ISOLASI DNA KROMOSOM BAWANG MERAH (Allium Cepa Var. Aggregatum)

1. Laporan Praktikum Hari,Tanggal : Senin, 18 November 2013
Biokimia Waktu : 11.00 – 12.40 WIB
PJP : Inda setyawati, S.Tp M.Si
Asisten : Lusianawati, S.Si
Sari Yunarini, S.Si
ISOLASI DNA KROMOSOM
BAWANG MERAH (Allium Cepa Var. Aggregatum)
Kelompok 10
Raden Dani Najar Saputra J3L112187
Andini Eka Pratiwi J3L112115
Dewi Rosmayanti J3L411211
Wika Herfiza J3L112057
PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA
PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

2. Pendahuluan
Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit
mononukleotida, jika unit-unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat
itu disebut dioksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleot ida
disebut asam ribonukleat (RNA). DNA dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia
dan fisika yang sama sebab antara unit-unit mononukleotida terdapat ikatan yang
sama yaitu melalui jembatan fosfodiester antara posisi 3′ suatu mononukleotida dan
posisi 5′ pada mononukleotida lainnya (Murray et al 2009).
Gambar 1 Jembatan fosfodiester antara posisi 3′ suatu mononukleotida dan
posisi 5′ pada mononukleotida lainnya
Dua tipe utama asam nukleat adalah asam dioksiribonukleat (DNA) dan
asam ribonukleat (RNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini
merupakan pengemban kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikas i
dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk memproduksi organisme itu
dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul
RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA (mRNA), meninggalkan inti sel dan
mengarahkan tiosintesis dari berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai
dengan kode DNA-nya (Fessenden dan Fessenden 1990).
DNA dan RNA banyak memiliki persamaan, tetapi RNA memiliki
perbedaan dengan DNA yaitu, Bagian pentosa RNA adalah ribosa, sedangkan
bagian pentosa DNA adalah dioksiribosa. Bentuk molekul DNA adalah heliks
ganda, bentuk molekul RNA berupa rantai tunggal yang terlipat, sehingga
menyerupai rantai ganda. RNA mengandung basa adenin, guanin dan sitosin seperti
DNA tetapi tidak mengandung timin, sebagai gantinya RNA mengandung urasil.
Jumlah guanin dalam molekul RNA tidak perlu sama dengan sitosin, demikian pula
jumlah adenin, tidak perlu sama dengan urasil (Poedjiadi 1994). Selain itu

3. perbedaan RNA dengan DNA yang lain adalah dalam hal ukuran dan bentuk,
susunan kimia, lokasi, dan fungsinya (Suryo 1992).
Pemisahan sentrifugal menggunakan prinsip dimana objek diputar secara
horizontal pada jarak tertentu. Apabila objek berotasi di dalam tabung atau silinder
yang berisi campuran cairan dan partikel, maka campuran tersebut dapat bergerak
menuju pusat rotasi, namun hal tersebut tidak terjadi karena adanya gaya yang
berlawanan yang menuju kearah dinding luar silinder atau tabung, gaya tersebut
adalah gaya sentrifugasi. Gaya inilah yang menyebabkan partikel-partikel menuju
dinding tanbung dan terakumulasi membentuk endapan (Day dan Underwood
2002). Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan hukum Lambert Beer, bila
cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya
tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It)
(Khopkar 2003).
Tujuan
Menunjukkan sifat dan struktur DNA kromosom melalui proses isolasi
terhadap DNA kromosom
Metode
Alat-alat yang digunakan ialah neraca analitik, gelas beaker, sentrifus, pipet
tetes, tabung reaksi, tabung Eppendorf, dan vortex. Bahan-bahan yang digunakan
ialah umbi bawang merah, larutan lisis yang berisi Tris-HCl 50 mM pH 8.0 yang
mengandung 50 mM EDTA, SDS 10%, buffer elusi/buffer TE yang berisi Tris-HCl
10 mM pH 8.0 yang mengandung 0,1 mM EDTA pH 8,0, EtOH, NaCl, dan dH2O
steril.
Pembuatan larutan. Larutan lisis terdiri dari 50 mM Tris HCl, pH 8,0 yang
mengandung 50 mM EDTA. Sedangkan larutan elusi atau buffer TE dibuat dari 10
mM Tris-HCl pH 8,0 yang mengandung 0.1 mM EDTA pH 8.0. Setelah itu, larutan
disimpan di pendingin.
Isolasi DNA kromosom. Sebanyak 25 gram umbi bawang digerus dengan
menggunakan mortar, ditambahkan 40 mL larutan lisis dan seujung sudip garam
dapur digerus sampai halus. Setelah itu, dituang ke dalam gelas piala 250 mL dan
ditambahkan 5 mL larutan SDS 10%. Larutan dicampur secara homogen dan
diinkubasi pada suhu 60°C dalam water bath selama 20 menit. Hasil inkubasi lalu

4. disaring ke dalam gelas beaker yang ditempatkan diatas es sehingga larutan tersebut
segera menjadi dingin. Setelah larutan menjadi dingin kemudian ditambahkan 1
gram NaCl, aduk secara sempurna dan biarkan selama 15 menit. Kemudian larutan
dibiarkan 5 menit lalu diambil larutan atas dengan menggunakan pipet tetes dan
dipindahkan ke dalam 2 tabung baru. EtOH dingin sebanyak 10 mL ditambahkan
melalui sisi tabung. Kemudian, tabung ditempatkan secara perlahan di atas es dan
dibiarkan selama 2-5 menit. DNA kromosom akan mengendap pada bagian atas
dari EtOH dan tampak sebagai benang-benang putih. DNA kromosom diambil
dengan pipet tetes secara hati-hati dengan sesedikit mungkin larutan EtOH yang
terambil dan ditempatkan pada 2 tabung eppendorf 1.5 mL. Keempat tabung
disentrifugasi selama 1 menit. EtOH dibuang pada lapisan atas secara hati-hati
tanpa merusak pellet dan ditambahkan 1 mL EtOH ke pellet DNA kromosom.
Resuspen pelet DNA kromosom dengan cara vortex dalam 1 mL EtOH dan
disentrifugasi kembali selama 1 menit. EtOH dituang dan DNA kromosom
dikeringkan dalam bech selama 10 menit. Setelah kering, buffer TE atau dH2O steril
1 mL untuk melarutkan DNA kromosom.
Data Hasil Pengamatan
Tabel 1 Hasil pengukuran konsentrasi DNA dari umbi bawang merah
Larutan A 260 A 280
A Terkoreksi [DNA]
(μg/mg)
Rasio
A 260 A 280 A260/A280
Blanko (TE) 0,2730 0,2010
0,6478 0,5678 32, 3900 1,1409
Sampel 0,9208 0,7688
Perhitungan :
Aterkoreksi = Asampel - Ablanko
1. Aterkoreksi 260 = 0,9208 – 0,2730 = 0,6478
2. Aterkoreksi 280 = 0,7688 – 0,2010 = 0,5678
[DNA] = A260 x 50 μg/ml
= 0,6478x 50 μg/ml
= 32, 3900 μg/ml
Rasio A260 : A280 = A260 Terkoreksi : A280 Terkoreksi
= 0,6478 : 0,5678 = 1,1409
Keterangan :
50 : Larutan nilai basorbansi 1.0 sebanding dengan 50 μg/ml untai ganda
DNA per ml

5. Pembahasan
Prinsip isolasi DNA yaitu, sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama
sentrifugasi ialah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan
cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada
di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik
sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin
sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 3000 rpm (rotation per
minute). Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan yaitu, Isolasi sel; Lisis dinding
dan membran sel; Ekstraksi dalam larutan; Purifikasi; dan Presipitasi.
Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan untuk
rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi
total DNA/RNA dari jaringan ialah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan
tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA,
dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi, sehingga dihasilkan pelet sel yang
mengandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama
dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan (Faatih 2009).
Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai
macam sumber DNA yang dapat diperoleh dari hewan maupun tumbuhan.
Praktikum Isolasi DNA kromosom dilakukan pada umbi bawang merah.
Penggunaan umbi bawang merah sebagai sumber pengisolasian DNA kromosom
disebabkan umbi bawang memiliki sedikit pati sehingga DNA akan terlihat akan
lebih jelas dan mudah diisolasi. Proses pekerjaan isolasi DNA harus dilakukan
pada suhu rendah, karena kromosom DNA tidak tahan panas dan dapat mengalami
denaturasi akibat suhu yang terlalu tinggi (Schmid 2003).
Biomolekul seperti DNA bersifat labil dan mudah kehilangan aktifitas
biologisnya, sehingga ekstraksi harus dilakukan dalam kondisi ringan yaitu dengan
menggunakan suatu larutan encer, tekanan osmotik yang ekstrim dan suhu tinggi.
Penambahan garam saat pengerusan bertujuan membantu ujung-ujung fosfat DNA.
Hal ini dapat terjadi karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu membentuk
ikatan dengan kutub negatif pada ikatan fosfat DNA. Saat ion Na+ garam berikatan
dengan fosfat (mendekat), saat itulah DNA akan berkumpul. Sedangkan
penambahan alkohol pada permukaan larutan betujuan untuk melakukan presipitasi

6. sehingga DNA yang telah terkumpul tadi mampu memisah dari larutan dan
terbentuklah lapisan-lapisan yang dapat diidentifikasi unsur penyusunnya.
Detergen seperti sodium dodecyl sulfat (SDS), sarkosil, dan CTAB dapat
digunakan untuk proses lisis (Subandiyah 2006). Buffer lysis dan Proteinase-K
disini dipakai sebagai reagen pelisis supaya komponen DNA dalam sitoplasma sel
bisa keluar dan diisolasi, sedangkan etanol 70% sebagai pencuci hasil isolasi
(Faatih 2009). Kristal protease juga dapat diganti dengan NaCl sebagai langkah
pemurnian DNA dari kontaminan protein dengan cara pengendapan molekul DNA
tersebut sehingga tidak tercampur dengan kontaminan (Ardiana 2009).
Larutan pelisis sel lysing solution yang mengandung EDTA
(ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate)
dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Dinding sel
dapat dipecahkan dengan penggerusan menggunakan bufer ekstraksi diikuti dengan
penghangatan pada suhu 60°C. Proses lisis dinding sel dilakukan dengan
menginkubasi tabung berisi contoh ke dalam waterbath suhu 60°C selama 30-90
menit atau sampai fase padat terpisah dari fase cair. Inkubasi dilakukan untuk
mempercepat proses isolasi DNA kromosom dari campuran. Suhu inkubasi tidak
boleh terlalu tinggi karena DNA kromosom dapat mengalami kerusakan (Poedjiadi
2009). Larutan buffer TE terdiri dari 1M Tris-HCl pH 8,0, 12,11 g Trisma Base,
0,50 M EDTA pH 8,0, 18,61 g disodium etilen diamin tetra asetat 2H2O berfungsi
menjaga struktur DNA. DNA kromosom lalu di sentrifugasi untuk memisahka n
DNA kromosom dari komponen lain seperti protein ataupun RNA. Sehingga DNA
kromosom yang memiliki bobot molekul lebih besar akan berada dibagian dasar
setelah disentrifugasi. (Seidman & Moore 1999 dalam Agustian 2008).
Pengukuran absorbansi DNA digunakan panjang gelombang 260 nm
sedangkan absorbansi RNA digunakan panjang gelombang 280 nm, hal tersebut
dilakukan karena pada panjang gelombang tersebut terjadi serapan yang maksima l
(Day dan Underwood 2002). Berdasarkan perhitungan pada Tabel 1, A260 ialah
absorbansi DNA, sedangkan A280 ialah absorbansi protein. Perhitungan [DNA]
yaitu digunakan A260 terkoreksi, karena perhitungan konsentrasi DNA hanya
memerlukan absorbansi DNA, bukan absorbansi protein/kontaminan lain. Rasio
A260 : A280 merupakan gambaran tingkat kemurnian DNA. DNA memiliki nilai

7. tingkat kemurnian yang tinggi jika nilai absorbannya antara 1.8 sampai 2.0, jika
melebihi nilai 2.0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan dari
protein membran atau senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang didapat
belum murni. Jika kurang dari 1.8 maka dH2O yang diambil terlalu banyak
sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit (Wulandhari 2009). Hasil percobaan
menunjukkan rasio kemurnian DNA sebesar 1,1409 (A260:A280). Ini artinya DNA
yang diperoleh tidak murni. Kemurnian yang rendah ini diduga disebabkan protein
yang tercampur pada DNA yang dihasilkan. Sambrook et al. (1989) menjelaska n
bahwa rasio OD akan lebih besar atau lebih kecil dari nilai 1,8-2,0 jika ditemukan
kontaminasi dari protein atau fenol.
Simpulan
Berdasarkan percobaan, hasil isolasi DNA umbi bawang merah (Allium
Cepa Var. Aggregatum) memiliki rasio A260:A280 sebesar 1,1409 dengan
konsentrasi DNA sebesar 32, 3900 μg/mL dan hasil isolasi tidak murni.
Daftar Pustaka Agustian A. 2008. Karakterisasi Variasi Genetik Jatropha curcas
L. dengan Menggunakan Marka Molekular Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP) [skripsi]. Depok : Universitas Indonesia
Ardiana DW. 2009. Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Pepaya dan Jeruk
dengan Menggunakan Modifikasi Buffer CTAB. Buletin Teknik Pertanian.
14 (1): 12-16
Day JY dan Underwood AL. 2002 Analisis Kimia Kuantitatif. Iis Sopyan,
Penerjemah. Jakarta: Airlangga. Terjemahan dari: Quantitative Chemical
Analysis.
Faatih M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains &
Teknologi. Surakarta: Jurusan Pendidikan Biologi FKIP Universita s
Muhammadiyah Surakarta.
Fessenden RJ. dan Fessenden JS. 1990. Kimia Organik Jilid 2. Aloysius Hadyana
Pudjaatmaka, Penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Organic
Chemistry 2.
Khopkar SM. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. A. Saptorahardjo, Penerjemah.
Jakarta: UI-Press. Terjemahan dari: Basic Concepts of Analytical Chemistry
Murray RK, Granner DK, dan Rodwell VW. 2009. Biokimia Harper Ed. ke-27.
Brahm U. Pendit, Penerjemah. Jakarta: Buku Kedokteran, EGC. Terjemahan
dari : Harper’s Illustrated Biochemistry 27th ed.
Poedjiadi A. 1994. Dasar – Dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press.
_________ . 2009. Dasar-Dasar Biokomia. Jakarta: Universitas Indonesia Press.

8. Sambrook J, Fritsch EF, And Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Vol. 3.Spring Harbor : Cold Spring Harbor Laboratory Press
Schmid R. 2003. Pocket Guide to Biotechnology and Genetic Engineering.
German: Wiley-VCH.
Subandiyah S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi
Patogen Tumbuhan Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Malang: Pelatihan
dan Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR.
Suryo W. 1992. Genetika. Yogyakarta: UGM-Press.
Wulandhari A. 2009. Optimalisasi Hasil Ekstraksi DNA dari Darah Segar Sapi
Menggunakan High Salt Method dengan Perbandingan Darah dan Lisis
Buffer pada Kecepatan Sentrifugasi Berbeda [skripsi]. Bogor: Institut
Pertanian Bogor