More Related Content More from ฟลุ๊ค ลำพูน (20) 3. พันธุวิศวกรรม (Genetic Engineering)
• พันธุวิศวกรรม (genetic engineering) หมายถึง เทคโนโลยีที่ทา
ํ
การเคลื่อนย้ายยีน (gene) จากสิ่งมีชีวิตสปี ชีสหนึ่ งไปสู่สิ่งมีชีวิต
์
อีกสปี ชีสหนึ่ ง เป็ นการสร้าง DNA สายผสม (recombinant DNA)
์
• สร้างสิ่งมีชีวิตรูปแบบใหม่ (novel) ที่มีคณลักษณะแบบใหม่ ซึ่ง
ุ
ไม่เคยปรากฏในธรรมชาติมาก่อน
• เปลี่ยนแปลงหน่ วยพันธุกรรม
หรือ DNA ของสิ่งมีชีวิต
• เคลื่อนย้ายยีนที่อยู่เหนื อกฎเกณฑ์
ธรรมชาติ สิ่งมีชีวิตที่เกิดขึนอาจมียีน
้
ลูกผสมแบบใหม่
4. การโคลนยีน
Cloning : หมายถึง กระบวนการสร้างสิ่งที่มีลกษณะทางพันธุกรรม
ั
เหมือนกันกับสิ่งที่มีอยู่ก่อน
มนุษย์ร้จกโคลนนิ่งมาแต่สมัยโบราณแล้ว แต่เป็ นการรู้จกโคลนนิ่ง
ู ั
ั
ที่เกิดกับพืช นันคือ การขยายพันธุพืชโดย ไม่อาศัยเพศ เช่น การ
่
์
แตกหน่ อ
http://www.youtube.com/watch?v=OCro5zfc3uc&feature=player
_embedded#at=42
5. กระบวนการในพันธุวิศวกรรม
ประกอบด้วยกระบวนการโดยรวมคือ
1. การเตรียมยีน (gene)หรือ DNA ที่สนใจ
2. การตัด DNA อย่างจําเพาะด้วยเอนไซม์ตดจําเพาะ
ั
3. การเชื่อมต่อชิ้นส่วนของ DNA ที่แยกได้กบ DNA พาหะ (vector) เช่น
ั
พลาสมิด (plasmid), phage, cosmid
4. การนําพาหะ (vector) ที่มียีนที่สนใจแทรกอยู่ หรือ DNA สายผสม ใส่
เข้าไปในเซลล์ผรบ (host)
ู้ ั
–
หลังจากนันเลี้ยงเซลล์ผรบให้แบ่งเซลล์หลายๆครัง ทําให้เพิ่มจํานวนเซลล์
้
ู้ ั
้
หรือเพิ่มปริมาณยีนที่น่าสนใจ กระบวนการนี้ เรียกว่าการโคลนยีน (gene
cloning)
5. การคัดเลือกเซลล์ที่มี DNA สายผสมตามที่ต้องการ
7. 1.การเตรียมยีน (gene)หรือ DNA ที่น่าสนใจ
การเตรียมชิ้นส่วนยีนหรือ DNA ที่น่าสนใจมีหลายวิธีดงนี้
ั
1.
การสกัดจากเซลล์หรือเนื้ อเยื่อของสิ่งมีชีวิตที่ต้องการศึกษา ซึ่งเป็ น DNA ทังหมด
้
ในจีโนมของสิ่งมีชีวิตชนิดนัน เรียกว่า genomic DNA
้
2.
การเตรียม DNA จาก mRNA
–
โดยใช้เอนไซม์ reverse transcriptase
–
จะได้ DNA ที่สงเคราะห์ขึนหรือถอดรหัสจาก mRNA เรียกว่า complementary
ั
้
DNA (cDNA)
การสังเคราะห์ DNA โดยวิธีทางเคมี
3.
–
สามารถสังเคราะห์ oligonucleotide ให้มีลาดับเบสที่ต้องการโดยเครื่อง
ํ
สังเคราะห์อตโนมัติ
ั
–
มี 2 วิธีที่ใช้กนอย่างกว้างขวางคือ วิธี phosphate triester และวิธี phosphite
ั
triester
8. 2. การตัด DNA อย่างจําเพาะด้วยเอนไซม์ตดจําเพาะ
ั
• เอนไซม์ตดจําเพาะ (Restriction enzyme or
ั
restriction endonuclease)
• แบบที่ 2 (type II) เป็ นเอนไซม์ที่ใช้กนมากในการ
ั
ตัดต่อยีน
• ประกอบด้วยโพลีเพพไทด์เพียงชนิดเดียว
• การตัด DNA จะเกิดที่ตาแหน่ งจําเพาะในบริเวณจดจํา
ํ
(recognition site) หรือจุดใกล้กบบริเวณจดจํา ทําให้
ั
ได้ชิ้นขนาด DNA ที่มีขนาดแน่ นอน
12. 3. การเชื่อมต่อชิ้นส่วนของ DNA ที่แยกได้กบ
ั
DNA พาหะ (vector)
• การเชื่อมต่ออาศัยเอนไซม์ ligase
• การทําพันธุวิศวกรรมต้องนํา DNA ที่สนใจเข้าสู่ภายในเซลล์ผรบ โดยอาศัย DNA พาหะ
ู้ ั
(vector)
• คุณสมบัติของ DNA พาหะ (vector)มีดงนี้
ั
– มีส่วนของ DNA ที่เป็ นจุดเริ่มในการจําลองตัว (origin of replication,ORI) ทําให้
สามารถเพิ่มจํานวนตัวเองได้พร้อมๆ กับ DNA ที่ใส่เข้าไป
– มียีนเครื่องหมาย (marker gene) สําหรับใช้ในการคัดเลือก เช่น ยีนที่ดือยา
้
ปฏิชีวนะ ยีนที่เกี่ยวกับการสร้างหรือสลายกรดอะมิโนและนํ้าตาลบางชนิด
– มีบริเวณจดจําของเอนไซม์ชนิดใดชนิดหนึ่ งหรือหลายชนิดเพียง ตําแหน่ งเดียวใน
โมเลกุลของ DNA พาหะ (unique or polylinker site)
13. ชนิดของ DNA พาหะ(vector)
ขึนอยู่กบขนาดของ DNA ที่นํามาเชื่อมและเซลล์ผรบ
้
ั
ู้ ั
ตารางแสดง DNA พาหะ(vector)ชนิดต่างๆและขนาดของชิ้น DNA ที่แทรกในพาหะได้
DNA พาหะ (vector)
รูปร่าง
เซลล์ผรบ
ู้ ั
(host)
ขนาดของชิ้น DNA ที่แทรกได้
Plasmid
DNA สายคู่, วงกลม
E. coli
ยาวได้ถึง 10 กิโลเบส
Bacteriophage
DNA สายตรง, ไวรัส
Cosmid
DNA สายคู่, วงกลม
Yeast Artificial
Chromosome-YACs
โครโมโซมเทียม
,ยีสต์
E. coli
E. coli
yeast
ยาวได้ถึง 20 กิโลเบส
30-50 กิโลเบส
250-1000 กิโลเบส (1 เมกะ
เบส)
19. Fig. 14-9: Cloning by cosmids. The cosmid is cut at a BglII site next to the cos site. Donor genomic DNA is cut
using Sau3A, which gives sticky ends compatible with BglII. A tandem array of donor and vector DNA results from
mixing. Phage is packaged in vitro by cutting at the cos site. The cosmid with inserts recircularizes once in the
bacterial cell.
21. 4. การนําพาหะ (vector) ที่มียีนที่สนใจแทรกอยู่ หรือ DNA สายผสม ใส่เข้าไป
ในเซลล์ผรบ
ู้ ั
• ขันตอนการนํา DNA สายผสม ใส่เข้าไปในเซลล์ผรบมีหลายวิธี คือ
้
ู้ ั
4.1 Transformation
• เป็ นการนํา DNA ในรูปplasmidเข้าสู่เซลล์ผรบ
ู้ ั
• เซลล์ผรบที่นิยมใช้กนมากคือ E. Coli
ู้ ั
ั
• โดยทําให้เซลล์ผรบเป็ น competent cell ก่อน มีสองวิธีคือ
ู้ ั
– การใช้สารเคมี เช่น dimethyl sulfoxide-DMSO, CaCl2,
MgCl2
– Electroporation- ใช้กระแสไฟฟ้ าทําให้เกิดรูที่เยื่อหุ้มเซลล์
ทําให้ DNA หรือพลาสมิดเข้าสู่เซลล์ได้
– การใช้แสงlaser ทําให้เกิดรูที่เยื่อหุ้มเซลล์
22. 4.2 Transfection
– เป็ นการนํา DNA ของphageที่มีขนาดเล็ก เช่น M13 เข้าสู่เซลล์ผรบ
ู้ ั
– เมื่อแบคทีเรียได้รบ DNA ของphageจํานวนมาก เซลล์จะแตกและ
ั
phage จะบุกรุกเซลล์อื่นต่อไปทําให้เกิดจุดใส (clear plaque)
– จุดใส (clear plaque)คือจํานวน DNA ของphageที่เข้าสู่เซลล์
แบคทีเรีย
4.3 Transduction
– เป็ นการนํา DNA ของcosmid,lamda phage ที่มีขนาดใหญ่เข้าสู่
เซลล์ผรบ
ู้ ั
– โดยบรรจุลงในอนุภาคของ phage ก่อนแล้วจึงนําเข้าเซลล์
– วิธีนี้มีประสิทธิภาพสูงกว่า Transformation
24. 5.การคัดเลือกเซลล์ที่มี DNA สายผสมตามที่ต้องการ
5.1 การคัดเลือกโดยอาศัยลักษณะ (phenotype)
– เป็ นการอาศัยการแสดงออกของยีนเครืองหมาย
่
(marker gene) และมีการสร้างโปรตีนออกมา
– เช่น การสร้างเอนไซม์บางชนิดที่ทาให้เกิด clear
ํ
zone ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี substrate (IPTG) อยู่
– หรือพบลักษณะการดือยาในเซลล์ผรบที่ได้รบมา
้
ู้ ั
ั
จากพลาสมิด
25. 5.2 การคัดเลือกโดย DNA hybridization
– อาศัยการจับคู่กนของสาย DNA ที่เป็ นตัวติดตาม
ั
(probe) กับ DNA เป้ าหมายที่ต้องการตรวจหาที่มี
ลําดับเบสคู่สมกัน บน membrane
– โดย probe จะติดฉลากด้วยสารไอโซโทปหรือเอนไซม์
5.3 การคัดเลือกโดยวิธีทางอิมมิวโนวิทยา
– ทําได้เมื่อโคลนที่ต้องการแสดงออกได้ โดยผลิต
โปรตีน แต่โปรตีนไม่แสดงลักษณะหรือ phenotype
ที่ชดเจน
ั
– เป็ นการตรวจสอบโปรตีนที่เซลล์ผลิตขึนโดยใช้
้
แอนติบอดีที่จาเพาะกับโปรตีนที่ต้องการนัน
ํ
้
26. การคัดเลือกโดยอาศัยลักษณะ (phenotype)
• Plasmid/phageที่มีส่วนของยีนที่สร้าง b-galactosidase จะสร้างเฉพาะ afragment
• เมื่อ Plasmid/phage ถูกนําเข้าสู่แบคทีเรีย ภายใต้ภาวะที่ถกกระตุ้นด้วย IPTG
ู
จะทําให้มีการสร้าง b-galactosidaseในแต่ละ fragment ซึ่งสามารถเปลี่ยน Xgal ให้เป็ นสีนํ้าเงินได้
• แต่ถ้ามี foreign DNA มาเชื่อมจะทําให้เกิดการทํางานของยีนดังกล่าวบกพร่อง
• ไม่มีการสร้าง b-galactosidase ไม่สามารถเปลี่ยน X-gal ได้จึงให้โคโลนี สีขาว
29. ขันตอนของกระบวนการ PCR
้
1. การแยกสายดีเอ็นเอเกลียวคู่ออกจากกัน (Denaturation) ใช้
อุณหภูมิ ประมาณ 94 องศาเซลเซียส เมื่อเริ่มต้นดีเอ็นเอ
แม่แบบ จะอยู่ในลักษณะที่เป็ นเกลียวคู่ เมื่อเพิ่มอุณหภูมิถึง
ประมาณ 94 องศาเซลเซียส จะทําให้พนธะไฮโดรเจนระหว่างคู่
ั
เบสของดีเอ็นเอถูกทําลาย ทําให้เส้นดีเอ็นเอแยกออกจากกัน
2. การจับของไพรเมอร์กบ DNA แม่แบบ (Annealing) เมื่อแยกสาย
ั
ดีเอ็นเอออกจากกันแล้ว จะลดอุณหภูมิลงเหลือ 40 - 62 องศา
เซลเซียส เพื่อให้ดีเอ็นเอสังเคราะห์ขนาดสันประมาณ 15 - 25
้
คู่เบส ที่เรียกว่า ไพร์เมอร์ (Primer) เข้ามาจับบริเวณที่มีลาดับ
ํ
เบสคู่สมกัน ในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ
30. 3. การสังเคราะห์ DNA สายใหม่ต่อจากไพรเมอร์
(Extension) ใช้อณหภูมิ ประมาณ 68-72 องศาเซลเซียส
ุ
ในขันตอนนี้ จะเป็ นการสร้างสายดีเอ็นเอต่อจาก
้
ไพร์เมอร์ โดยอุณหภูมิที่ใช้จะพอเหมาะกับ การทํางาน
ของ Taq DNA polymerase
33. ลายพิมพ์ DNA (DNA Fingerprint)
DNA ทังหมดของสิ่งมีชีวิตนันประกอบด้วย 2 ส่วน
้
้
• coding DNA ทําหน้ าที่ควบคุมการสร้างโปรตีนที่
มีความสําคัญต่อกลไกต่างๆ ภายในร่างกาย ซึ่งจะ
มีอยู่เพียงร้อยละ 5 ของชุด DNAทังหมด
้
• noncoding DNA ร้อยละ 95 มีส่วนหนึ่ งที่เป็ นเบส
ซําต่อเนื่ อง (tandem repeat) อยู่หลายตําแหน่ ง
้
34. Tandem Repeat
เบสซําต่อเนื่ องนี้ เองที่นํามาทําเป็ นลายพิมพ์ดีเอ็นซึ่งเป็ น
้
เครื่องหมายพันธุกรรม ทําให้สามารถรู้ลกษณะของจํานวนการ
ั
ซําของท่อน DNA แต่ละชุดในแต่ละตําแหน่ งบนสาย DNA ของ
้
สิ่งมีชีวิตและบุคคลได้
สามารถใช้ความแตกต่างกันของขนาดและจํานวนการซํา
้
ของท่อน DNA แต่ละชุดนี้ บ่งบอกถึงข้อมูลพันธุกรรม
เฉพาะของแต่ละบุคคลได้
35. หลักการทํางานของเทคโนโลยีลายพิมพ์ DNA
1. เก็บตัวอย่างเซลล์ ตัวอย่างต้องมี DNA ที่มีคณภาพ ไม่เสื่อม
ุ
สลาย (ปัจจัยที่ทาให้ DNA เสื่อมสลายคือ ระยะเวลา อุณหภูมิ
ํ
ความชื้น แสงแดด สารเคมี จุลินทรีย์ ฯลฯ)
2. สกัด DNA จากเซลล์ของตัวอย่าง
3. ตรวจลายพิมพ์ดีเอ็นเอ หลักการคือ เลือกตัด DNA ในส่วนที่
แสดงเอกลักษณ์เฉพาะบุคคล โดยใช้ restriction enzyme
จากนันนําชิ้นส่วน DNA ที่ถกตัดมาวิเคราะห์ตามขนาดด้วยวิธี
้
ู
Gel Electrophoresi
4. แปลผลลายพิมพ์ DNA โดยการอ่านผลจากลักษณะตําแหน่ ง
ของแถบดีเอ็น หรือกราฟที่ได้
36. ประโยชน์ ของลายพิมพ์ DNA
• ใช้พิสจน์ ความสัมพันธ์ทางสายเลือด
ู
• ใช้ในการติดตามการรักษาผูป่วยที่ได้รบการปลูก
้
ั
ถ่ายไขกระดูก ในการรักษาลูคีเมีย ผูป่วยต้องรับ
้
การปลูกถ่ายไขกระดูกจากผูให้ หากลายพิมพ์ดี
้
เอ็นเอเลือดผูป่วยเปลี่ยนไป แต่ลายพิมพ์เซลล์อื่น
้
ๆ เหมือนเดิม แสดงว่าร่างกายไม่ปฏิริริยาต่อต้าน
ไขกระดูกจากผูให้
้
• ใช้พิสจน์ หลักฐานทางนิติเวชศาสตร์
ู
37. Gel Electrophoresis
Electrophoresis เป็ นเทคนิคที่ใช้แยกโมเลกุลของ
สารที่มีประจุออกจากกันโดยใช้กระแสไฟฟ้ า
่
สารที่มีประจุนันเคลื่อนที่ผานตัวกลางชนิดหนึ่ งใน
้
สารละลาย สารที่ประจุต่างกันจะเคลื่อนที่ไปใน
ทิศทางตรงกันข้าม
อัตราการเคลื่อนที่ยงขึนอยู่กบขนาด รูปร่างโมเลกุล
ั ้
ั
แรงเคลื่อนไฟฟ้ าและตัวกลางที่ใช้ด้วย
38. โมเลกุลของ DNA ประกอบด้วยหมู่ฟอสเฟตจํานวน
มาก สารละลายของ DNA จึงมีประจุเป็ นลบที่ pH
เป็ นกลาง
เมื่ออยู่ในสนามไฟฟ้ าโมเลกุลของ DNA จะเคลื่อนที่
จากขัวลบไปยังขัวบวก
้
้
ความเร็วในการเคลื่อนที่ของโมเลกุล DNA จึงขึนอยู่
้
กับขนาดเป็ นส่วนใหญ่ อย่างไรก็ตามมีปัจจัยอื่นที่มี
ผลต่อการเคลื่อนที่ของโมเลกุล DNA ด้วยดังนี้
