1. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Использование мультиплексного
анализа для исследования
цитокинов
Лаборатория экспериментальной иммунологии и
вирусологии ФБГУ «НЦЗД» РАМН
Филянская Е.Г.

2. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Лихорадка –
повышение температуры тела, сопровождающее
большинство инфекционных заболеваний,
самый частый симптом болезни у детей.
Ключевой вопрос диагностики
дифференцирование бактериальной и вирусной
этиологии инфекции, поскольку именно
cвоевременность и адекватность ответа на этот
вопрос определяют эффективность лечения.
У ребенка с фебрильной лихорадкой требуется
четко оценить риск развития бактериальной
инфекции.

3. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Дифференциальная диагностика бактериальной и
вирусной инфекций
Уровень лейкоцитов( >10-15 тыс./мкл )
Нейтрофилез (>10тыс./мкл)
СОЭ
С-реактивый белок (>15мг/л),
Прокальцитониновый тест (>0,5нг/мл)
Маркеры бактериального воспаления важный, но лишь
дополнительный критерий помогающий в диагностике
вирусной или бактериальной инфекции у лихорадящего
больного.

4. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Поиск новых
эффективных маркеров
для дифференцирования
вирусной и
бактериальной инфекции
остается актуальной
задачей медицины.
Современная диагностика
маркеров воспаления
использует изучение
уровней цитокинов.

5. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Цитокины
Играют важную роль в
регуляции иммунного
ответа, образуя целые
функциональные сети,
управляющие различными
звеньями иммунитета.
Определение уровня отдельных цитокинов не всегда
адекватно отражает всю картину сложных
взаимодействий внутри цитокиновых сетей.

6. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.

7. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Оценка цитокинового статуса
Объективную оценку цитокинового статуса можно
получить с помощью одновременного
(мультиплексного) определения множества
цитокинов в одном образце биоматериала.
Эту проблему позволяет решить
мультиплексный метод определения цитокинов.

8. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Технология Bio-Plex 200
Позволяет с меньшими затратами произвести
количественную оценку в малом объеме образца до 100
цитокинов
Преимущества технологии:
Достоверная оценка уровня большого числа
цитокинов в одном образце одновременно
Унифицированные калибровочные стандарты
для каждого цитокина в отдельности

9. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Дизайн исследования
В исследование вошла группа здоровых детей (n=6),
проходивших профилактическое обследование, и
пациенты с острыми верифицированными
бактериальными (n=16) и вирусными (n=14)
инфекциями, которые сопровождались лихорадкой
>38°C.
Возраст детей варьировал от 1 до 14 лет и
статистически значимо не отличался между
группами.
Статистическую обработку полученных данных
проводили с помощью пакета программ SPSS 16.0

10. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Выявление изменений секреции цитокинов и
особенностей цитокинового профиля
Было исследовано 37 цитокинов в сыворотке
крови на двулучевом лазерном анализаторе
Bio-Plex 200 (Bio-Rad) с использованием
мультиплексных тест-систем.
Концентрацию исследуемых цитокинов
рассчитывали по стандартным калибровочным
разведениям с помощи программного
обеспечения, поставляемого фирмой Bio-Rad
(Bio-Plex Manager 5.0)

11. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Результаты продукции цитокинов
Мы провели парные сравнения между группами
по 21 показателю, различия по которым
достигли статистической значимости.
Cтатистически значимых различий (р=0,05)
между обследованными группами не было
обнаружено для 16 цитокинов.
IL-5, IL-7, IL-10, IL-13, IL-18, LIF,
MCP-1, MIP-1β, SCGF-β, ТNF-α и ТNF-β
Кроме того, медиана уровней IL-2, IL-4, IL-17,
INF-γ, GM-CSF во всех группах была меньше
нижнего предела чувствительности.

12. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Продукция цитокинов в сыворотке крови
IL- 16
INF-α
α
IL- 12
IL- 6

13. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Выводы
При фебрильных инфекциях в крови возрастает
содержание ряда цитокинов,
цитокиновые профили при бактериальных и
вирусных инфекциях отличаются друг от друга.
Выбор комбинации цитокинов должен быть
обусловлен задачами исследования. Решению этих
задач будет способствовать разработка на основе х-
МАР наборов, которые включают комбинацию
определенных цитокинов.

14. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Заключение
Информацию о профилях сывороточных
цитокинов у детей с фебрильными
инфекциями можно использовать:
1. для совершенствования
дифференциальной диагностики
заболеваний бактериальной и
вирусной этиологии
2. и выявления больных с риском
развития бактериальных
осложнений.

15. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Сложность определение цитокинов:
короткий период их жизни
способность быстро связываться с различными
сывороточными белками.
Учитывая это, в дальнейших исследованиях мы
определяли концентрацию цитокинов в культуре
мононуклеарных клеток периферической крови.

16. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Кашель у детей часто возникает при ОРИ.
Затяжное течение кашля является одной из
причин обращения к педиатру.
По данным различных исследований от 13
до 20% случаев затянувшегося кашля
связаны с коклюшем.
Коклюш является одной из причин
заболеваемости и смертности детей грудного
возраста во всем мире.

17. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
По рекомендациям ВОЗ
«О клинике коклюша говорит наличии кашля в
течение не менее 2 недель в сочетании с одним из
следующих симптомов: пароксизмы кашля,
коклюшные репризы, послекашлевая рвота без
другой явной причины, плюс лабораторное
подтверждение или установленный бытовой
контакт».

18. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.

19. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.

20. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Причины заболеваемости коклюшем:
отказ от вакцинации, частичная вакцинация
или вакцинация с нарушением календаря
прививок, необоснованные медицинские
отводы от АКДС-вакцинации.
адаптация циркулирующих штаммов бактерий
к применяемым вакцинам.
изменчивость циркулирующих штаммов В.
pertussis и их несоответствие вакцинным
снижает эффективность вакцинопрофилактики.

21. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Поздняя диагностика коклюша связана c
особенностями клиники у привитых и
недостаточной настороженностью врачей.
В последние годы коклюш в основном
протекает атипично и в сочетании с ОРВИ
(24,5%-60% случаев).
В 2009 г. в Москве 45% случаев коклюша
приходилось на школьников.

22. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.

23. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
По данным Департамента здравоохранения
г.Москвы, общий показатель выявляемости
b.pertussis в 2009г. составил всего 2%.
Истинная заболеваемость коклюшем значительно
выше за счет недиагностированной коклюшной
инфекции.

24. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
В НЦЗД РАМН в 2011г. при обследовании
длительно (>2недель) кашляющих детей (n=339;
188-мальчиков и 151 девочек) было показано, что
коклюш у многих не диагностирован. Так
положительные IgM антитела к b.pertussis
свидетельствующие об инфекции были выявлены
у 37% детей (114).
Более 80% детей были старше 4 лет.

25. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Диагностика коклюша
Остается недостаточно
эффективной, что требует
совершенствования и
стандартизации лабораторных
методов исследования.

26. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Сравнение методов диагностики
Сравнивая диагностическую эффективность
ИФА, бактериологического метода и ПЦР
необходимо отметить, что ИФА становится
результативным только после 3 недели
заболевания. В связи с этим при наличии
типичных клинических проявлений ИФА
позволяет только подтвердить диагноз, в то
время при стертых и атипичных формах
инфекции этот метод может оказаться
решающим в выявлении заболевания.

27. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Прививки против коклюша заканчиваются в 1,5 года, а
защиты хватает максимально только до школы.
Риск заболевания у привитых детей значительно
возрастает спустя 3 года после вакцинации.
При снижении иммунитета к коклюшу могут
заболеть как привитые дети школьного возраста,
так и взрослые.
Во многих странах эти группы являются
основным источником инфекции для не
привитых детей.

28. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Отсутствие защитных антител
1. Может быть обусловлено постепенное снижением
иммунитета с течением времени,
2. Отсутствие формирования иммунного ответа после
вакцинации.
Средний возраст детей с отсутствием защитных
антител составил 5,5 – 6 лет.
Отсутствие иммунитета к коклюшу - высокий риск
инфицирования, что может служить показанием для
проведения ревакцинации детей в дошкольном возрасте.
Существующая в настоящее время система
вакцинопрофилактики коклюша в рамках Национального
календаря даже при высоком охвате обеспечивает
недостаточный по длительности иммунитет, который
снижается уже к школьному возрасту.

29. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Специфические антитела к коклюшу
появляются после вакцинации, однако их
уровень быстро снижается.
Ряд исследований показывает, что защита
против коклюша связана как c уровнем
антител, так и с Т-клеточным ответом.
Т-клетки памяти сохраняются годами и
могут играть важную роль в долгосрочном
иммунитете против коклюша.

30. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Индуцированный длительный ответ Т-клеток
памяти и относительный вклад каждой Т-
клеточной линии при вакцинации в
значительной степени неизвестен.
В связи с этим для лучшего выяснения
эффективности защиты от коклюша мы
оценивали не только уровень специфических
антител к коклюшу, но и клеточный ответ на
антигены B. Pertussis (PT и FHA).

31. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Оценка клеточного иммунного ответа на
вакцинальные антигены in vitro может служить
вспомогательным инструментом для
характеристики эффективности вакцинации.
Одним из методов такой
оценки является
исследование
продукции цитокинов.

32. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Цель исследования
Оценить цитокиновый ответ МНПК на коклюшные
вакцинальные антигены.
Мы определяли продукцию цитокинов в культуре
МНПК при их инкубации с антигенами B. Pertussis
(PT и FHA) in vitro.

33. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Дизайн исследования
В исследование вошла группа детей (n=19),
поступивших в отделение неотложной педиатрии
осенью 2012г. с жалобами на приступообразный
кашель.
Возраст детей варьировал от 2 до 14 лет (11 мальчиков
и 8 девочек).

34. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Материалы и методы
Для исследования использовали цельную кровь
детей поступивших в отделение неотложной
педиатрии осенью 2012г. с жалобами на
приступообразный кашель.
Выделенные и отмытые клетки культивировали в
96-луночном плоскодонном планшете по 200мкл в
лунку в полной культуральной среде RPMI-1640
при 37°С в атмосфере 5%СО2.

35. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Для стимуляции параллельно с контролем в лунки
добавляли инактивированный коклюшный токсин
(PT)1 мкг/мл и филаментозный гемагглютинин
2мкг/мл (FHA).
На 3 сутки инкубации из лунок планшетов
забирали супернатанты (надосадочную жидкость
150 мкл) и хранили при -70 °С до определения
цитокинов.

36. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Продукция цитокинов в супернатантах
клеточных культур
На анализаторе Bio-Plex 200 (Bio-Rad) с
использованием мультиплексных тест-
систем определи уровень восьми цитокинов
IL-2, IL 4, IL-6, IL-8, IL -10, GM-KCF, INF-γ, TNF-α
Концентрацию исследуемых цитокинов
рассчитывали по стандартным калибровочным
разведениям с помощи программного
обеспечения, поставляемого фирмой Bio-Rad
(Bio-Plex Manager 5.0)

37. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Влияние антигенов B.Pertussis на продукцию
цитокинов МНПК in vitro
450
400
350
300
250 FHA
PT
200 N
150
100
50
0
IL2 IL4 IL10 GM-CSF TNF-a

38. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Цитокиновый ответ МНПК на антиген B. pertussis в
зависимости от уровня специфических антител
TNF-α
α
IL-6
IL-2
IL-4
INF-γ
γ
IL-10
Отр. Вакц. Пол. Отр. Вакц. Пол. Отр. Вакц. Пол.

39. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Выводы:
Применение современных исследовательских
технологий позволяет получить
информативные данные из минимального
объема крови, что повышает ценность
исследований системы клеточного
иммунитета.
Эта модель определения клеточного ответа на
вакцинальные антигены может быть
использована для дальнейшего изучения
эффективности различных вакцин.

40. Филянская Е.Г.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Спасибо за внимание!