HIDROLISIS SUKROSA DENGAN ENZIM INVERTASE UNTUK PRODUKSI ETANOL
MENGGUNAKAN Zymomonas mobilis
Nuzula Awwalurrizki*, Surya ...
semakin menurun ditambah adanya efek
gas rumah kaca, indikasi ini sebagai
penyebab perubahan iklim di muka bumi
(Sri Utami...
yang diperoleh merupakan preparat enzim
invertase.
Penentuan Kurva Standar Gula Invert
secara Spektrofotometri
Penentuan g...
ruang. Kemudian dipanaskan dalam air
mendidih selama 10 menit. Selanjutnya
didinginkan. Gula reduksi yang terbentuk
diukur...
diberi beberapa lubang kecil yang berfungsi
untuk mengurangi tekanan udara
didalamnya apabila adonan mulai
mengembang. Bub...
Panjang Gelombang ( )λ
Gambar 2 menunjukkan bahwa
puncak absorbansi tertinggi dicapai pada
panjang gelombang 595 nm. Setel...
Gambar 4Pengaruh pH terhadap Aktivitas
Enzim Invertase
Gambar diatas menunjukkan
aktivitas maksimum crude invertase yaitu
...
Gambar 4.9 Pengaruh Waktu Hidrolisis
Terhadap Kadar Gula Reduksi
Waktu inkubasi merupakan waktu
yang dibutuhkan oleh enzim...
hidrolisis, sukrosa memiliki absorbansi
awal sebesar 0,067, artinya dalam larutan
sukrosa tersebut terdapat 0,247 gram gul...
Gambar 8 Yield Etanol Terhadap Waktu
Pengukuran
Pada fermentasi selama 60 jam
terlihat adanya penurunan yield etanol
menja...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Hidrolisis Sukrosa Dengan enzim invertase untuk produksi etanol menggunakan zymomonas mobilis

2,354 views

Published on

0 Comments
1 Like
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total views
2,354
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
1
Actions
Shares
0
Downloads
40
Comments
0
Likes
1
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Hidrolisis Sukrosa Dengan enzim invertase untuk produksi etanol menggunakan zymomonas mobilis

  1. 1. HIDROLISIS SUKROSA DENGAN ENZIM INVERTASE UNTUK PRODUKSI ETANOL MENGGUNAKAN Zymomonas mobilis Nuzula Awwalurrizki*, Surya Rosa Putra1 Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember ABSTRAK Produksi etanol langsung dari substrat sukrosa oleh bakteri Zymomonas mobilis, menunjukkan konversi etanol yang lebih rendah daripada menggunakan campuran glukosa dan fruktosa. Pembentukan hasil samping (sorbitol dan levan) dapat turun secara signifikan ketika menggunakan sumber karbon campuran antara glukosa dan fruktosa. Untuk itu perlu dilakukan hidrolisa terhadap substrat sukrosa menggunakan enzim invertase sebelum fermentasi. Enzim invertase didapatkan dari ekstrak kasar ragi roti (Saccharomycer cerevisiae ) yang di inkubasi selama 24 jam pada suhu 40 oC. Proses hidrolisis dengan enzim invertase dilakukan pada keadaan dimana aktivitas enzim mencapai maksimum, yaitu pada pH 4,5 dengan inkubasi pada suhu 30 oC dan waktu inkubasi selama 5 jam. Besarnya gula reduksi hasil hidrolisis sebanyak 10,22 gram. Sumber karbon hasil hidrolisis inilah yang akan digunakan dalam fermentasi etanol pada pH 5,5. Fermentasi berjalan efektif selama 120 jam dengan jumlah sel bakteri awal sebanyak 2,6 x 10 10.. Pada kondisi tersebut, kadar etanol maksimum yang dihasilkan adalah sebanyak 4,87 gram/100 mL dengan yield etanol sebesar 92,89% jika dibandingkan dengan hasil teoritis. Kata kunci : Zymomonas mobilis, enzim invertase , yield etanol, fermentasi etanol ABSTRACT Ethanol production from sucrose by Zymomonas mobilis shows lower conversion into ethanol than from glucose and fructose. By- product formation (sorbitol and levan) was greatly reduced when an equimolar mixture of glucose and fructose was used as carbon source in culture. Cause of that sucrose needs to be hydrolized using invertase before fermentation. Invertase enzymes obtained from yeast (Saccaromyces cerevisiae ) with incubation at temperature 30oC for about 24 hours. Hydrolysis process using invertase were be done when the enzyme activity reached maximum at pH 4,5 with temperature incubation at 30oC and incubation time for 5 hours. The amount of reduction sugar fron hydrolysis is 10,22 grams. This fraction will be used as carbon source in ethanol fermentation at pH 5,5. Fermentation runs effefctively for 120 hours with initial bacterial cell as 2,6 x 10 10 (cell / mL). In this case, highest value of ethanol is 4,87 g/100 mL with 92,89% ethanol yield when compared in theoretical. Keywords : Zymomonas mobilis, invertase , ethanol yield, etanol fermentation. PENDAHULUAN Akses masyarakat Indonesia terhadap energi masih terbatas. Meskipun variasi sumberdaya energi dalam negeri beragam dan cadangan minyak diperkirakan hanya mampu mensuplai 18 tahun lagi, namun kenyataannya, pangsa konsumsi bahan bakar minyak mencapai proporsi tertinggi sekitar 63%. Tingkat konsumsi yang tidak sebanding dengan tingkat pembentukan menyebabkan kelangkaan terhadap bahan bakar tersebut. Sumber bahan bakar merupakan produk yang renewable sehingga tingkat recovery nya membutuhkan waktu yang sangat lama (Mukhtasor, 2009). Selain itu pembakaran bahan bakar fosil telah memberikan dampak negatif terhadap lingkungan. Kualitas udara yang Prosiding KIMIA FMIPA - ITS Prosiding Skripsi Semester Genap 2008/2009 SK - 34
  2. 2. semakin menurun ditambah adanya efek gas rumah kaca, indikasi ini sebagai penyebab perubahan iklim di muka bumi (Sri Utami, 2007). Sumber energi terbarukan yang berpotensi besar untuk dikembangkan adalah sumber daya hayati atau biofuel . Salah satu teknologi yang dilakukan untuk mendukung pengadaan energi ini yaitu produksi bietanol . Bakteri Zymomonas mobilis diyakini sebagai mikroorganisme paling ideal penghasil etanol karena memproduksi etanol terbanyak, toleran terhadap etanol konsentrasi tinggi dan pH rendah. Zymomonas mobilis merupakan bakteri anaerob fakultatif yang memanfaatkan glukosa, sukrosa dan fruktosa untuk menghasilkan etanol dengan jalur metabolisme Enter- deudoroff Pathway (Tano dan Bozato, 2003). Selama ini, penggunaan substrat gula yang sering digunakan untuk fermentasi yaitu glukosa atau sukrosa. Sukrosa lebih mudah didapatkan daripada glukosa karena sukrosa merupakan gula meja yang dikonsumsi sehari- hari. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Hani, 2009, produksi etanol dengan substrat sukrosa menghasilkan produk etanol sebanyak 61,18%. Rendahnya nilai ini disebabkan akibat adanya produk samping yang ikut dihasilkan selama proses fermentasi, contohnya levan dan sorbitol (Swing and Deley, 1977). Pembentukan levan dan sorbitol, dapat menurunkan ethanol yield sampai 80% dari teoritisnya (E. Favela, 1987). Berangkat dari masalah ini, sukrosa perlu dipecah terlebih dahulu menjadi gula sederhana sebelum difermentasikan. Enzim invertase merupakan enzim yang memiliki efisiensi tinggi yang spesifik dalam mengubah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa (dikenal dengan gula invert). Enzim invertase dapat diambil dari ekstrak kasar ragi roti (Saccharomyces cerevisiae ). Khamir ini memiliki aktivitas invertase yang tinggi sehingga sukrosa dengan cepat diubah menjadi glukosa dan fruktosa untuk keperluan metabolismenya. Dengan adanya enzim invertase, penggunaan sukrosa akan lebih efektif dan diharapkan mampu menurunkan produk samping yang terbentuk sehingga dapat meningkatkan kadar etanolnya. METODOLOGI PENELITIAN Alat dan Bahan Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah fermentor sistem batch yaitu menggunakan erlenmeyer untuk fermentasi, ultrasonikator, cawan petri, tabung reaksi, laminary air flow , autoclave , inkubator, rotary shaker , centrifuge Thermo IEC CL40R, kromatografi gas Shimadzu GC- 14B, spektronik Genesys 20, termometer, neraca analitik mettler AE 200, pH meter 510, homogenizer, penangas serta peralatan gelas lain. Bahan Mikroorganisme yang digunakan dalam penelitian ini adalah biakan Zymomonas mobilis dari Jepang. Media Zymomonas mobilis yang digunakan untuk regenerasi dan penumbuhan (agar miring) adalah Nutrient Agar (NA) 5%. Media untuk starter terdiri atas KH2PO4 1,0 g/L, (NH4)2SO4 1,0 g/L, MgSO4.7H2O 0,5 g/L, yeast extract 5g/L, dan glukosa 100g/L. Media untuk fermentasi terdiri atas sukrosa 100g/L, yeast extract 5g/L, KH2PO4 1,0g/L, (NH4)2SO4 1,0g/L, MgSO4.7H2O 0,5 g/L. Crude invertase dibuat dari ragi roti (Saccharomyces cereviciae ). Reagen lain yang dibutuhkan diantaranya ; NaHCO3, asam sitrat dan na- sitrat untuk buffer sitrat, reagen bradfod, BSA, reagen Somogy- nelson A dan B, reagen arseno- molybdad. PROSEDUR KERJA Isolasi Ekstrak Kasar Invertase dari Ragi Roti (Saccharomyces cerevisiae) Ragi roti sebanyak 55 gram ditimbang, dimasukkan kedalam beaker gelas kemudian ditambahkan 150 ml NaHCO3 dan diaduk sampai menjadi bubur. Bubur ragi yang didapat dimasukkan ke dalam homogenizer dan diputar pada 7500 rms selama 5 menit. Bubur yang telah di homogenizer dituang ke dalam erlenmeyer. Mulut erlenmeyer ditutup dengan kapas yang sudah dibalut kasa- aluminium foil. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 40 oC selama 24 jam. Hasil inkubasi diautolisis dengan menggunakan ultrasonifikator pada 16 rms selama 20 menit. Setelah proses autolisa ini, campuran disentrifuge selama 15 menit pada suhu 10 oC dengan kecepatan 3500 rms. Proses ini terbentuk filtrate dan residu, filtrat yang terbentuk didekantasi dan diperoleh supernatannya. Supernatan Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
  3. 3. yang diperoleh merupakan preparat enzim invertase. Penentuan Kurva Standar Gula Invert secara Spektrofotometri Penentuan gula invert secara spektrofotometri dilakukan dengan pembuatan kurva standart gula invert yang menghubungkan antara konsentrasi dengan absorbansi. Standart gula invert dibuat dengan cara: Larutan gula invert 0,0025M dibuat variasi konsentrasi yaitu 1; 1,25; 1,5; 1,75; 2; 2,25 dan 2,5 (x10 - 3M) dengan pelarut aquades. Selanjutnya masing- masing dimasukkan dalam tabung reaksi sebanyak 0,5 ml. Kadar gula reduksinya ditentukan dengan menggunakan metode Somogy- Nelson. Pengukuran secara spektrofotometri dilakukan pada panjang gelombang 540 nm. Penentuan Kandungan Protein Invertase Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Bradford Panjang gelombang maksimum ( maks)λ ditentukan dengan menggunakan larutan standart Bovine Serum Albumine (BSA) yang ditambah dengan reagen Bradford kemudian ditentukan serapannya menggunakan spektrofotometer. Larutan Bradfod dibuat dengan cara: 25 mg coomise brilliant blue G- 250 dilarutkan dalam 12,5 ml etanol 95% (v/v dan ditambahkan dengan 25 ml asam fosfat 85%(w/v). Larutan yang di dapat diencerkan dengan aquadest sampai 250 ml. Larutan stok BSA 2000 ppm (dibuat dari 100 mg BSA dalam 25 ml aquades, diaduk perlahan- lahan, setelah itu diencerkan sampai 50 ml). Selanjutnya diambil sebanyak 5 ml dan ditambahkan 3 ml reagen Bradford dan diencerkan sampai 10 ml. Larutan ini diaduk dan diinkubasi selama 5 menit pada temperatur 37 0C. Larutan standart BSA diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 560- 620 nm dengan interval 5 nm sebanyak tiga kali untuk masing- masing panjang gelombang, kurva dibuat antara panjang gelomb ang ( ) terhadap absorbansiλ (A) sehingga diperoleh maksλ . Pembuatan Kurva Standar BSA Kurva standart BSA dibuat dengan membuat beberapa konsentrasi yaitu: 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm, 400 ppm, 500 ppm, 600 ppm, 700 ppm. Variasi konsentrasi larutan tersebut dibuat dengan menggunakan larutan standart BSA 2000 ppm dengan cara diambil sebanyak 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5 ml lalu diencerkan dengan aquadest sampai 10 ml. Selanjutnya diambil 7 ml dan ditambahkan 3 ml reagen bradfod. Larutan diaduk dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37 0C. Pengukuran absorbansi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum yang telah didapatkan pada prosedur sebelumnya. Blanko dibuat dengan 7 ml aquades yang ditambah 3 ml reagen Bradford. Penentuan Kandungan Protein Invertase Penentuan kandungan protein pada crude invertase dilakukan dengan mengencerkan 1 ml enzim invertase dengan aquadet sampai 10 ml. Hasil pengenceran diambil 7 ml dan ditambahkan 3 ml reagen Bradfod, lalu diinkubasi selama 5 menit. Setelah waktu inkubasi, adsorbansi larutan enzim invertase ditentukan pada panjang gelombeng maksimum dan diukur secara duplo. Hasil adsorbansi yang diperoleh dikonversikan pada persamaan garis dari kurva standart BSA yang telah dibuat sehingga didapatkan konsentrasi enzim invertase. Penentuan Kondisi Optimum Invertase Kondisi optimum reaksi enzim meliputi suhu, pH dan lama inkubasi. Kondisi ini di tentukan melalui serangkaian percobaan yang kondisinya divariasikan. Penentuan suhu optimum dilakukan dengan cara sebagai berikut : Larutan sukrosa 0,25 M sebanyak 2 mL dengan pH 4,5 dimasukkan kedalam 6 tabung reaksi. Masing- masing tabung diatur suhunya (20oC, 25 oC, 37 oC, 60 oC, 80oC, 100 oC). Selanjutnya ditambahkan 1 mL enzim invertase pada tiap tabung dan diinkubasi selama 20 menit (selama inkubasi suhu tetap dalam keadaan terjaga). Tabung- tabung tersebut dipanaskan dalam air mendidih selama 10 menit. Setelah dingin, gula reduksi yang terbentuk diukur menggunakan metode Somogy- Nelson. Sebelum diukur perlu dilakukan pengenceran agar serapannya dapat terbaca. Penentuan pH optimum dilakukan dengan cara sebagai berikut : larutan sukrosa 0,25 M sebanyak 2 mL dalam tabung reaksi dibuat dengan variasi pH (3; 4; 4,5; 5; 5,5; 6 dan 7). Masing- masing fraksi ditambahkan 1 mL enzim invertase dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
  4. 4. ruang. Kemudian dipanaskan dalam air mendidih selama 10 menit. Selanjutnya didinginkan. Gula reduksi yang terbentuk diukur menggunakan metode Somogy- Nelson. Sebelum diukur perlu dilakukan pengenceran agar serapannya dapat terbaca. Lama inkubasi reaksi enzimatis ditentukan dengan cara sebagai berikut : disediakan beberapa labu erlenmeyer. Masing- masing diisi dengan larutan sukrosa 10% sebanyak 100 mL dalam buffer sitrat dengan pH 4,5. Ke dalam masing- masing erlenmeyer ditambahkan 5 mL enzim. Perbandingan enzim dengan substrat sukrosa 10 % adalah 1:20. Kemudian diinkubasi pada suhu optimum selama beberapa jam dengan kecepatan 60 rpm. Setiap interval waktu 1 jam reaksi dihentikan dengan pemanasan dalam air mendidih selama 10 menit. Kadar gula reduksi ditentukan dengan metode Somogy- Nelson. Sebelum diukur perlu dilakukan pengenceran agar serapannya dapat terbaca. Regenerasi Zymomonas mobilis Biakan murni Zymomonas mobilis diremajakan pada agar miring (media NA) pH 5,5 yang telah disterilisasi pada suhu 121 oC dan tekanan 1 atm selama 30 menit, selanjutnya diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam. Zymomonas mobilis pada agar miring (media NA) ini menjadi stok kultur yang diregenerasi pada media NA yang baru sebelum digunakan. Kultur baru diinokulasikan pada 10 ml media kompleks pH 5,5 sebagai starter awal dan diinkubasi dengan shaker selama 20 jam suhu 30oC yang selanjutnya akan ditransfer ke media yang lebih besar yaitu 90 ml media kompleks dengan perlakuan dan inkubasi yang sama setelah media menunjukkan keadaan yang keruh menandakan bakteri memperbanyak diri. Sebanyak 100 ml starter selanjutnya ditransfer dengan perlakuan yang sama sampai volume 1000 ml. Penentuan Kurva Petumbuhan Zymomonas mobilis . Sebanyak satu ose Zymomonas mobilis dari media padat (NA) agar miring diinokulasi pada 10 mL media dan diinkubasi pada suhu 30oC selama 20 jam dengan dishaker 120 rpm. Setelah 20 jam, starter ini ditransfer ke 90 mL media kompleks dan diinkubasi pada kondisi yang sama. 100 mL starter ini selanjutnya ditransfer lagi ke dalam 900 media kompleks dan diinkubasi pada suhu 30oC dan dishaker 120 rpm. Selama inkubasi, pertambahan biomassa setiap jam dimonitor dengan pengukuran turbiditas menggunakan Spektronik Genesys 20 pada 540 nm. Pembuatan Media Fermentasi (Hidrolisat) Media Fermentasi dibuat sebanyak 800 mL untuk 8 proses fermentasi. Enzim invertase yang ditambahkan dengan perbandingan 20 : 1. Sukrosa 10 % dilarutkan dalam larutan buffer dengan pH optimum yang akan dicari. Kemudian ditambahkan 5 mL enzim dalam 100 mL larutan substrat. Selanjutnya diinkubasi berdasarkan waktu optimum. Enzim yang ada dimatikan dengan cara dipanaskan pada air mendidih selama 10 menit. Larutan yang terbentuk disentrifuse. Filtrat yang didapat diuji kadar gula invertnya menggunakan metode Somogy- Nelson. Filtrat ini yang akan digunakan sebagai media fermentasi. Penentuan Pola Fermentasi Fermentasi menggunakan bakteri Zymomonas mobilis dilakukan dalam 8 labu erlenmeyer yang diisi dengan 100 mL media fermentasi yang telah dihidrolisis oleh enzim invertase dalam kondisi suhu, pH dan lama inkubasi optimum (hidrolisat) ditambah biomassa hasil sentrifuse 200 mL inokulum. Fermentasi ini dilakukan pada inkubator shaker 50 rpm. Hasil fermentasi diambil setiap 15 jam sekali sampai 120 jam untuk disentrifuse (memisahkan filtrat dengan biomassa) sehingga filtratnya dapat diuji kualitatif etanol, residu glukosa dan kadar etanolnya. HASIL DAN DISKUSI Isolasi Ekstrak Kasar Invertase dari Ragi Roti (Saccharomyces cerevisiae ) Ragi roti sebanyak 55 gram dilarutkan kedalam larutan NaHCO3 0,1 M sebanyak 150 mL. NaHCO3 ini berfungsi untuk melarutkan sel ragi sehingga pada akhirnya enzim invertase akan berada pada filtratnya. Selanjutnya larutan ini diaduk sampai menjadi bubur. Buburan ragi dimasukkan ke dalam homogenizer pada 7500 rpm selama 5 menit. Homogenizer berfungsi untuk menghomogenkan larutan dengan ragi. Bubur yang didapat dituang dalam 3 erlenmeyer 250 mL. Penutup erlenmeyer dibuat dari kapas yang dibalut kasa- aluminium foil. Pada penutup ini Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
  5. 5. diberi beberapa lubang kecil yang berfungsi untuk mengurangi tekanan udara didalamnya apabila adonan mulai mengembang. Bubur ragi dalam erlenmeyer diinkubasi pada suhu 40 oC selama 24 jam. Inkubasi ini diperlukan untuk mengeluarkan enzim dari ragi. Setelah inkubasi, pada bubur dilakukan pemecahan sel menggunakan ultrasonifikator pada kecepatan 16 rms selama 20 menit. Larutan hasil autolisa selanjutnya disentrifuge pada suhu 10 oC dengan kecepatan 3500 rpm. Filtrat yang terbentuk didekantasi dan diperoleh supernatannya. Supernatan inilah yang disebut sebagai “crude invertase” yang berwarna kuning. Ekstrak kasar invertase dapat dilihat pada gambar berikut: Penentuan Kurva Standar Gula Invert Secara Spektrofotometri Penentuan kurva standart gula invert ini bertujuan untuk menentukan persamaan yang nantinya akan digunakan untuk menghitung konsentrasi gula reduksi (gula invert) yang terbentuk dari hasil hidrolisis sukrosa oleh enzim invertase. Standart gula invert dibuat dengan cara membuat larutan gula invert 0,0025 M yang kemudian diencerkan dalam pelarut aquades sehingga didapatkan beberapa variasi konsentrasi 1; 1,25; 1,5; 2; 2,25 dan 2,5 (x 10 - 3 M). Masing- masing larutan dimasukkan dalam tabung reaksi sebanyak 0,5 mL. Karena fruktosa dan glukosa merupakan gula reduksi sehingga analisa gula invert dilakukan dengan menggunakan metode Somogy- Nelson. Kurva standar guls invert dibuat dengan mengalurkan nilai absorbansi terhadap konsentrasi larutan. Dari hubungan keduanya, didapatkan grafik sebagai berikut: Gambar 1 Kurva standart gula invert Dari grafik diatas dapat dilihat bahwa nilai absorbansi mengalami kenaikan sejalan dengan semakin besarnya konsentrasi gula invert dalam larutan, sehingga didapatkan persamaan kurva yang memenuhi hukum Lambert- Beer y = 977.231 x Nilai R2 dari kurva diatas adalah 0,998, hal ini menunjukkan bahwa kelinearan kurva standart baik karena hampir mendekati +1, yang mana titik- titik pada kurva standart melewati garis lerengnya. Penentuan Kandungan Protein Ekstrak Kasar Invertase Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Bradford Larutan stok BSA 2000 ppm dapat dibuat dengan cara: 100 mg BSA dilarutkan dalam 25 mL aquades kemudian diaduk perlahan sampai larut setelah itu diencerkan dengan aquades sampai 50 mL. Larutan ini diambil sebanyak 5 mL dan ditambahkan 3 mL reagen Bradford lalu diencerkan dengan aquades sampai volume 10 mL. Larutan ini dibiarkan selama 5 menit pada suhu ruang untuk menyempurnakan reaksi antara Bradford dengan protein pada enzim. Reagen Bradford dibuat dengan cara : coomise brilliant blue G- 250 sebanyak 25 mg dilarutkan dalam 1,5 mL etanol 95 % (v/v) dan ditambahkan asam fosfat 85 % (w/v). Larutan ini diencerkan sampai volume 250 mL. Setelah dicampur dengan reagen Bradford, larutan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada kisaran panjang gelombang 560- 620 nm karena warna yang diserap oleh larutan adalah biru sedangkan warna biru memiliki panjang gelombang antara 580- 595 (Khopkar, 1995). Untuk larutan blanko yang digunakan dibuat dengan menambahkan 3 mL reagen Bradford dan 7 mL aquades. Dari nilai pengukuran absorbansi didapatkan grafik sebagai berikut. Gambar 2 Kurva Absorbansi dalam Variasi Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
  6. 6. Panjang Gelombang ( )λ Gambar 2 menunjukkan bahwa puncak absorbansi tertinggi dicapai pada panjang gelombang 595 nm. Setelah itu turun seiring menjauhnya puncak serapan. Serapan ini dihasilkan karena terjadi absorbsi sinar tampak oleh kompleks commassie brilliant blue- kasein pada panjang gelombang maksimumnya akan diperoleh kepekaan analitis yang tinggi. Hasil yang didapat ini didukung oleh penelitian yang dilakukan AA. Bradford (1976), yaitu serapan maksimum terletak pada 595 nm. 4.1.1 Pembuatan Kurva Standar BSA Kurva standart BSA dibuat dengan membuat beberapa pengenceran dari larutan induk BSA 2000 ppm menjadi beberapa konsentrasi yaitu: 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm, 400 ppm, 500 ppm, 600 ppm, 700 ppm. Variasi konsentrasi larutan tersebut dibuat dengan menggunakan larutan standart BSA 2000 ppm, larutan tersebut diambil sebanyak 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5 mL lalu diencerkan dengan aquades sampai 10 ml. Selanjutnya diambil 7 ml dan ditambahkan 3 ml reagen bradfod. Masing- masing larutan diaduk dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Kemudian pengukuran absorbansi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum yang telah ditentukan sebelumnya yaitu pada = 595λ nm . Blanko yang digunakan adalah 7 ml aquades yang ditambah dengan 3 ml reagen Bradfod. Kurva standar dibuat dengan mengalurkan absorbansi sebagai ordinat (sumbu y) dan konsentrasi sebagai absis (sumbu x). Gambar 3 Kurva Standart Larutan BSA Nilai absorbansi mengalami kenaikan seiring bertambahnya konsentrasi BSA hingga diperoleh persamaan garis antara konsentrasi BSA dan absorbansi yaitu: y = 0,001339x Koefisien korelasi dari kurva hasil pengamatan adalah R2 = 0,998 Penentuan Kandungan Protein Ekstrak kasar Invertase Crude diambil sebanyak 1 mL kemudian diencerkan menjadi 10 mL, setelah itu hasil pengenceran tersebut diambil sebanyak 7 mL dan ditambahkan 3 mL reagen Bradford. Larutan ini dibiarkan selama 5 menit untuk menyempurnakan reaksi yang terjadi. Larutan yang telah diinkubasi diukur serapannya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum yang didapat, yaitu 595 nm. Absorbansi yang dihasilkan adalah sebesar 1,112 dan 1,114 sehingga diambil rata- ratanya sebesar 1,113. Hasil absorbansi ini dimasukkan kedalam persamaan reaksi y= 0,001339 x. Dari perhitungan diperoleh konsentrasi crude invertase yang terukur sebesar 831,217 ppm sedangkan konsentrasi crude invertase sebenarnya yaitu sebesar 11.874,533 ppm didapatkan dengan cara mengalikan konsentrasi terukur dengan faktor kali 100/7 (10/1 x 10/7), dimana pengenceran dengan aquades (10/1) dan pengenceran akibat penambahan reagen Bradford (10/7). Hasil ini kemudian dikonversikan dalam mg sehingga diketahui dalam 1 mL crude invertase mengandung 11,87 mg protein. Penentuan Kondisi Optimum Ekstrak Kasar Enzim Invertase Perbedaan pH berpengaruh terhadap 2 jenis, yaitu struktur enzim dan gugus fungsional enzim. Suatu enzim dapat menghasilkan produk yang maksimal pada pH optimumnya. Dari hasil penentuan pH optimum crude invertase diperoleh gambar 4. 7 Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
  7. 7. Gambar 4Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim Invertase Gambar diatas menunjukkan aktivitas maksimum crude invertase yaitu pada pH 4,5 dengan aktivitas sebesar 49,63 unit. Unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai, sebanyak 49,63 μmol gula dihasilkan oleh setiap mL enzim per menitnya. Hasil pH optimum ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh (Bergamasco et al, 2000; Akgol et al., 2001; Bayramolu et al., 2003), yang melaporkan bahwa aktifitas enzim terjadi pada range pH 3,0 - 5,0 dengan aktivitas maksimum terjadi disekitar pH 4,5. Diatas skala tersebut aktivitas enzim mengalami penurunan. Semakin basa kondisi hidrolisis menyebabkan semakin rendahnya harga aktivitas enzim crude invertase. Perubahan pH dapat menyebabkan turunnya aktivitas enzim akibat perubahan ionisasi gugus- gugus fungsionilnya karena gugus ionik berperan penting dalam menjaga konformasi sisi aktif enzim untuk mengikat dan mengubah substrat menjadi produk. Perubahan pH juga dapat menyebabkan enzim terdenaturasi sehingga menyebabkan penurunan katalitik enzim. Denaturasi enzim dakibatkan karena terjadinya pemutusan ikatan penstabil struktur (seperti ikatan ionik, hidrogen, hidrofobik) yang menghubungkan antar polimer protein. Pemutusan tersebut dapat terjadi pada protein kwartener, tersier ataupun sekunder. Pada protein kwartener terjadi pemutusan ikatan penstabil struktur karena bentuknya yang merupakan gabungan antara globular satu dengan globular lainyya sehingga dapat terjadi pemutusan ikatan tersebut pada protein tersier satu dengan protein tersier lainnya dan terjadi seterusnya, pada protein tersier membentuk protein sekunder. Penentuan suhu optimum juga ditentukan berdasarkan data yang telah didapatkan. Variasi suhu yang dibuat yaitu 20oC, 25 oC, 30 oC, 60 oC, 80oC dan 100 o C. Pengaturan ini dengan cara dipanaskan dalam air mendidih ataupun di inkubasi dalam penangas es. Ketiga optimasi baik pH, suhu serta lama inkubasi, kadar gula reduksinya dianalisa menggunakan metode Somogy- Nelson. Metode tersebut khusus untuk penentuan gula reduksi. Dari perhitungan diperoleh gambar 5 Gambar 5 Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Invertase Enzim memiliki temperatur optimum dalam melakukan fungsinya, sehingga diperoleh aktivitas enzim maksimum. Gambar 4.8 menunjukkan bahwa aktivitas optimum crude invertase dicapai pada suhu 30 oC dengan aktivitas sebesar 46,66 unit. Hasil suhu optimum ini sedikit berbeda dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh (Bergamasco et al, 2000; Akgol et al., 2001; Bayramolu et al., 2003), yang menyatakan suhu optimum enzim invertase dicapai pada 40- 60oC. Perbedaan ini kemungkinan disebabkan ketidakmurnian enzim invertase sehingga lebih tidak tahan terhadap panas. Meningkatnya suhu menyebabkan aktivitas enzim meningkat. Hal ini disebabkan karena ketika suhu naik, energi kinetik juga meningkat sehingga menambah intensitas tumbukan antara substrat dan enzim. Tumbukan yang sering terjadi akan mempermudah pembentukan kompleks enzim- substrat, sehingga produk yang terbentuk makin banyak. Sedangkan suhu yang terlalu tinggi akan mempengaruhi perubahan konformasi substrat sehingga sisi reaktif substrat mengalami hambatan untuk memasuki sisi aktif enzim dan hal ini menyebabkan aktivitas enzim akan rendah. Selain itu, tingginya suhu akan menyebabkan rusaknya interaksi nonkovalen (ikatan hidrogen, vander waals, hidrofobik dan elektrostatik) yang menjaga struktur tiga dimensi enzim sehingga enzim akan terdenaturasi. Dari data tersebut, hidrolisis sukrosa dilakukan dalam pH 4,5 dan pada suhu 30 oC. Untuk mengetahui waktu inkubasi atau hidrolisis yang optimum dapat dilihat dari gambar berikut : Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
  8. 8. Gambar 4.9 Pengaruh Waktu Hidrolisis Terhadap Kadar Gula Reduksi Waktu inkubasi merupakan waktu yang dibutuhkan oleh enzim untuk berikatan dengan substratnya. Penentuan waktu inkubasi optimum pada crude invertase dilakukan pada pH optimumnya yaitu 4,5 dan suhu optimum 30 oC. Dari gambar diatas, menunjukkan bahwa penambahan waktu inkubasi akan meningkatkan jumlah produk yang terbentuk. Dengan kata lain aktivitasnya juga meningkat sampai ia mencapai waktu optimum yaitu pada jam ke 5 setelah inkubasi.Saat inkubasi optimum ini, sisi aktif enzim akan terikat secara optimal. Apabila waktu yang dikondisikan pada enzim dan substrat kurang dari cukup, maka sisi aktif enzim belum optimal dalam mengikat substrat sehingga menyebabkan produk yang terbentuk masih sedikit ketika reaksi dihentikan. Pada jam ke 5 sampai 7, tidak terlihat adanya perbedaan yang besar, ini menandakan bahwa kemungkinan sisi aktif enzim telah jenuh oleh substrat sehingga produk yang dihasilkan hanya mengalami peningkatan ataupun penurunan yang relatif kecil. Penentuan Kurva Pertumbuhan Zymomonas mobilis Pengukuran jumlah bakteri dapat ditentukan secara tidak langsung dengan mengukur turbiditas cairan medium tumbuh menggunakan spektrofotometer (Optical Density atau absorbansi). Unit OD ini akan proporsional atau sebanding dengan massa sel dan jumlah bakteri. Meningkatnya turbidimetri dalam media adalah indeks lain dari pertumbuhan bakteri serta jumlah biomassa bakteri. Apabila sinar yang ditransmisikan atau diteruskan itu menurun artinya terjadi peningkatan populasi pada media tersebut. Dengan kata lain absorbansi yang tebaca dari sinar yang dihamburkan oleh partikel- partikel bakteri akan memberikan nilai yang besar. Gambar 6 Kurva pertumbuhan Zymomonas mobilis dalam media pH 5,5 Dari kurva pertumbuhan Zymomonas mobilis dalam media dengan pH 5,5 diatas, dapat dilihat bahwa bakteri Zymomonas mobilis melakukan adaptasi pada fasa lag selama ± 4 jam pertama. Pada fase ini, bakteri tidak mengalami pertumbuhan yang signifikan, jumlahnya cenderung tetap karena belum mengalami pembelahan. Bakteri memerlukan waktu untuk beradaptasi, selnya akan mengalami perubahan komposisi kimiawi dan ukuran serta bertambahnya substansi intraseluler sehingga siap untuk membelah diri. Waktu adaptasi ini tergolong singkat. Hal ini dikarenakan sebelumnya telah dilakukan transfer dari starter 20 mL ke starter 200 mL dengan waktu inkubasi yang sama. Fase log berakhir setelah 18 jam inkubasi. Jumlah sel yang hidup pada fase ini merupakan jumlah sel yang hidup optimal dan memiliki aktivitas yang sangat aktif dalam mengkonversi substrat menjadi etanol. Oleh karena itu pemanenan bakteri dilakukan sekitar waktu tersebut. Diatas 20 jam, bakteri sudah masuk fase stasioner. Berdasarkan teori, jumlah sel yang mati pada fase stasioner sama dengan jumlah sel hidup yang membelah sehingga seolah- olah pertumbuhannya adalah nol. Apabila waktu pengamatan diperpanjang akan didapatkan penurunan jumlah bakteri yang dapat mencapai maksimal disebabkan berkurangnya nutrisi yang tersedia sehingga jumlah sel yang mati lebih banyak. Pada waktu ini disebut sebagai fase kematian. Penentuan Pola Fermentasi Dari 100 mL larutan sukrosa 10% yang dihidrolisis dengan 5 mL enzim invertase selama 5 jam pada pH 4,5 dan suhu inkubasi 30 oC menghasilkan gula invert dengan konsentrasi 0,2906 M atau sebanyak 10,46 gram. Sebelum dilakukan Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
  9. 9. hidrolisis, sukrosa memiliki absorbansi awal sebesar 0,067, artinya dalam larutan sukrosa tersebut terdapat 0,247 gram gula reduksi (gula invert). Hal ini menandakan bahwa sukrosa yang digunakan tidak murni. Dengan melakukan pengurangan, didapatkan massa gula hasil hidrolisis sebesar 10,22 gram. Apabila hasil tersebut dikonversikan dengan sejumlah sukrosa melalui persamaan stoikiometrinya dapat diketahui banyaknya sukrosa yang terhidrolisis, yaitu sekitar 9,712 gram. Enzim yang digunakan mengandung 11,87 mg protein/mL dan menghasilkan aktivitas sebesar 18,91 unit. Hidrolisat yang didapatkan dari hasil hidrolisis akan digunakan sebagai media fermentasi, dimana gula reduksinya akan diubah menjadi etanol oleh Zymomonas mobilis melalui jalur Entner- Doudoroff. Data dari penelitian sebelumnya, hasil etanol optimum terjadi pada fermentasi dengan pH 5,5 sehingga fermentasi kali ini dilakukan pada pH tersebut dan dalam kondisi anaerob yang diletakkan pada shaker dengan kecepatan 50 rpm. Karena semakin anaerob keadaan fermentasi maka semakin maksimal pula glukosa atau fruktosa yang dapat terfermentasi. Pola produksi etanol serta konsumsi gula selama fermentasi oleh sel bebas Zymomonas mobilis diperoleh dengan melakukan monitoring terhadap kadar etanol dan kadar gula invert sisa terhadap fungsi waktu selama 120 jam setiap 15 jam sekali. Jumlah awal sel Zymomonas mobilis yang digunakan sebesar 2,6 x 10 10 sel/mL. Zymomonas mobilis mempunyai laju pertumbuhan yang tinggi dan tahan terhadap konsentrasi etanol sekitar 10%. Bakteri ini dapat memfermentasikan gula menjadi etanol dan CO2 melalui jalur glikolitik Entner- Doudoroff, dimana oksigen tidak ikut serta dalam proses fermentasi. Oksigen akan menekan fermentasi dan menguntungkan respirasi (Schlegel, 1994). Dibawah ini disajikan grafik pola produksi etanol beserta konsumsi gula selama 120 jam. Gambar 7 Pola Produksi Etanol dan Gula Residu pada pH 5,5 Dari gambar diatas, dapat dilihat bahwa semakin lama jumlah etanol mengalami peningkatan sedangkan jumlah gula residu semakin berkurang dari gula awalnya, ini menandakan adanya konsumsi gula oleh bakteri. Jumlah etanol dan konsumsi gula mengalami perubahan yang signifikan setelah fermentasi selama 75 jam. Hal ini dimungkinkan karena sudah tidak ada pertumbuhan bakteri Zymomonas mobilis sehingga kondisinya dioptimalkan untuk berlangsungnya pembentukan etanol. Menurut Mc Gill (1965) , Zymomonas mobilis lebih menyukai glukosa daripada fruktosa. Sehingga bakteri ini akan memakai glukosa sebagai substrat untuk fermentasi pertama kali. Setelah glukosa habis, maka bakteri ini akan memakai fruktosa. Indikasi terjadinya fermentasi adalah terdapatnya gelembung busa pada permukaan media. Jumlah etanol terbesar dihasilkan pada 120 jam sebesar 6,17 % (v/v) atau 4,87 gram etanol dengan yield etanol 92,89%. Nilai ini lebih besar apabila dibandingkan dengan hasil penelitian yang dilakukan Hani (2009) yaitu mengenai fermentasi menggunakan substrat sukrosa yang hanya menghasilkan etanol sebesar 0,412 gram, yield etanol yang dicapai 61,18%. Nilai yield yang rendah ini, diakibatkan karena dengan menggunakan substrat sukrosa akan terbentuk 2 jenis hasil samping yang utama yaitu levan dan sorbitol. Levan terbentuk akibat adanya enzim levan sukrase yang dihasilkan oleh bakteri Zymomonas mobilis hanya pada substrat sukrosa sedangkan sorbitol terbentuk akibat adanya reduksi oleh enzim glukose- fructose oxidareduktase. Dimana hasil samping keduanya dapat menurunkan jumlah etanol yang terbentuk sampai 80% secara teori (E, favela, 1987). Akan berbeda apabila substrat yang digunakan merupakan hasil hidrolisis sukrosa, kemungkinan produk mayor yang terbentuk hanya sorbitol. Yield etanol yang terukur dihitung berdasarkan akumulasi etanol pada setiap waktu pengukuran. Yield etanol dari hasil fermentasi dapat dilihat pada gambar 8 Prosiding KIMIA FMIPA - ITS
  10. 10. Gambar 8 Yield Etanol Terhadap Waktu Pengukuran Pada fermentasi selama 60 jam terlihat adanya penurunan yield etanol menjadi 79,81%. Hal ini disebabkan karena sejumlah gula dipakai bakteri untuk regenerasi sehingga etanol yang dihasilkan tidak sebanding dengan banyaknya gula yang terkonsumsi. KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh kesimpulan bahwa aktifitas optimum crude invertase dalam mendegradasi sukrosa menjadi gula invert didapatkan pada kondisi pH 4,5 dengan temperatur 30 oC dan waktu inkubasi selama 5 jam. Inkubasi selama 5 jam pada kondisi optimum mampu mnghidrolisis sukrosa sebanyak 9,712 gram dan menghasilkan campuran glukosa serta fruktosa sebanyak 10,22 gram. Aktivitas enzimnya sebesar 18,91 unit. Selain itu, pada fermentasi dengan pH 5,5, Zymomonas mobilis mampu menghasilkan etanol sebesar 4,87 g/100 mL dengan yield etanol mencapai 92,89%. UCAPAN TERIMA KASIH 1. Bapak Surya Rosa Putra, selaku dosen pembimbing atas segala diskusi, bimbingan, arahan dan semua ilmu yang bermanfaat. 2. Bapak dan Ibu selaku orang tua terbaik di dunia atas segala doa, dorongan materiil dan spiritualnya. 3. Rekan- rekan tugas akhir dan thesis S1 dan S2 Kimia ITS serta para analis khususnya di Laboratorium Biokimia 4. Serta pihak- pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu. DAFTAR PUSTAKA Bergamasco, G., Akgol, S., Bulut, A., Denizli, A. And Yakub, A.M. (2003), “Covalent immobilization of inverase onto a reactive film composed of 2- hydroxyethyl methacrylate and glycidyl methacrylate”, Biochemical Engineering Journal , 14:117- 126 Favela, E Torres, (1987), “Continuous Ethanol Production by Zymomonas mobilis from an Equimolar Mixture of Glucose and Fructose”, France Mukhtasor, (2009), “Agenda Energi Terbarukan dalam Konteks Kebijakan Energi Berkelanjutan”, ITS Press, Surabaya Swing, J. Dan De Ley, J.,(1977), “The Biology of Zymomonas”, Laboratory of Microbiology and Microbial Genetic, Faculty of Science, USA Tano, M. S. & Buzato, J. B., (2003), “Effect of The Presence of Initial Ethanol on Ethanol Production in Sugar Cane Juice Fermented by Zymomonas mobilis”. Braz. J. Microbiol. 34: 242- 244 Utami, Sri, (2007), “Pengelolaan Energi Nasional 2005- 2025”, Staf Ahli Menteri Bidang Ekonomi dan Keuangan, Departemen Energi dan Sumberdaya Mineral,Jakarta BIOGRAFI PENULIS Penulis dilahirkan di Surabaya pada tanggal 3 Desember 1987, sebagai anak pertama dari dua bersaudara. Penulis adalah alumnus dari TK Aisyah, SD Muhammadiyah V, SLTP Negeri 1 Porong dan SMA Negeri 3 Sidoarjo. Setelah lulus menempuh Pendidikan Menengah atas, penulis melanjutkan Pendidikan Tinggi di Jurusan Kimia Fakultas MIPA Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Surabaya melalui jalur SPMB (Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru) pada bulan Agustus 2005. Selama menempuh pendidikan tinggi di ITS, penulis pernah aktif dan berpartisipasi dalam organisasi pada HIMKA- ITS. Penulis juga aktif mengikuti beberapa pelatihan, seminar dan Study Lapangan. Penulis sempat menempuh Kerja Praktek di PT. Nestle- Kejayan, Pasuruan. Penulis menamatkan studi S1 di Jurusan Kimia MIPA dengan mengambil Tugas Akhir pada bidang Biokimia dan berhasil lulus dengan predikat yang Memuaskan. Prosiding KIMIA FMIPA - ITS

×