum Lethal Concentration,
MBC)
 Ειδικές μέθοδοι ελέγχου της ευαισθησίας

106. ΜΕΘΟΔΟΣ ΔΙΑΧΥΣΗΣ ΔΙΣΚΩΝ
ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΣΕ ΑΓΑΡ
ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
Κατάλληλα εναιωρήματα μικροβίων
ενσωματώνονται ή τοποθετούνται στην
επιφάνεια του θρεπτικού υλικού και εν
συνεχεία τοποθετούνται τα αντιβιοτικά σε
μορφή εμποτισμένων δισκίων

107. ΜΕΘΟΔΟΣ ΔΙΑΧΥΣΗΣ ΔΙΣΚΩΝ
ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΣΕ ΑΓΑΡ
Διαμόρφωση της ζώνης αναστολής
Διάχυση του αντιβιοτικού στο θρεπτικό υλικό, από
περιοχή μεγαλύτερης σε περιοχή
μικρότερης πυκνότητας
Ζώνη αναστολής: όταν η συγκέντρωση
του αντιβιοτικού, ίση ή μεγαλύτερη από την ΕΑΠ,
επιτυγχάνει την αναστολή της ανάπτυξης του μικρ/σμού

108. ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ
ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗ ΖΩΝΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ
 Ευαίσθητο (διάμετρος της
ζώνης αναστολής ίση ή
μεγαλύτερη από αυτή του
προτύπου στελέχους)
 Μέτρια ευαίσθητο (μικρότερη
τουλάχιστον κατά 2 mm σε
σύγκριση με το πρότυπο
στέλεχος)
 Ανθεκτικό (δεν υπάρχει ζώνη
αναστολής ή είναι πολύ μικρή)

109. ΣΤΑΔΙΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
 Μικροβιακό εναιώρημα 0,5
McFarland (περίπου 108
κύτταρα/ ml)
 Ενοφθαλμισμός στο
θρεπτικό υλικό
 Τοποθέτηση των
αντιβιοτικών (σε απόσταση
24 mm κέντρο με κέντρο
 Επώαση
 Ανάγνωση-αναφορά των
αποτελεσμάτων
ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ
Μη απαιτητικά βακτήρια
(Mueller-Hinton άγαρ, MHA)

110.  Ομοιόμορφο πάχος 4 mm ώστε η διάχυση να γίνει
προς 3 διευθύνσεις
 Δίσκοι αντιβιοτικών: Συντήρηση στους -20 έως 4°C
(τα β-λακταμικά θα πρέπει να καταψύχονται όπως
ιμιπενέμη,κεφακλόρη,κλαβουλανικό)
 Όχι μετακίνηση των αντιβιοτικών μετά την
τοποθέτησή τους

111. ΑΝΑΓΝΩΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
 Ως όριο ζώνης αναστολής ορίζεται το σημείο όπου δεν
παρατηρείται μικροβιακή ανάπτυξη με γυμνό μάτι
 Μέτρηση των ζωνών αναστολής με διαβήτη με
προσπίπτοντα φωτισμό στην πίσω πλευρά του τρυβλίου
 Μεμονωμένες αποικίες μέσα στη ζώνη αναστολής→ μικτό
καλλιέργημα ή ανθεκτικοί μεταλλάκτες
Απαραίτητος ο συχνός ποιοτικός έλεγχος με
πρότυπα στελέχη!!!

112. ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ KIRBY-BAUER
 Απλή τεχνικά-γρήγορα
αποτελέσματα
 Μεγάλη επαναληψιμότητα
 Σχετικά φθηνή
 Δεν απαιτεί ειδικό εξοπλισμό
 Δυνατότητα επιλογής
αντιβιοτικών
 Ανάδειξη μηχανισμών αντοχής
(ESBL, D-zone→επαγώγιμη
αντοχή στην κλινδαμυκίνη,
Double disk synergy test,
Hodge test)

113. ΠΟΙΟΥΣ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟΥΣ
ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ?

114. ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΡΑΙΩΣΕΩΝ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ
ΣΕ ΥΓΡΑ ΚΑΙ ΣΤΕΡΕΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ
ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
Έκθεση του μικροβιακού εναιωρήματος σε
διαφορετικές συγκεντρώσεις του αντιβιοτικού
MIC:Η μικρότερη συγκέντρωση του αντιβιοτικού που
δεν επιτρέπει την ανάπτυξη του μικροβίου in vitro

115. ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ
….ΜΕ ΒΑΣΗ
ΤΙΣ ΠΥΚΝΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΠΟΥ
ΕΠΙΤΥΓΧΑΝΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΑΙΜΑ ΚΑΙ ΤΩΝ MIC
 Ευαίσθητα (Susceptible,S):αναστολή μικροβίων
από πυκνότητες αντιβιοτικού που επιτυγχάνονται στο
αίμα από την συνήθη θεραπευτική χορήγηση
 Μέτρια ευαίσθητα (Intermediate I):αναστολή
μικροβίων επί χορηγήσεως του αντιβιοτικού στη
μέγιστη ανεκτή δόση
 Ανθεκτικά (Resistant R):μη αναστολή μικροβίων
από πυκνότητες αντιβιοτικού που επιτυγχάνονται
συνήθως στο αίμα

116. ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ ΜΕ
ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΑΡΑΙΩΣΕΩΝ ΤΩΝ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ
 Μέθοδος αραιώσεων των αντιβιοτικών σε ζωμό
(broth dilution method)
(Μέθοδος αναφοράς για CLSI)
 Μακρομέθοδος: σωληνάρια (όγκος ζωμού για κάθε
αντιβιοτικό ≥1mL,13 σωληνάρια 100 mm). Επίπονη
και πολυδάπανη
 Μικρομέθοδος: πλάκες τιτλοποίησης (0,1mL).Ταχεία
και οικονομική
 Μέθοδος αραιώσεων των αντιβιοτικών σε άγαρ
(agar dilution method)

117. ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΡΑΙΩΣΕΩΝ ΤΩΝ
ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΣΕ ΖΩΜΟ
Μακρομέθοδος
Ανάγνωση αποτελεσμάτων
 Εξέταση των σωληναρίων μακροσκοπικά για
ανάπτυξη του μικροβίου με την εμφάνιση
θολερότητας
 Διαυγές σωληνάριο: η ελάχιστη συγκέντρωση του
αντιβιοτικού που δεν δείχνει ανάπτυξη του
μικροβίου (MICμg/mL

119. ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΡΑΙΩΣΕΩΝ
ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΣΕ ΖΩΜΟ
Μικρομέθοδος
 Πλάκες μικροτιτλοποίησης (96
βυθίσματα)-
Υποδιπλάσιες αραιώσεις των
αντιβιοτικών
 Προσθήκη μικροβιακού
εναιωρήματος
 Επώαση 35±2°C για 20-24 h
MIC: το πρώτο βύθισμα που δεν έχει
ανάπτυξη

120. ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΡΑΙΩΣΕΩΝ
ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΣΕ ΑΓΑΡ
 Μέθοδος αναφοράς
 Έλεγχος ταυτόχρονα πολλών μικροβίων
 Καλή αναπαραγωγιμότητα
Τρυβλία MHA με ενσωματωμένο το αντιβιοτικό σε
διάφορες συγκεντρώσεις
Ενοφθαλμισμός 1 μl μικροβιακού εναιωρήματος (107-
108CFU/mL )σε κάθε τρυβλίο με τη μορφή κηλίδας
5-8 mm (104CFU/κηλίδα)
MIC: η ελάχιστη συγκέντρωση του αντιβιοτικού που
αναστέλλει την ανάπτυξη του μικροβίου

122. ΕΤΟΙΜΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ MIC
 Ημιαυτόματα συστήματα (MicroScan, Wider
I, ATB system)
 Αυτόματα συστήματα (Vitek II System,
Phoenix System, MicroScan System)
 E-test

123. VITEK®2 compact
Το VITEK®2 compact είναι ένα
αυτόματο σύστημα ταυτοποίησης και
ευαισθησίας που χρησιμοποιεί
αναλώσιμες κάρτες VITEK® 2 για:
 Ταυτοποίηση Βακτηρίων και Μυκήτων
και
 Τεστ ευαισθησίας των κλινικών
βακτηρίων.
 το όργανο VITEK® 2 compact-
υπολογιστής -εκτυπωτής.
 Το λογισμικό ( software) περιλαμβάνει
προγράμματα ανάλυσης και διαχείρισης
αρχείων.
 Μεταφέρονται τα αποτελέσματα
εξετάσεων σε Πληροφοριακό Σύστημα
Εργαστηρίου (LIS).

124. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΚΑΡΤΑΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ
 Χρωματομετρική κάρτα
ταυτοποίησης VITEK 2
 Πλαστική κάρτα των 64 μικρο-
κυψελίδων. Σύνολο πρότυπων
βιοχημικών αντιδράσεων
 Κάθε κυψελίδα περιέχει ένα
αφυδατωμένο υλικό αντίδρασης
το οποίο ανα-υγροποιείται με την
προσθήκη 30 l βακτηριακού
εναιωρήματος.
 Μία κυψελίδα αντιστοιχεί σε μία
αντίδραση και διάφορες
κυψελίδες χρησιμοποιούνται σαν
κυψελίδες ελέγχου (control).

125.  Η ταυτοποίηση ενός μικροοργανισμού με την
χρήση των VITEK 2, βασιζεται στις τυπικές
ιδιότητες ενός είδους που περιλαμβάνεται
στην βάση δεδομένων, με την χρήση
διαχωριστικών βιοχημικών αντιδράσεων.
 ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΝΑΓΝΩΣΗΣ: ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ

126. ΚΑΡΤΕΣ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ VITEK
Τύπος μικροβίων Τύπος κάρτας
και
κωδικός
Αρ.
Ταυτοποιούμεν
ων ειδών
Αρ. Βιοχημικών
υποστρωμάτων
Χρόνος
εξέτασης
Αρχικό
εναιώρημα
Gram-αρνητικοί
βάκιλοι
ID GN - 21341 159 47 ≤ 10 hours 0.5 McFarland
Gram-θετικοί κόκκοι ID GP - 21342 123 43 ≤ 8 hours 0.5 McFarland
Ζύμες ID YST - 21343 52 46 18 hours 2.0 McFarland
Απαιτητικά ID-NH- 21346 28 30 6 hours 2.0 Mc Farland
Αναερόβια,
Κορυνοβακτηρίδια
ID-ANC- 21347 63 36 6 hours 2,7-3,3
McFarland

128. GRAM ΑΡΝΗΤΙΚΑ VITEK 2
GN Enterobacteriaceae
Buttiauxella agrestis Escherichia coli O157 Providencia rustigianii
Cedecea davisae Escherichia fergusonii Providencia stuartii
Cedecea lapagei Escherichia hermannii Rahnella aquatilis
Citrobacter amalonaticus Escherichia vulneris Raoultella ornithinolytica
Citrobacter braakii Ewingella americana Salmonella choleraesuis ssp
arizonae
Citrobacter farmeri Hafnia alvei Salmonella group
Citrobacter freundii Klebsiella oxytoca Salmonella ser. Gallinarum
Citrobacter koseri Klebsiella pneumoniae ssp ozaenae Salmonella ser. Paratyphi A
Citrobacter sedlakii Klebsiella pneumoniae ssp
pneumoniae
Salmonella typhi
Citrobacter youngae Klebsiella pneumoniae ssp
rhinoscleromatis
Serratia ficaria
Edwardsiella hoshinae Kluyvera ascorbata Serratia fonticola
Edwardsiella tarda Kluyvera cryocrescens Serratia liquefaciens group
Enterobacter aerogenes Leclercia adecarboxylata Serratia marcescens
Enterobacter amnigenus 1 Moellerella wisconsensis Serratia odorifera
Enterobacter amnigenus 2 Morganella morganii ssp morganii Serratia plymuthica
Enterobacter asburiae Morganella morganii ssp sibonii Serratia rubidaea
Enterobacter cancerogenus Pantoea agglomerans Shigella group
Enterobacter cloacae Pantoea spp Shigella sonnei
Enterobacter gergoviae Proteus mirabilis Yersinia enterocolitica group
Enterobacter intermedius Proteus vulgaris group/Proteus
penneri
Yersinia pestis
Enterobacter sakazakii Providencia alcalifaciens Yersinia pseudotuberculosis
Escherichia coli Providencia rettgeri Yersinia ruckeri
Yokenella regensburgei

129. GRAM ΑΡΝΗΤΙΚΑ VITEK 2
Non-Enterobacteriaceae
Achromobacter xylosoxidans ssp
dentrificans
Chromobacterium violaceum Pseudomonas oryzihabitans
Achromobacter xylosoxidans ssp
xylosoxidans
Chryseobacterium gleum Pseudomonas pseudoalcaligenes
Acinetobacter baumannii Chryseobacterium indologenes Pseudomonas putida
Acinetobacter haemolyticus Chryseobacterium meningosepticum Pseudomonas stutzeri
Acinetobacter junii Comamonas testosteroni Ralstonia mannitolilytica
Acinetobacter lwoffii Delftia acidovorans Ralstonia paucula
Actinobacillus ureae Francisella tularensis Ralstonia pickettii
Aeromonas hydrophila/Aeromonas
caviae
Mannheimia haemolytica Rhizobium radiobacter
Aeromonas salmonicida Methylobacterium spp Shewanella putrefaciens
Aeromonas sobria Moraxella group Sphingobacterium multivorum
Aeromonas veronii Myroides spp Sphingobacterium spiritivorum
Alcaligenes faecalis ssp faecalis Ochrobactrum anthropi Sphingobacterium thalpophilum
Bordetella bronchiseptica Oligella ureolytica Sphingomonas paucimobilis
Bordetella trematum Pasteurella aerogenes Stenotrophomonas maltophilia
Brevundimonas diminuta / vesicularis Pasteurella multocida Vibrio alginolyticus
Brucella melitensis Pasteurella pneumotropica Vibrio cholerae
Budvicia aquatica Photobacterium damselae Vibrio fluvialis
Burkholderia cepacia group Plesiomonas shigelloides Vibrio hollisae
Burkholderia gladioli Pseudomonas aeruginosa Vibrio metschnikovii
Burkholderia mallei Pseudomonas alcaligenes Vibrio mimicus
Burkholderia pseudomallei Pseudomonas fluorescens Vibrio parahaemolyticus
CDC group EF-4 (Pasteurella) Pseudomonas luteola Vibrio vulnificus
CDC group EO-2 (Psychrobacter) Pseudomonas mendocina

130. ΚΑΡΤΑ VITEK 2 YST
Candida albicans Candida norvegensis Malassezia furfur
Candida boidinii Candida parapsilosis Malassezia pachydermatis
Candida catenulata Candida pelliculosa Pichia farinosa
Candida colliculosa Candida pulcherrima Kodamaea ohmeri
Candida dubliniensis Candida rugosa Prototheca wickerhamii
Candida famata Candida sake Prototheca zopfii
Candida freyschussii Candida sphaerica Rhodotorula glutinis
Candida glabrata Candida tropicalis Rhodotorula minuta
Candida guilliermondii Candida utilis Rhodotorula mucilaginosa
Candida haemulonii Candida zeylanoides Saccharomyces cerevisiae
Candida inconspicua Cryptococcus albidus Sporobolomyces salmonicolor
Candida intermedia Cryptococcus laurentii Stephanoascus ciferrii
Candida kefyr Cryptococcus neoformans Trichosporon asahii
Candida krusei Cryptococcus terreus Trichosporon inkin
Candida lambica Cryptococcus uniguttulatus Trichosporon mucoides
Candida lipolytica Geotrichum capitatum Zygosaccharomyces bailii
Candida lusitaniae Geotrichum klebahnii
Candida magnoliae Kloeckera spp
2.6.3

131. VITEK 2 ID NH
Actinobacillus ureae Haemophilus actinomycetemcomitans Kingella kingae
Campylobacter coli Haemophilus
aphrophilus/paraphrophilus
Moraxella catarrhalis
Campylobacter fetus spp fetus Haemophilus haemoliticus Neisseria cinerea
Campylobacter jejuni spp jejuni Haemophilus influenzae Neisseria elongate
Capnocytophaga spp Haemophilus parahaemoliticus Neisseria gonorrhoeae
Cardiobacterium hominis Haemophilus parainfluenzae Neisseria lactamica
Eikenella corrodens Haemophilus segnis Neisseria meningitis
Gardnerella vaginalis Kingella denitrificans Neisseria sicca
Oligella urethralis
Suttonella indologenes

132. VITEK 2 ID ANC

133. ΑΡΧΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ -ΑΝΑΓΝΩΣΗ
ΤΩΝ ΚΑΡΤΩΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ
 Οι αλλαγές στη ανάπτυξη και τον
μεταβολισμό των βακτηρίων κατά την
επώαση έχουν σαν αποτέλεσμα τις
αλλαγές μετάδοσης φωτός.
 Κάθε κυψελίδα μετράται κάθε 15 min με
οπτικό σύστημα μήκους κύματος 430 ή
568 nm.
 Για κάθε ανάγνωση σε κάθε κυψελίδα
μετρήσεις σε 16 διαφορετικά σημεία
αυτής για 3 συνεχόμενες φορές
(λαμβάνονται 48 αποτελέσματα/
μετρήσεις).
 Δημιουργία μιας καμπύλης ανάπτυξης για
κάθε κυψελίδα.
 Δημιουργία βιοχημικού προφίλ

134. ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ
Προσδιορισμός του πιο πιθανού είδους
i.Όλα τα είδη που έχουν πιθανότητα μεγαλύτερη από κάποιο όριο
θεωρούνται πιθανά σωστές ταυτοποιήσεις.
Εάν προκύψει ένα μόνο είδος, αυτό αντιστοιχεί στην τελική ταυτοποίηση.
Εάν προκύψουν πάνω από ένα είδος, το αποτέλεσμα θα είναι α)χαμηλή
διάκριση, β)ταυτοποίηση με δύο είδη ή γ) μη ταυτοποίηση
Σχόλια Πιθανότητα
Excellent ID 96 - 99
Very good ID 93 - 95
Good ID 89 - 92
Acceptable 85 - 88
Low discrimination or slashline 2 ή 3 είδη επιδεικνύουν ίδιο προφίλ . Απαιτείται διαχωρισμός με επιπλέον
εξετάσεις.
Non-identified > 3 είδη επιδεικνύουν ίδιο προφίλ. Το στέλεχος είναι άτυπο ή δεν υπάρχει
δυνατότητα επιλογής

135. ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΜΗ ΤΕΛΙΚΗΣ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ
 Υπόδειξη για διενέργεια πρόσθετων εξετάσεων. Ποικίλει
ανάλογα με την μικροβιακή ομάδα και τον τύπο κάρτας.
Παραδείγματα είναι η καταλάση, οξειδάση, -αιμόλυση,
παραγωγή ινδόλης κ.α.
ΔΙΑΧΩΡΙΣΤΙΚΕΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ

141. ΑΡΧΗ ΜΕΘΟΔΟΥ
 Μια κάρτα 64 μικρο-κυψελίδων
που περιέχει διαφορετικές
συγκεντρώσεις (2-5) για περίπου
18 – 20 αντιβιοτικών.
 Η ανάπτυξη σε κάθε κυψελίδα
αντιβιοτικού μετράται -
παράγεται μια τιμή MIC για κάθε
εξεταζόμενο αντιβιοτικό.
 Καθορισμός σε κατηγορίες S, I, R
σύμφωνα με τα Διεθνή ή Εθνικά
πρότυπα
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ MIC VITEK-2

142. ΑΝΑΓΝΩΣΗ ΚΑΡΤΩΝ ΕΞΕΤΑΣΗΣ MIC VITEK®
2
Μέθοδος ανάγνωσης
 Θολοσιμετρία
Αριθμός μετρούμενων σημείων
 Θολοσιμετρικά 48σημεία (3 x 16) ανά μέτρηση
ανά κυψελίδα, αυτόματα

143. Type of bacteria Type of card
(Reference)
N° of antibiotics tested Result times Initial inoculum
Minimum. Average Maximum
Gram-negative bacilli AST-N030
(22059)
20 5 hours 6 hrs 30 15 hours 5x106 CFU/ml
Gram-negative bacilli AST-N039
(22086)
20 5 hours 6 hrs 30 15 hours 5x106 CFU/ml
Gram-negative bacilli AST-N038
(22078)
20 5 hours 6 hrs 30 15 hours 5x106 CFU/ml
Gram-negative bacilli AST-GN04 (22000) 20 5 hours 6 hrs30 15 hours 5x106 CFU/ml
Gram-negative bacilli AST-GN05
(22001)
20 5 hours 6 hrs30 15 hours 5x106 CFU/ml
Gram-negative bacilli AST-N020
21029
20 5 hours 6 hrs 30 15 hours 5x106 CFU/ml
Gram-negative bacilli AST-EXN3
2106
15 5 hours 6 hrs 30 15 hours 5x106 CFU/ml
Gram-negative bacilli AST-N037
21075
20 5 hours 6 hrs 30 15 hours 5x106 CFU/ml
Gram-negative bacilli AST-N032
22064
19 5 hours 6 hrs 30 15 hours 5x106 CFU/ml
Gram-negative bacilli AST-N040
220
20 5 hours 6 hrs 30 15hours 5x106 CFU/ml
Gram-negative bacilli AST-041
22088
18 5 hours 6 hrs 30 1 hours 5x106 CFU/ml
Gram-negative bacilli AST-GN07 (22006) 19 5 hours 6 hrs30 15 hours 5x106 CFU/ml
Gram-negative bacilli AST-GN08 (22007) 20 5 hours 6 hrs 30 15 hours 5x106 CFU/ml
Gram-negative bacilli AST-GN09
(22008)
20 5 hours 6 hrs 30 15 hours 5x106 CFU/ml
Gram-negative bacilli AST-GN010
(22009)
19 5 hours 6 hrs 30 15 hours 5x106 CFU/ml
Gram-negative bacilli AST-GN11
(22082)
20 5 hours 6 hrs 30 15 hours 5x106 CFU/ml
Staphylococci AST-P536
(22068)
21 5 hours 7 hours 15 hours 5x106 CFU/ml
Staphylococci/Enterococci/
Strepto B
AST-P535
(22067)
22 5 hours 7 hours 15 hours 5x106 CFU/ml
Enterococci/Strepto B AST-P534
(22066)
21 5 hours 7 hours 15 hours 5x106 CFU/ml
Staphylococci AST-P542
(22089)
21 5 hours 7 hours 15 hours 5x106 CFU/ml
Enterococci/Strepto B AST-P532
(22063)
20 5 hours 7 hours 15 hours 5x106 CFU/ml
Staphylococci/Enterococci/
Strepto B
AST-P537
(22070)
20 5 hours 7 hours 15 hours 5x106 CFU/ml
Staphylococci AST-P541
(22081)
20 5 hours 7 hours 15 hours 5x106 CFU/ml
Staphylococci/Enterococci/
Strepto B
AST-GP61
(22076)
20 5 hours 7 hours 15 hours 5x106 CFU/ml
Staphylococci AST-P538
(22074)
20 5 hours 7 hours 15 hours 5x106 CFU/ml
Pneumococci AST-P533
(22065)
19 6 hours 8 hours 15 hours 5x107 CFU/ml
Pneumococci AST-GP62
(22077)
12 6 hours 8 hours 15 hours 5x107 CFU/ml
Pneumococci AST-P518
(21023)
11 6 hours 8 hours 15 hours 5x107 CFU/ml

144. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ VITEK® 2
 Advanced Expert System™ (AES)
 Λογισμικό πρόγραμμα για την αξιολόγηση και
επικύρωση των αποτελεσμάτων.
 Το AES επικυρώνει τα αποτελέσματα ταυτοποίησης και
αντιβιογράμματος συγκρίνοντάς τα με μια ευρεία βάση
δεδομένων.
 Παρέχει ειδοποίηση για ασυνήθιστα προφίλ αντοχής (π.χ.,
σε μικτές καλλιέργειες, νέα αντοχή)
 Αναφέρει ειδικούς μηχανισμούς αντοχής που
ανιχνεύονται στο εξεταζόμενο στέλεχος (π.χ., Extended
Spectrum Beta-Lactamases, Penicillinase).

149. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
 MIC's
 S-I-R
 Φαινότυποι (AES)
 Βιολογική αξιολόγηση (τυπικοί-ατυποι-ασυνήθιστοι
φαινότυποι)
 Προσθήκες αντιβιοτικών
 Θεραπευτικές παρεμβάσεις-διορθώσεις

150. ΤΕΧΝΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ-
ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΝΑΙΩΡΗΜΑΤΟΣ
Μέθοδος προετοιμασίας εξέτασης
Εξέταση Ταυτοποίησης: χειροκίνητη προετοιμασία
Επιλογή απομονωμένων αποικιών και εναιώρηση τους σε 3.0 ml ορρού μέσα σε
ένα σωληνάριο 12 mm x 75 mm
Μέτρηση του μικροβιακού εναιωρήματος με την χρήση του DENSICHEK στο
0.5 McFarland standard.
Εξέταση Αντιβιογράμματος : χειροκίνητη προετοιμασία
Χρησιμοποιώντας τις πιπέτες που παρέχονται εμβολιάζονται 280 µl (Gram
positive AST) ή 145µl (Gram negative AST) μέσα σε δεύτερο σωληνάριο
(12 mm x 75 mm ),που περιέχει 3.0 ml ορρού.
Πιπέτες προκαθορισμένου όγκου για GN-AST and GP-AST παρέχονται με το
σύστημα

151. ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ ΤΗΣ ΚΑΡΤΑΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ
Περιγραφή χειρισμών
 Προετοιμασία εναιωρήματος για τη κάρτα
ταυτοποίησης με χρήση του DENSICHEK και
τοποθέτηση σωληναρίου στην κασέτα των 10 υποδοχών
 Μεταφορά εναιωρήματος με τη χρήση των πιπετών στο
σωληνάριο αντιβιογράμματος και τοποθέτηση
σωληναρίου στην κασέτα των 10 υποδοχών.
 Τοποθέτηση καρτών VITEK® 2 στην κασέτα των 10
υποδοχών.
 Φόρτωση κασέτας στο θάλαμο εμβολιασμού σε κενό.

153. ΕΠΩΑΣΗ ΤΩΝ ΚΑΡΤΩΝ ΕΞΕΤΑΣΗΣ VITEK®
2
Σφράγιση καρτών
Αυτόματη, ενσωματωμένη λειτουργία στο σύστημα. Το σύστημα κόβει το σωληνάριο
μεταφοράς εναιωρήματος και σφραγίζει την οπή εμβολιασμού της κάρτας.
Θάλαμος επώασης
Ενσωματωμένος στο σύστημα Οι κάρτες τοποθετούνται αυτόματα στον θάλαμο επώασης και οι
μετρήσεις των καρτών διενεργούνται αυτόματα.
Θερμοκρασία Επώασης 35.5°C + 1°C
Απόρριψη Καρτών με το τέλος της ανάλυσης
Αυτόματη απόρριψη στο δοχείο αποβλήτων.
Καθημερινά απόρριψη των αποβλήτων του δοχείου κάδο αποβλήτων του εργαστηρίου

154. ΕΙΔΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΕΛΕΓΧΟΥ
ΤΗΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ
Etest
 Προσδιορισμός της MIC-Μέθοδος
διάχυσης σε άγαρ
 Ταινίες εμποτισμένες με
προκαθορισμένη και
διαβαθμισμένη συγκέντρωση
αντιβιοτικού (15 συγκεντρώσεις)
 Κλιμάκωση από ελάχιστη τιμή
0,0021μg/ml έως μέγιστη τιμή
32μg/ml.
 Τοποθετούνται σε μικροβιακό
ταπήτιο
 Σχηματισμών ζωνών αναστολής

155. ΕΦΑΡΜΟΓΗ Ε-TEST
 Σε ασυνήθιστα αποτελέσματα (μη
συμβατά αντιβιογραμμάτων)
 Σε αδυναμία προσδιορισμού
αποτελεσμάτων Vitek-2
 Σε επιβεβαίωση Vitek-2 MIC σε
Colistin και Tigecycline
 Προσδιορισμός MIC – Etest: Μέθοδος
αναφοράς
 Zarkotou O, Pournaras S, Altouvas G, Pitiriga V, Tziraki M,
Mamali V, Themeli-Digalaki K, Tsakris A. Comparative
evaluation of tigecycline susceptibility testing methods for
expanded-spectrum cephalosporin- and carbapenem-resistant
gram-negative pathogens. J Clin Microbiol. 2012
Nov;50(11):3747-50.
 Tan TY, Ng SY. Comparison of Etest, Vitek and agar
dilution for susceptibility testing of colistin. Clin
Microbiol Infect. 2007
 Σε ανίχνευση συνέργειας αντιβιοτικών
 Σε ανίχνευση χαμηλών επιπέδων
αντοχής

156. ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ
 MICs για απαιτητικα βακτήρια και βραδείας
αναπτυξης και δεν ελέγχονται με τις
αυτοματοποιημενες μεθόδους
 Ελεγχος ευαισθησίας στα αντιβιοτικά και
ανίχνευση μηχανισμών αντοχής
 Ανιχνεύει φαινοτυπικές αντοχές
 Βελτιώνει τη στρατηγική ορθής χρήσης
αντιβιοτικών (antibiotic stewardship)

157. ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ
ΔΙΑΓΝΩΣΗ
Gram χρώση + καλλιέργεια υλικού από το σημείο
φλεγμονής: η πιο συχνή εργαστηριακή προσέγγιση για
διάγνωση βακτηριακών λοιμώξεων

158. Χρώση κατά Gram:
Gram (+) κόκκοι
Gram (+) βακτήρια
κινέζικα γράμματα
Gram (-) βακτήρια
Χρώση με κυανό του
μεθυλενίου:
βακτήρια με
μεταχρωματικά
κοκκία
S. pyogenes
Corynebacterium
diphtheriae
Fusobacterium
Corynebacterium
diphtheriae
ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΟ
ΑΝΩΤΕΡΟ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟ
Νωπό παρασκεύασμα με φ.ο.

159. ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΟ ΚΑΤΩΤΕΡΟ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟ
(ΠΤΥΕΛΑ, ΒΡΟΓΧΙΚΕΣ ΕΚΚΡΙΣΕΙΣ )
Νωπό παρασκεύασμα με φ.ο.
Χρώση κατά Gram:
καταλληλότητα του δείγματος
κατά Bartlett και κατά Murray
Washington
Gram (+) κόκκοι
Οξεάντοχη χρώση
Βαθμολόγηση κατά Bartlett
Πολυμ/να Επιθήλια
>25 +2 10-25 -1
10-25 +1 >25 -2
<10 0
Βλέννη +1
S. pyogenes, S. aureus, S. pneumoniae
Υφές μυκήτων
Oξεάντοχα βακτήρια

160. ΒΑΣΙΚΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ-
ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ
 Αιματούχο
 Σοκολατόχρωμο
 Chapman
 Sabouraud
 Mc Conkey
 Φυσιολογική χλωρίδα στο
ανώτερο αναπνευστικό
 Αξιολόγηση επικράτησης
ενός μικροβίου ΦΧ στο
ανώτερο αναπνευστικό
 Συχνές επιμολύνσεις
δειγμάτων κατωτέρου αν.
 Αξιολόγηση GN σε
συνδυασμό με WBC
 Αποικισμός ή λοίμωξη?

161. ΕΝΥ
Χρώση κατά Gram
Gram (+) διπλόκοκκοι
Gram (-) διπλόκοκκοι
Gram (-) βακτήρια με πολυμορφισμό
Gram (+) βακτήρια
Αντίδραση εξοίδησης ελύτρου
Χρώση με σινική μελάνη
ή νιγροσίνη
S. pneumoniae
N. meningitidis
H. Influenzae
Listeria sp.
Οροτυπία S. pneumoniae
H. influenzae
Cryptococcus neoformans

162. ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ-
ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΕΝΥ
 Αιματούχο
 Σοκολατόχρωμο
 Chapman
 Sabouraud
 Mc Conkey
 Anaerobes
 Θειογλυκολικός ζωμός
/ανακαλλιέργεια
 Στείρο μικροβίων
 Θετικό αποτέλεσμα
αξιολογείται με
μεγάλη προσοχή!!-
Προσοχή στις
επιμολύνσεις!

163. ΑΙΜΑ
• Χρώση κατά Gram
 διάφοροι τύποι
βακτηρίων
υφές μυκήτων
•Σκοτεινό οπτικό πεδίο
σπειροχέτες: μπορέλλια
•Χρώση Giemsa
παράσιτα του αίματος:
πλασμώδια, μπαμπέσιες,
τρυπανοσώματα, λεϊσμάνιες,
μικροφιλάριες

164. ΒΑΣΙΚΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ-
ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ
 Αιματούχο
 Chapman
 Sabouraud
 Mc Conkey
 Anaerobes
 ΣΤΕΙΡΟ ΥΛΙΚΟ
 Οποιαδήποτε ανάπτυξη
αξιολογείται
 Συχνά απομονώνεται
ένα μικρόβιο/πιο
σπάνια περισσότερα
 Staphylococcus
epidermidis: Συχνά
επιμόλυνση-Χρήζει
κλινικής αξιολόγησης –
επισήμανση στην
απάντηση

165. Προστατικό υγρό, ουρηθρικό, τραχηλικό έκκριμα
 Χρώση με κυανό του μεθυλενίου
 Χρώση κατά Gram
ενδοκυττάριοι Gram (-) διπλόκοκκοι N.
gonorrhoea
Κολπικό έκκριμα
 Νωπό παρασκεύασμα
υφές μυκήτων τριχομονάδες
 Χρώση κατά Gram
clue cells
WBC
υφές μυκήτων
Gram (-) βακτήρια:
Mobiluncus sp.

166. ΒΑΣΙΚΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ-
ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ
 Αιματούχο
 Chocolate
 Chapman
 Sabouraud
 Mc Conkey
 Anaerobes
 Φυσιολογική χλωρίδα
 Εκτιμάται η
υπανάπτυξη
 Στα κολπικα Δεν
αξιολογούνται GN
εκτός εξαιρέσεων (πχ
τραυματισμοί)
 Ιδιαίτερη η προσοχή
στα αναερόβια
Ωστόσο ..
ΔΙΑΓΝΩΣΗ από
μικροσκοπική
εξέταση (νωπό +
Gram)

167. Κόπρανα
• Χρώση κατά Gram
 Διάφοροι τύποι βακτηρίων
 πολυμορφοπύρηνα και Gram (+) κόκκοι:
εντεροκολίτιδα από S. aureus
 Cambylobacter jejuni
 Μύκητες
 WBC
• Νωπό παρασκεύασμα
 βακτήρια με έντονη κινητικότητα
απουσία πολυμορφοπυρήνων: Vibrio sp.
• Νωπό παρασκεύασμα με Lugol
 παράσιτα

168. ΒΑΣΙΚΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ-
ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΚΟΠΡΑΝΩΝ
 SS agar
 Selinite broth
 Sabouraud
 Mc Conkey
 Campy agar
 ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΧΛΩΡΙΔΑ
 Αξιολόγηση επικρατούσας
ανάπτυξης
 Έλεγχος φορείας
πολυανθεκτικών
εντεροβακτηριακών

169. Τραύμα, απόστημα, ελκωτική βλάβη
Χρώση κατά Gram
διάφοροι τύποι βακτηρίων
Gram (+) βακτήρια: Clostridium
perfringens
 Νωπό παρασκεύασμα: κοκκία θείου
 Οξεάντοχη χρώση: Nocardia,
Actinomyces
Λέπια δέρματος, νύχια, τρίχες
• Νωπό παρασκεύασμα με διάλυμα ΚΟΗ
10%
• Χρώση λακτοφαινόλης
υφές μυκήτων
 Χρώση Gram

170. ΒΑΣΙΚΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ-
ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ
 Αιματούχο
 Mc Conkey
 Anaerobes
 Chapman
 Sabouraud
 Θειογλυκολικός ζωμός
/ανακαλλιέργεια
 Παρουσία ή όχι WBC
 GN, GP, Fungi,
anaerobes
 Προσοχή στις
επιμολύνσεις από το
δέρμα

171. Ούρα
Στρώσιμο σταγόνας σε αντικειμενοφόρο πλάκα
χωρίς φυγοκέντρηση
Εκτίμηση μικροβιακού φορτίου
1 μικρ/σμός ανά οπτικό πεδίο (x1000) σε
αφυγοκέντρητα ούρα αντιστοιχεί σε 105cfu/ml σε
καλλιέργεια
Χρώση κατά Gram (95% ευαισθησία)
διάφοροι τύποι βακτηρίων, υφές μυκήτων
 Σκοτεινό οπτικό πεδίο
σπειροχέτες: Leptospira sp.

174. ΟΦΘΑΛΜΙΚΟ ΕΚΚΡΙΜΑ
Χρώση κατά Gram
 διάφοροι τύποι βακτηρίων
Χρώση Giemsa
σε ξέσματα κερατοειδούς
 ενδοκυττάρια περιπυρηνικά
συσσωματώματα:
Chlamydia trachomatis