ломоносов

Ломоносов А., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.

Поиск генетических факторов
аутоиммунных заболеваний:
применение технологии
полногеномного секвенирования

52.3 cm Ломоносов Андрей
12 cm
ООО «ИнтерЛабСервис»


Содержание презентации

•Краткий Словарь и отношения геномных
исследований и Иммунологии
•Короткая, но бурная история
•Технология и ее особенности
•Ряд примеров


О генетической информации
Жизнь клетки и организма в целом – это
множество событий передачи и обработки
информации, в особенности генетической
Генетическая информация – это информация о
строении и регуляции функций белков и НК,
сохраненная в виде генетического кода
Аналог с ПК: Жесткий диск – ДНК, оперативная
память – РНК, процессор – белки
Полногеномный секвенатор – устройство
чтения генетической информации в объеме
всего генома (не предусмотренное природой)


Словарик
•Геном – вся информация о последовательности ДНК
отдельного организма/клетки
•Эпигеном – вся информация об устойчивых модификациях
ДНК, влияющих на функцию ДНК
•Транскриптом – вся информация в РНК в данной
клетке/ткани (динамическая информация об экспрессии
генов)
•Метагеном – вся информация в ДНК сообщества
организмов
•SNP – однонуклеотидный полиморфизм – мутация в виде
замены 1 буквы в генетическом коде
•Indel – мутация в виде вставки (insertion) или потери
(deletion) участка ДНК
•Экзон – участок ДНК (гена), кодирующий определенный
белок или его часть
•Интрон – участок ДНК, не кодирующий определенный


Зачем генетика в иммунологии?
В иммунологии подробно анализируются (диагностика)
и активно используются (терапия) пути передачи
информации внутри и между клетками, но главным
образом через белки
Однако все белки имеют начало в РНК, которая имеет
начало в ДНК
Знание генетических особенностей организма может
являться дополнительным подспорьем в:
- диагностике (Риски, Персонализация)
- терапии, включая грядущую генотерапию


Технологии полногеномного анализа
Анализ с применением биочипов высокой
плотности
Геном – известен
Количество маркеров – от 10-в тыс до млн
Задачи – генетические варианты (SNP), indel
мутации, экспрессия генов, эпигенетика
Производительность – до 1500 образцов в неделю
Полногеномное секвенирование
Любые виды задач анализа ДНК и РНК
Не требуется априорного знания генома
Средняя производительность – от 1 до сотен
образцов в неделю


История развития геномных исследований
The genomics of autoimmune disease in the era of genome-wide association
studies and beyond / Autoimmunity Reviews 11 (2012) 267–275 C. Lessard et
all
Эра до GWA-исследований – с 1970-х до 2006 г. Фокусные исследования
генов – HLA 1 и 2 типов (HLA-B27 и риск возникновения артрита и
спондилита), и вне HLA (Interferon regulatory factor 5 (IRF5) и СКВ)
Эра GWA- исследований с 2006 г (начало проекта HapMap) и доступность
технологии полногеномного анализа с использованием биочипов высокой
плотности – позволила обнаружить значительное количество генов,
ассоциированных с аутоимунными заболеваниями, однако ограничение в
виде фиксированного набора полиморфизмов в технологии биочипов
оставили пробелы
Следующий этап развития (сейчас – использование полногеномного
секвенирования для получения более полной информации о генетических
вариантах (включая редкие), а также механизмов регуляции генов


Особенность полногеномных исследований –
Высокий рост числа публикаций
Более 3000 публикаций по секвенированию Illumina

Этапы передачи генетической информации,
которые доступны для технологии
полногеномного секвенирования
Экспрессия генов
Редактирование
мРНК

Регуляция экспрессии
генов

Регуляция
Факторы
генов модификацией
транскрипции
ДНК и ДНК-белковыми
комплексами


Принцип работы NGS на примере
технологии Illumina
Образец ДНК 3’ 5’
или РНК

A G
T
C G
A
C
T T
A
Рубим на C C
G

миллионы G A
T
A
A
фрагментов T
C
C
C
C G G
A
T
T C
G
A
T
Формирование 5’
Одновременное
молекулярных
секвенирование
кластеров – из каждого
Миллионов разных
фрагмента ДНК –
молекул ДНК
Библиотека множество его клонов
фрагментов ДНК для детекции сигнала


Технологии полногеномного анализа в
иммунологии
Используются как инструмент для понимания генетических и
регуляторных механизмов в т.ч. аутоимунных заболеваний, а также
как инструмент поиска новых маркеров для диффиренциальной
диагностики
Общая схема использования:
Определяют участок передачи генетической информации – ДНК на
наличие мутаций, регуляция ДНК (метилирование или белок-ДНК
комплексы), РНК (поиск генов с увеличенной или пониженной
экспрессией, поиск сплайс-вариантов),
Определяют когорту пациентов с заболеванием и контрольную
группу
Выделяют клетки, вовлеченные в иммунный ответ и специфические
для данного заболевания (Т-лимфоциты CD4+)
Выделяют из них НК, проводят полногеномное секвенирование
и/или анализ на биочипах высокой плотности
Анализируют данные с использованием баз данных и
статистического анализа


Поиск локусов, ассоциированных с СКВ, у
представителей разных национальностей

Задача – найти причинные гены, связанные с СКВ.
Известно, что ряд регионов MHC сильно ассоциирован с СКВ,
однако в силу значительной неравновесности связей ( LD) одних
регионов с другими и гетерогенности фенотипического проявления
СКВ причинные гены установить сложно.

В работе исследовали ДНК генотип 1433 больных и 1458 здоровых
людей (филлипинцев и испанцев), проводилось сравнение с
данными по европейцам
Использовался custom-чип Иллюмина iSelect


Transancestral mapping of the MHC region in systemic lupus erythematosus identifies new independent and
interacting loci at MSH5, HLA-DPB1 and HLA-G Fernando et all, Ann Rheum Dis 2012;71:777–784.



Уточнение локализации варианта генотипа HLA-
DRB1*15 , ассоциированного с СКВ


Исследование профилей метилирования
ДНК клеток при ювинильном идиопатическом
артрите

Метилирование промотерной области гена (ДНК)– снижает уровень
экспрессии гена. Степень метилирования связана с метаболизмом
фолатов (влияние питания на «эффективный» генотип).
Что контролируется эпигенетически – процесс перехода наивных Т-
клеток в Th1 (IL4) или в Th2(IFNγ)

В работе исследовали ДНК CD4+ Т-клеток крови (отделяли на
сортере) выделяли ДНК, проводили бисульфидную обработку,
анализ на чипах illumina Infinium HumanMethylation27, сравнивали с
контрольной группой


Исследование профилей метилирования
ДНК клеток при ювинильном идиопатическом
артрите

Обнаружили изменения в степени метилирования 145 локусов, из
анализа которых с достоверностью связали с заболеванием
уменьшение степени метилирования генов отвечающих за
экспрессию MRPL28 (митохондриальный рибосомальный белок L28)
и IL32
Что предположительно приводит к увеличенной экспрессии как генов,
кодирующих эти белки, так и самих этих белков

Что, однако, не было подтверждено исследованием профилей
экспрессии генов.


Применение секвенирования экзома для поиска
новых генов-кандидатов, ассоциированных с
алопецией

Задача – найти причинные гены, связанные с аллопецией
Метод – полное секвенирование экзома больных и здоровых
пациентов

В работе исследовали экзомы 6 больных человек
Исследовали только гены, связанные с иммунным ответом
После анализа вариантов, полученных при исследовании экзома,
проводили валидацию генов-кандидатов методом ПЦР и
классического секвенирования по Сэнгеру на другой выборке
пациентов
Обнаружили несколько новых генов-кандидатов (BTNL2 HLA-
DRB5HLA-DMB, TLR1, PMS2, HLA-A)


Исследование профилей экспрессии генов
при ревматоидном артрите

В работе исследовали синовиальные фибробласты, выделенные из
пораженных суставов, и сравнивали с контрольной группой

Задача, которую решали – определить роль синовиальных
фибробластов в развитии ревматоидного артрита, исследовать
различия в профилях экспрессии генов, и обнаружить гены,
экспрессия которых повышена/ понижена. А также найти сплайс-
варианты генов, характерных для ревматоидного артрита.

Транскриптом исследовали на приборе HiSeq2000, на каждый
образец приходилось по 80 млн прочтений молекул РНК
Уровни экспрессии нормировали по генам домашнего хозяйства



Идентифицированы регуляторные пути,
задействованные в синовиальных
фибробластах, связанных с ревматоидным
артритом

Был обнаружен ряд новых генов и их
изоформ, не ассоциированых ранее с этим
заболеванием


Какая нужна глубина покрытия для проведения
Количество детектируемых генов эксперимента по экспрессии генов?

Количество полезных чтений


Исследование репертуара TCR (т-клеточных
рецепторов) методом глубокого
секвенирования
Next generation sequencing for TCR repertoire profiling: platform-
specific features and correction algorithms
Bolotin et all European J Immunology DOI: 10.1002/eji.201242517

Т-клеточные рецепторы и их антиген специфичность определяется
гипервариабельным регионом (CDR3), который формируется
рекомбинацией сегментов генов V, D, J с независимой вставкой
нулеотидов в месте объединения сегментов. У зрелых т-клеток
можно определить репертуар рецепторов через исследование
экспрессируемых генов рецептора.
Знание отличий в репертуаре – метод исследования адаптивного
иммунного ответа

Однако для этого требуется глубокое секвенирование, или прочтение
одинаковых по локализации, но разных фрагментов ДНК, в
количестве тысяч копий
Эта задача может быть решена только полногеномным
секвенированием


Исследование репертуара TCR (т-клеточных
рецепторов) методом глубокого
секвенирования
Next generation sequencing for TCR repertoire profiling: platform-
specific features and correction algorithms
Bolotin et all European J Immunology DOI: 10.1002/eji.201242517

Технология:

Выделение интересующих т-клеток
Выделение РНК из отобранных
клеток, обратная транскрпция, ПЦР
и секвенирование
Анализ данных –
Экстракция данных, связанных с
CDR3 (complementarity-determining
region 3)
Формирование «ядерных» генотипов
Маппирование чтений низкого
качества
Коррекция ошибок ПЦР

Возможности HLA-типирования с использованием
глубокого секвенирования
Были
идентифицированы
ранее не описанные
аллельные варианты с
заменами, инсерциями и
делециями.

Возможен
мультиплексный анализ
специфических участков,
ассоциированных с
некоторыми
аутоиммунными
заболеваниями, такими
как рассеянный склероз,
нарколепсия, глютеновая
болезнь, ревматоидный
артрит

Использована
платформа MiSeq
Chunlin Wang et al. High-throughput, high-fidelity HLA genotyping with deep sequencing //
Proceedings of the National Academy of Sciences. 05/2012

7 Gb
Пример возможностей
~30 M чтений
настольных NGS секвенаторов: 2 x 250 bp длина
4 Gb при 2 x 150
Illumina MiSeq 6 - 7 Gb при 2 x 250

Глубокий сиквенс ампликонов – глубина 1000х, 150 ампликонов в
образце, 100 образцов в запуск
Секвенирование 1-2 экзомов человека в запуск

ломоносов

Recommended

Recommended

More Related Content

Viewers also liked

Viewers also liked (20)

More from pasteurorg

More from pasteurorg (16)

ломоносов