Dokumen tersebut membahas tentang spektrofotometri UV-Vis, termasuk prinsipnya, komponen-komponen, hukum Lambert-Beer, dan faktor-faktor yang mempengaruhi hasil pengukuran."

1. Spektrofotometri
UV-Vis
LISNA DEWI, M.Si
dlisna017@gmail.com
JURUSAN FARMASI
UNIVERSITAS AL-GHIFARI BANDUNG
2022

2. SAMPEL
MENYERAP
ENERGI/RADIASI
RADIASI
ELEKTROMAGNETIK
MATERI
(ATOM/MOLEKUL
• Jumlah intensitas radiasi yang diserap oleh larutan sampel dikonversi
dengan konsentrasi analit  data kuantitatif
RADIASI
ELEKTROMAGNETIK
Prinsip Spektrometri

3. • Spektrofotometer  spektrometer + fotometer
• Spektrometer  menghasilkan sinar dari spektrum
dengan panjang gelombang tertentu
• Fotometer  alat pengukur intensitas cahaya yang
ditransmisikan atau diabsorpsikan
• Spektrofotometer  untuk mengukur energi secara
relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan
atau diemisikan.

4. Spektrofotometri
• Analisis spektrofotometri : analisis kimia yang
didasarkan pada pengukuran intensitas warna
larutan yang akan ditentukan konsentrasinya
dibandingkan dengan larutan standar, yaitu
larutan yang telah diketahui konsentrasinya.
• Penentuan konsentrasi didasarkan pada
absorpsimetri, yaitu metode analisis kimia yang
didasarkan pada pengukuran absorpsi (serapan)
radiasi gelombang elektromagnetik.

5. Spektrofotometri
 Spektrofotometri = pengukuran konsentrasi
larutan dengan menggunakan instrumen
 Spektrofotometer : instrumen yang digunakan
untuk mengukur jumlah cahaya yang diserap
atau intensitas warna yang sesuai dengan
panjang gelombang
 Pengukuran kuantitatif dari cahaya yang
diserap terukur dalam bentuk Transmitansi
dan absorbansi tersebut.

6. Tipe Radiasi Frekuensi (Hz)
Panjang
Gelombang
gamma-rays 1020-1024 <1 pm
X-rays 1017-1020 1 nm-1 pm
ultraviolet 1015-1017 400 nm-1 nm
visible 4-7.5x1014 750 nm-400 nm
near-infrared 1x1014-4x1014 2.5 µm-750 nm
infrared 1013-1014 25 µm-2.5 µm
microwaves 3x1011-1013 1 mm-25 µm
radio waves <3x1011 >1 mm
Spektrum Elektromagnetik

7. warna yang teramati Warna yang diserap Panjang gelombang
Green Red 700 nm
Blue-green Orange-red 600 nm
Violet Yellow 550 nm
Red-violet Yellow-green 530 nm
Red Green 500 nm
Orange Blue 450 nm
Yellow Violet 400 nm

8. A = abc
A : absorbance
Hukum Lambert Beer – hubungan linear antara absorbansi
dengan konsentrasi zat yang diserap
“c” konsentrasi sampel dalam (mol/L)
“a” is molar absorptivity dalam
L/[(mole)(cm)]
“b” : panjang kuvet dalam cm
Diameter kuvet atau tempat sampel = jarak cahaya
yang melalui sampel yang diserap
Dasar pengukuran Spektrofotometer

9. Transmitansi :
T = I/Io
I : intensitas cahaya setelah melewati sampel
Io : intensitas cahaya awal
Hubungan Absorbansi dengan %T :
A = -logT = -log(I/ Io)
T= (I/Io) = 10-A
%T = (I/Io) x 100
A = -logT = log(1/T)
Hubungan Transmitansi dan Absorbansi

10. Contoh :
If %T = 95%, then A = -log T
= -log(95/100) = -log(0,95) = -(-0,02227)
= 0,02227
A = 0.02227

11. HAL YANG HARUS DIPERHATIKAN DALAM
ANALSIS SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS
A. PEMBENTUKAN MOLEKUL YANG DAPAT MENYERAP
SINAR UV-VIS
• Jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah
sinar Uv Vis, maka senyawa tersebut dapat dirubah dengan
direaksikan dengan pereaksi tertentu.
• Pereaksi yang digunakan harus memenuhi beberapa
persyaratan, yaitu:
1. Reaksinya selektif dan sensitif
2. Reaksinya cepat, kuantitatif, dan reprodusibel (ajeg)
3. Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama
• Keselektifan dapat dinaikkan dengan mengatur pH,
pemakaian masking agent, atau penggunaan Teknik ekstraksi

12. B. WAKTU OPERASIONAL (OPERATING TIME)
• Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil
reaksi atau pembentukkan warna.
• Tujuannya untuk mengetahui waktu pengukuran
yang stabil
• Waktu operasional ditentukan dengan mengukur
hubungan antara waktu pengukuran dengan
absorbansi larutan.

13. C. PEMILIHAN PANJANG GELOMBANG
• Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis
kuantitatif = Panjang gelombang yang mempunyai
absorbansi maksimal.
• Untuk memilih Panjang gelombang maksimal,
dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara
absorbansi dengan Panjang gelombang dari suatu
larutan baku pada konsentrasi tertentu.

15. MENGAPA HARUS
MENGGUNAKAN
PANJANG
GELOMBANG
MAKSIMUM?
Pada panjang gelombang maksimal,
kepekaannya juga maksimal,
perubahan absorbansi untuk setiap
satuan konsentrasi adalah yang
paling besar
Di sekitar panjang gelombang
maksimal, bentuk kurva absorbansi
datar dan pada kondisi tertentu
Hukum LB-Beer akan terpenuhi
Jika dilakukan pengukuran ulang
maka kesalahan yang disebabkan
oleh pemasangan ulang panjang
gelombang akan kecil sekali, Ketika
digunakan panjang gelombang
maksimal

16. • Variabel yang mempengaruhi absorbansi:
1. Jenis pelarut
2. pH larutan
3. Suhu
4. Konsentrasi tinggi
5. Zat-zat penganggu

17. D. PEMBUATAN KURVA BAKU
 Dibuat seri larutan dari zat yang akan dianalisis
dengan berbagai konsentrasi.
Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai
konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang
merupakan- hubungan antara absorbansi (y) dengan
konsentrasi (x).
Bila Hukum Lambert-Beer terpenuhi, maka kurva
baku berupa garis lurus.
Kemiringan atau slope adalah a (absortivitas molar).
Penyimpangan dari garis lurus biasanya dapat
disebabkan oleh:
1) Kekuatan ion yang tinggi
2) Perubahan suhu
3) Reaksi ikutan yang terjadi

20. E. PEMBACAAN ABSORBANSI SAMPEL ATAU CUPLIKAN
 Absorban yang terbaca pada spektrofotometer =
0,2 – 0,8
atau 15% - 70% jika dibaca sebagai transmitans.
 kesalahan dalam pembacaan T adalah 0,005 atau
0,5% (kesalahan fotometrik) sebagaimana grafik:

21. PENYIMPANGAN HK. LAMBERT-BEER

22.  Larutan pekat
Pada konsentrasi larutan yang terlalu pekat,
Absorbansi yang terbaca terlalu tinggi, sehingga
grafik tidak linear  Larutan yang diukur harus
encer
 Faktor instrumentasi  sinar yang diserap
tidak monokromatis  menyebabkan 2 panjang
gelombang maksimum
 Faktor kimia  karena terjadinya reaksi
disosiasi, asosiasi, polimerisasi, solvolysis
 Jika terjadi reaksi  konsentrasi zat yang akan
diukur berkurang
PENYIMPANGAN HK. LAMBERT-BEER

23. Spektrofotometer

24. Spektrofotometer
 Sumber cahaya (Lampu) : memancarkan semua warna
cahaya (yaitu, cahaya putih).
 Monokromator : memilih satu panjang gelombang dan
panjang gelombang yang dikirimkan melalui sampel.
 Detektor : mendeteksi panjang gelombang cahaya yang
telah melewati sampel.
 Amplifier : meningkatkan sinyal sehingga lebih mudah untuk
baca terhadap kebisingan latar belakang.

25. Komponen : lampu
Lampu
 Spektrofotometer UV
1. Lampu Gas hidrogen
2. Lampu Merkuri
 Spektrofotometer Visible
Lampu Tungsen

26. Komponen : monokromator
• Cahaya
• Semua cahaya
• Cahaya polikromatik

27. Komponen : monokromator
• Monokromator  memilih cahaya
monokromatik
• Cahaya satu warna
Cahaya
merah yang
diserap oleh
larutan hijau

28. Komponen : sample cells
Sample cells (kuvet)
 Spektrofotometer UV
Quartz (crystalline silica)
 Spektrofotometer Visible
Glass

29. Struktur kimia dan absorpsi UV
Larutan yang dapat dianalisis dengan
spektrofotometer UV  senyawa yang
mempunyai gugus kromofor
Gugus kromofor : gugus molekul yang
mengandung sistem elektronik yang dapat
menyerap energi pada daerah UV
Kromofor merupakan gugus tak jenuh
kovalen yang dapat menyerap radiasi
dalam daerah-daerah UV dan vis.

30. No Group Struktur nm
1 Karbonil > C = O 280
2 Azo -N = N- 262
3 Nitro -N=O 270
4 Thioketon -C=S 330
5 Nitrit -NO2 230
6 Diena terkonjugasi -C=C-C=C- 233
7 Triena terkonjugasi -C=C-C=C-C=C- 268
8 Tetraena terkonjugasi -C=C-C=C-C=C-C=C- 315
9 Benzena C6H6 261
STRUKTUR KROMOFOR

31. • Penentuan konsentrasi sampel :
• Ukur panjang gelombang maks
• Buat kurva standar
• Ukur sampel
• Konversi A sampel dengan kurva standar
Penentuan konsentrasi
sampel