Nghiên cứu tính an toàn và công hiệu Vacxin viêm não nhật bản bất hoạt từ não chuột chủng Beijing -1 do Việt Nam Sản Xuất Phí tải 20.000đ liên hệ quangthuboss@gmail.com

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾBỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TR­ƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘITR­ƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
--------------------
ĐỖ THỊ DIỆP LANĐỖ THỊ DIỆP LAN
NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ CÔNG HIỆU VĂCXINNGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ CÔNG HIỆU VĂCXIN
VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TỪ NÃO CHUỘTVIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TỪ NÃO CHUỘT
CHỦNG BEIJING­1 DO VIỆT NAM SẢN XUẤTCHỦNG BEIJING­1 DO VIỆT NAM SẢN XUẤT
Chuyên ngành: Vi sinh VậtChuyên ngành: Vi sinh Vật
Mã số: 60.72. 68Mã số: 60.72. 68
LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌCLUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC
Người hướng dẫn :Người hướng dẫn : GS.TS. HUỲNH PHƯƠNG LIÊNGS.TS. HUỲNH PHƯƠNG LIÊN
Hà Nội – 2010Hà Nội – 2010

2. ĐẶT VẤN ĐỀĐẶT VẤN ĐỀ
 Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) lưu hành ở châu Á và tất cảBệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) lưu hành ở châu Á và tất cả
các nước Đông Nam Á với khoảng 50.000 trường hợp mỗi năm,các nước Đông Nam Á với khoảng 50.000 trường hợp mỗi năm,
trong đó 10.000 ca tử vong, 15.000 ca mang di chứng thần kinhtrong đó 10.000 ca tử vong, 15.000 ca mang di chứng thần kinh
suốt đời.suốt đời.
 Ở Việt NamỞ Việt Nam dịch xảy ra hàng năm, rải rác khắp các tỉnh thànhdịch xảy ra hàng năm, rải rác khắp các tỉnh thành
từ đồng bằng đến miền núi, miền Bắc có tỷ lệ mắc cao nhấttừ đồng bằng đến miền núi, miền Bắc có tỷ lệ mắc cao nhất
 Sự thay đổi của các chủng virut như VNNB genotyp 1 được phátSự thay đổi của các chủng virut như VNNB genotyp 1 được phát
hiện ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Việt Nam... báo động cho chúnghiện ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Việt Nam... báo động cho chúng
ta cần dự phòng bệnh tích cực hơn bằng các chủng loại vắc xinta cần dự phòng bệnh tích cực hơn bằng các chủng loại vắc xin
VNNB có diện đáp ứng kháng thể rộng với nhiều chủng, lưuVNNB có diện đáp ứng kháng thể rộng với nhiều chủng, lưu
hành ở nhiều vùng khác nhau.hành ở nhiều vùng khác nhau.
 Chủng Beijing-1 được coi là chủng đại diện nhất, có thể bảo vệChủng Beijing-1 được coi là chủng đại diện nhất, có thể bảo vệ
chéo với nhiều chủng VNNB lưu hành ở nhiều địa phương vàchéo với nhiều chủng VNNB lưu hành ở nhiều địa phương và
khả năng miễn dịch cao hơn chủng Nakayama.khả năng miễn dịch cao hơn chủng Nakayama.

3.  Hiện nay (VABIOTECH) đã sản xuất văcxin ởHiện nay (VABIOTECH) đã sản xuất văcxin ở
cả 2 chủng Nakayama và Beijing-1.cả 2 chủng Nakayama và Beijing-1.
 Kiểm tra chất lượng văcxin là một vấn đề hếtKiểm tra chất lượng văcxin là một vấn đề hết
sức quan trọngsức quan trọng , có tính chất khẳng định chất, có tính chất khẳng định chất
lượng của văcxin về tính an toàn và công hiệulượng của văcxin về tính an toàn và công hiệu
của nócủa nó. Do đó. Do đó chúng tôi tichúng tôi tiến hànhến hành đề tài:đề tài:
 "Nghiên cứu đánh giá tính an toàn và công"Nghiên cứu đánh giá tính an toàn và công
hiệu văcxin viêm não Nhật Bản Bản bất hoạthiệu văcxin viêm não Nhật Bản Bản bất hoạt
từ não chuộttừ não chuột chủng Beijing-1 do Việt Namchủng Beijing-1 do Việt Nam
sản xuất”sản xuất”

4.  Đánh giá tính an toàn của vắc xin viêm nãoĐánh giá tính an toàn của vắc xin viêm não
Nhật Bản từ não chuộtNhật Bản từ não chuột chủng Beijing-1 dochủng Beijing-1 do
Việt Nam sản xuất.Việt Nam sản xuất.
 Đánh giá tính công hiệuĐánh giá tính công hiệu của vắc xin viêmcủa vắc xin viêm
não Nhật Bản từ não chuộtnão Nhật Bản từ não chuột chủng Beijing-chủng Beijing-
1 do Việt Nam sản xuất.1 do Việt Nam sản xuất.

5. I. TỔNG QUAN TÀI LIỆUI. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Virut viêm não Nhật Bản1. Virut viêm não Nhật Bản
- Virut VNNB là một thành viên của nhóm B- Virut VNNB là một thành viên của nhóm B
cáccác arbovirutarbovirut, thuộc họ, thuộc họ TogaviridaeTogaviridae, dòng, dòng
Flavivirut.Flavivirut.
- Là một virut chứa ARN có vỏ bọc.- Là một virut chứa ARN có vỏ bọc.
- Các hạt virut hình cầu, đường kính 40 – 50nm- Các hạt virut hình cầu, đường kính 40 – 50nm

6. Sơ đồ cấu trúc hạt virut VNNB (Flaviviruse)

7. 2. Dịch tễ học:2. Dịch tễ học:

8. 3.Vắc xin VNNB3.Vắc xin VNNB
• VX thế hệ 1VX thế hệ 1
• VX thế hệ 2VX thế hệ 2
• VX thế hệ 3VX thế hệ 3

9. II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀII. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu1. Đối tượng nghiên cứu
- Văcxin viêm não Nhật Bản chung Beijing- Văcxin viêm não Nhật Bản chung Beijing
-1sản xuất tại công ty văcxin và sinh phẩm số-1sản xuất tại công ty văcxin và sinh phẩm số
11
- Văcxin mẫu chuẩn Nhật Bản EJP034A- Văcxin mẫu chuẩn Nhật Bản EJP034A
2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
* Địa điểm nghiên cứu:* Địa điểm nghiên cứu:
Phòng kiểm định văcxin, Công ty văcxin vàPhòng kiểm định văcxin, Công ty văcxin và
sinh phẩm số 1 (VABIOTECH)sinh phẩm số 1 (VABIOTECH)
* Thời gian nghiên cứu* Thời gian nghiên cứu
Từ 12/2009-9/2010.Từ 12/2009-9/2010.

10. 3.3. Vật liệu nghiên cứuVật liệu nghiên cứu
3.1. Động vật thí nghiệm3.1. Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng giống Swiss 4 tuần tuổiChuột nhắt trắng giống Swiss 4 tuần tuổi
- Chuột lang 150 – 300 grChuột lang 150 – 300 gr
- Thỏ 1,5 – 2,5 kg- Thỏ 1,5 – 2,5 kg
3.2. Sinh phẩm, môi trường và hoá chất3.2. Sinh phẩm, môi trường và hoá chất
* Sinh phẩm* Sinh phẩm
- Văcxin mẫu chuẩn Nhật Bản EJP034A- Văcxin mẫu chuẩn Nhật Bản EJP034A
- Chủng virut VNNB Beijing-1- Chủng virut VNNB Beijing-1
- Tế bào BHK- 21.Tế bào BHK- 21.
* Môi trường, hoá chất và trang thiết bị* Môi trường, hoá chất và trang thiết bị

11. 4.1.Thiết kế nghiên cứu4.1.Thiết kế nghiên cứu::
Tiến hành theo phương pháp nghiên cứuTiến hành theo phương pháp nghiên cứu
phòng thí nghiệmphòng thí nghiệm
4.2.Cỡ mẫu nghiên cứu:4.2.Cỡ mẫu nghiên cứu:
Tiến hành thử nghiệm trên 6 loạt văcxinTiến hành thử nghiệm trên 6 loạt văcxin

12. 4.3.Kỹ thuật nghiên cứu4.3.Kỹ thuật nghiên cứu
4.3.1.Kiểm tra tính an toàn của vắc xin VNNB.4.3.1.Kiểm tra tính an toàn của vắc xin VNNB.
4.3.1.1. Độ pH4.3.1.1. Độ pH
(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP: HL01-09,(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP: HL01-09,
2005, NICVB).2005, NICVB).

13. 4.3.1.2.Hàm lượng protein toàn phần4.3.1.2.Hàm lượng protein toàn phần
(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:
HL01-10, 2005, NICVB).HL01-10, 2005, NICVB).
* Nguyên lý:* Nguyên lý:
Protein trong văcxin được tủa bằng axitProtein trong văcxin được tủa bằng axit
tricloraxetic (TCA) rồi định lượng theotricloraxetic (TCA) rồi định lượng theo
phương pháp Lowry.phương pháp Lowry.

14. 4.3.1.3. Hàm lượng thimerosal4.3.1.3. Hàm lượng thimerosal
(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:
HL01-01, 2005, NICVB).HL01-01, 2005, NICVB).
* Nguyên lý:* Nguyên lý:
Dựa trên cơ sở thimerosal phản ứng vớiDựa trên cơ sở thimerosal phản ứng với
dithizon tạo thành hợp chất có độ hấp phụ cựcdithizon tạo thành hợp chất có độ hấp phụ cực
đại ở bước sóng 430 nm. Đo độ hấp phụ củađại ở bước sóng 430 nm. Đo độ hấp phụ của
hợp chất tạo thành ở bước sóng này.hợp chất tạo thành ở bước sóng này.

15. 4.3.1.4.Hàm lượng formaldehyt4.3.1.4.Hàm lượng formaldehyt
(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:
HL01-08, 2005, NICVB)HL01-08, 2005, NICVB)
* Nguyên lý:* Nguyên lý:
Định lượng formaldehyt bằng phương pháp đoĐịnh lượng formaldehyt bằng phương pháp đo
cường độ màu của 3,5 diacetyl 4-dihydrothidincường độ màu của 3,5 diacetyl 4-dihydrothidin
ở bước sóng 415 nm. Phức hợp này được tạoở bước sóng 415 nm. Phức hợp này được tạo
thành do phản ứng của formaldehyt chứa trongthành do phản ứng của formaldehyt chứa trong
văcxin với acetylaceton và amonia trong môivăcxin với acetylaceton và amonia trong môi
trường axit nhẹ.trường axit nhẹ.

16. Máy đo quang phổ dùng cho kiểm định hàmMáy đo quang phổ dùng cho kiểm định hàm
lượng hoá họclượng hoá học

17. 4.3.1.5. Kiểm tra an toàn chung4.3.1.5. Kiểm tra an toàn chung
(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:
KĐQG-21, 2007, NICVB)KĐQG-21, 2007, NICVB)
- Thử nghiệm trên chuột lang- Thử nghiệm trên chuột lang
- Thử nghiệm trên chuột nhắt- Thử nghiệm trên chuột nhắt

18. Tiêm chuột lang trong thử nghiệmTiêm chuột lang trong thử nghiệm
an toàn chungan toàn chung

19. Theo dõi trọng lượng chuột lang trong thửTheo dõi trọng lượng chuột lang trong thử
nghiệm an toàn chungnghiệm an toàn chung

20. Tiêm phúc mạc chuột nhắt trắng trong thửTiêm phúc mạc chuột nhắt trắng trong thử
nghiệm an toàn chungnghiệm an toàn chung

21. Theo dõi trọng lượng chuột nhắt trong thửTheo dõi trọng lượng chuột nhắt trong thử
nghiệm an toàn chungnghiệm an toàn chung

22. 4.3.1.6. Kiểm tra an toàn4.3.1.6. Kiểm tra an toàn đặcđặc hiệuhiệu
((Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:
VR03-13, 2007, NICVB)VR03-13, 2007, NICVB)

23. Tiêm não chuột trong kiểm traTiêm não chuột trong kiểm tra
an toàn đặc hiệuan toàn đặc hiệu

24. Xác định vị trí tiêm não chuột trong kiểm traXác định vị trí tiêm não chuột trong kiểm tra
an toàn đặc hiệuan toàn đặc hiệu

25. 4.3.1.7. Kiểm tra chất gây sốt4.3.1.7. Kiểm tra chất gây sốt
(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:
KĐQG-22, 2007, NICVB)KĐQG-22, 2007, NICVB)

26. Tiêm tĩnh mạch tai thỏ trong kiểm traTiêm tĩnh mạch tai thỏ trong kiểm tra
chất gây sốtchất gây sốt

27. 4.3.1.8. Kiểm tra vô trùng4.3.1.8. Kiểm tra vô trùng
(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:(Theo Tiêu Chuẩn Việt Nam I-5, 2009, SOP:
HL05-01, 2007, NICVB)HL05-01, 2007, NICVB)
- TSBTSB ((30-3530-35oo
C)C)
- FTMFTM ((20-2520-25oo
C)C)

28. 4.3.24.3.2.. Kiểm tra tính công hiệu củaKiểm tra tính công hiệu của
vắc xin VNNBvắc xin VNNB
Nguyên lýNguyên lý
Công hiệu của văcxin VNNB dựa trên hiệuCông hiệu của văcxin VNNB dựa trên hiệu
giá kháng thể trung hoà sau khi gây miễngiá kháng thể trung hoà sau khi gây miễn
dịch cho chuột nhắt trắng. Hiệu giá khángdịch cho chuột nhắt trắng. Hiệu giá kháng
thể trung hoà được tính bằng giá trị 50%thể trung hoà được tính bằng giá trị 50%
giảm đám hoại tử.giảm đám hoại tử.

29. Tóm tắt sơ đồ trung hoà giảm đám hoại tửTóm tắt sơ đồ trung hoà giảm đám hoại tử
1 ml huyết thanh của mỗi nồng độ pha loãng +1 ml CV (hỗn hợp trung hoà)
Để tủ ấm CO2 ở 37o
C trong 90 phút
Cấy hỗn hợp trung hoà 0,2 ml vào đĩa tế bào BHK-21 (mỗi độ pha loãng 3 đĩa)
láng đều trên bề mặt tế bào
Phủ lớp thạch thứ nhất đã chuẩn bị (5 ml/đĩa)
Để tủ ấm CO2 ở 37o
C trong 3 ngày
Phủ lớp thạch thứ hai đã chuẩn bị (2,5 ml/đĩa)
Để tủ ấm CO2 ở 37o
C trong 3 giờ
Đếm các đám hoại tử ở từng đĩa
Tính hiệu giá trung hoà
Yêu cầu hiệu giá kháng thể trung hoà của mẫu thử ≥ văcxin mẫu chuẩn

30. Thử nghiệm trung hoà giảm đám hoại tửThử nghiệm trung hoà giảm đám hoại tử

31. Nuôi cấy tế bào BHK-21 trong tủ ấm CO2Nuôi cấy tế bào BHK-21 trong tủ ấm CO2

32. Hình ảnh virut VNNB tạo đám hoại tử trên tế bàoHình ảnh virut VNNB tạo đám hoại tử trên tế bào
BHK-21 nhuộm bằng dung dịch Crystal VioletBHK-21 nhuộm bằng dung dịch Crystal Violet..

33. 4.4. Phương pháp xử lý số liệu4.4. Phương pháp xử lý số liệu
- Sắc xuất thống kê sinh y học- Sắc xuất thống kê sinh y học
- Phần mềm Microsoft Excel.- Phần mềm Microsoft Excel.
4.5. Đạo đức trong nghiên cứu4.5. Đạo đức trong nghiên cứu
- Thực hiện trong phòng thí nghiệm.- Thực hiện trong phòng thí nghiệm.
- Cam kết các kết quả nghiên cứu được báo- Cam kết các kết quả nghiên cứu được báo
cáo trung thựccáo trung thực

34. III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬNIII. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả kiểm tra tính an toàn của 6 loạt văcxin3.1. Kết quả kiểm tra tính an toàn của 6 loạt văcxin
VNNB sản xuất thử nghiệm từ chủng Beijing-1VNNB sản xuất thử nghiệm từ chủng Beijing-1

35. 3.1.1. Hàm lượng TCA-protein của 6 loạt3.1.1. Hàm lượng TCA-protein của 6 loạt
văcxin thử nghiệmvăcxin thử nghiệm
14.4 13.98 14.5 13.2 14.4 12.5 11
0
10
20
30
40
50
60
70
80
JB011203 JB021203 JB030104 JB040204 JB050304 JB060305 Mẫu chuẩn
EJP034A
Loạt
HàmlượngTCA-protein
(ug/ml)

36. 3.1.2. Hàm lượng Thimerosal của 6 loạt3.1.2. Hàm lượng Thimerosal của 6 loạt
văcxin thử nghiệmvăcxin thử nghiệm
84 82 82 82 85.2
76.3
82
60
70
80
90
100
110
120
130
140
JB011203 JB021203 JB030104 JB040204 JB050304 JB060305 Mẫu
chuẩn
EJP034A
Loạt
HàmlượngThimerosal(ug/ml)

37. 3.1.3. Hàm lượng Formaldehyde của 6 loạt3.1.3. Hàm lượng Formaldehyde của 6 loạt
văcxin thử nghiệmvăcxin thử nghiệm
0.063 0.061 0.061 0.061 0.061 0.039 2.19
0
20
40
60
80
100
120
JB011203 JB021203 JB030104 JB040204 JB050304 JB060305 Mẫu chuẩn
EJP034A
Loạt
Hàmlượngformaldehyde(um/ml)

38. 3.1.4. pH của 6 loạt văcxin thử nghiệm3.1.4. pH của 6 loạt văcxin thử nghiệm
7.1
7.057.027.027.037.04 7.04
6
6.2
6.4
6.6
6.8
7
7.2
7.4
7.6
7.8
8
8.2
8.4
JB011203 JB021203 JB030104 JB040204 JB050304 JB060305 Mẫu chuẩn
EJP034A
Loat
ĐộpH

39. 1.3.5. Kết quả thử nghiệm an toàn chung1.3.5. Kết quả thử nghiệm an toàn chung
trên chuột langtrên chuột lang
113.8
110.45
114.4
106.2
109.65
117.7
100
102
104
106
108
110
112
114
116
118
120
JB011203 JB021203 JB030104 JB040204 JB050304 JB060305
Loạt
Tỷlệchuộttăngtrọng(%)

40. 1.3.6. Kết quả thử nghiệm an toàn chung
trên chuột nhắt trắng
147.64
144.68
140.02
137.38
140.7
151.2
130
135
140
145
150
155
JB011203 JB021203 JB030104 JB040204 JB050304 JB060305
Loạt
Tỷlệchuộttăngtrọng(%)

41. 1.3.7.Kết quả thử nghiệm an toàn đặc hiệu1.3.7.Kết quả thử nghiệm an toàn đặc hiệu
trên chuột nhắt trắngtrên chuột nhắt trắng
174.5
211.6
174.5 176.8
190.1
169.7
0
50
100
150
200
250
JB011203 JB021203 JB030104 JB040204 JB050304 JB060305
Loạt
Tỷlệchuộttăngtrọng(%)

42. 1.3.8. Kết quả thử nghiệm yếu tố gây sốt1.3.8. Kết quả thử nghiệm yếu tố gây sốt
0.0
0.1 0.1
0.3
0.2
0.1
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
JB011203 JB021203 JB030104 JB040204 JB050304 JB060305
Loạt
Nhiệtđộtăng(ĐộC)

43. 1.3.9. Kết quả kiểm định vô khuẩncủa 6 loạt1.3.9. Kết quả kiểm định vô khuẩncủa 6 loạt
văcxin VNNB sản xuất từ chủng Beijing-1văcxin VNNB sản xuất từ chủng Beijing-1
Loạt
Văcxin
Vô khuẩn
(Tiêu chuẩn không mọc nấm và vi khuẩn trên môi
trường nuôi cấy)
JB011203 Không mọc nấm và vi khuẩn
JB021203 Không mọc nấm và vi khuẩn
JB030104 Không mọc nấm và vi khuẩn
JB040204 Không mọc nấm và vi khuẩn
JB050304 Không mọc nấm và vi khuẩn
JB060305 Không mọc nấm và vi khuẩn

44. 3.2. Kết quả kiểm tra tính công hiệu của 6 loạt văcxin3.2. Kết quả kiểm tra tính công hiệu của 6 loạt văcxin
VNNB sản xuất thử nghiệm từ chủng Beijing-1VNNB sản xuất thử nghiệm từ chủng Beijing-1
0
0.5
1
1.5
2
2.5
JB011203 JB021203 JB030104 JB040204 JB050304 JB060305 Loạt
Hiệugiákhángthểtrunghoà(log10)
VX thử
VX chuẩn

45. IV. KẾT LUẬNIV. KẾT LUẬN
1.Văcxin VNNB bất hoạt từ não chuột chủng1.Văcxin VNNB bất hoạt từ não chuột chủng
Beijing-1 do Việt Nam sản xuất đạt tính anBeijing-1 do Việt Nam sản xuất đạt tính an
toàn caotoàn cao
2.Văcxin VNNB bất hoạt từ não chuột chủng2.Văcxin VNNB bất hoạt từ não chuột chủng
Beijing-1 do Việt Nam sản xuất đạt tínhBeijing-1 do Việt Nam sản xuất đạt tính
công hiệucông hiệu

46. V.V. KIẾN NGHỊKIẾN NGHỊ
Bộ y tế xem xét nên đưa văcxin VNNB chủngBộ y tế xem xét nên đưa văcxin VNNB chủng
Beijing -1 vào CTTCMR để tiêm phòng choBeijing -1 vào CTTCMR để tiêm phòng cho
trẻ em Việt Nam.trẻ em Việt Nam.

47. XIN CHÂN THÀNH CÁM ƠNXIN CHÂN THÀNH CÁM ƠN