1. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Технология мониторинга экспрессии
клеточных геномов
GE Healthcare Life Sciences
“Together, we make the world healthier
through imaginative science"
Евгения Чакина
ООО «Аламед»
Официальный дистрибьютор
GE Healthcare Life Sciences

2. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Развитие исследований: от гена до функции
Genomics Proteomics Cellomics
Ettan DIGE
YFP-H2B in
Arabidopsis thaliana
protoplasts
1 2 3 3 35
8.48E10 0
D -4
D -5
D - 12
D -8
B - 10
D - 10
C - 11
C - 10
D - 11
D -6
DNA Microarray B - 11
B - 12
B-9
D -9
B-8
B-1
B-7
D -7
B-5
B-6
B-4
D -1
C- 9
D -2
B-3
B-2
D -3
C- 8
C- 3
C- 7
C- 6
C- 5
C- 4
C- 2
C - 12
Секвенирование генов, Идентификация и Исследование клеточных
экспрессионный анализ, характеризация белков, функций, локализации молекул
сайт‐специфический анализ их модификаций и и органелл, клеточного
мутагенез и др. взаимодействий и др. фенотипа и др.

3. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Структурная и функциональная
протеомика
Задачи исследователя:
• Определение структуры белка
• Определение функций белка / антитела
• Регуляция
• Межмолекулярные взаимодействия/активность
• Биофармакология
Этапы:
• Пробоподготовка ‐ Очистка белка
• Разделение с высоким разрешением / Анализ cтруктуры
• Анализ функции

4. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Структурная протеомика
2 разных подхода
LC‐MS: смесь белков → определение пептидов в смеси
• Разделение предварительно очищенного образца
методом ВЭЖХ или УльтраВЭЖХ
• Определение структуры методом MS
2D‐MS: один белок → определение структуры белка
• Фракционирование образца методом 2D‐фореза,
поиск интересующих белков (DIGE), извлечение
единичных пятен – молекул белков
• Определение структуры методом MS

5. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Функциональная протеомика
Фундаментальные исследования взаимодействий:
• Изучение кинетики и аффинности взаимодействий молекул
• Задачи: изучение каскадов реакций, функций белков,
формирования белковых комплексов
Фишинг: смесь белков → «вылавливание единичной молекулы» →
определение структуры
• Получение фракций на FPLC
• Скрининг фракций на чипе – определение взаимодействующей
молекулы
• Определение структуры методом MS
Фармацевтические исследования и биотехнология:
• Скрининг кандидатов в фармпрепараты и антител для
диагностикумов
• Персонализированная медицина – определение эффективности и
метаболизма лекарственных средств

6. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Двумерный электрофорез
2D электрофорез – незаменимый классический метод в
протеомных исследованиях, «входной билет в протеомику»
Технология метода основана на последовательном
разделении белковых образцов в двух направлениях: по
изоэлектрической точке и массам молекул.
Модификация метода 2D‐электрофореза – технология
2D‐DIGE (анализ дифференциально окрашенных гелей)
‐ существенно сокращает временные и финансовые затраты за счет
мультиплексирования
‐ повышает точность, достоверность и воспроизводимость результатов за
счет унифицированных условий эксперимента и использования
внутреннего стандарта.

7. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
2D‐электрофорез: этапы.
MS

8. Двумерный электрофорез – результат?
Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.

9. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
2‐D DIGE для экспрессионной
протеомики
Традиционный 2D электрофорез
Трудозатратный, большие вариации внутри эксперимента (одна краска для
пост‐окрашивания, требуются повторные эксперименты для разделения
биологических и технических вариаций)
Технология DIGE
Обеспечивает большую точность, воспроизводимость и существенно
сокращает трудозатраты и время эксперимента:
• Мультиплексирование – несколько образцов анализируются в одном
геле
• «Безобразно но однообразно» – ошибка оператора будет одинакова
для всех образцов в геле
• Внутренний стандарт – присутствует во всех гелях в одном эксперименте

10. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Difference gel electrophoresis (DIGE)

11. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Cy2
Mouse liver proteins
Internal standard
Cy3
Mouse proteins
control
Cy5
Mouse liver proteins
treated
Overlay
Mouse liver proteins

12. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Традиционный 2‐D и 2‐D DIGE
Традиционный 2D электрофорез (1‐цветный)
8 образцов: 8 гелей x 3 повтора = 24 геля
2D‐DIGE (3‐цветный)
8 образцов:
4 геля (без повторностей) = 4 геля

13. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Функциональная
протеомика

14. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Анализ взаимодействия молекул:
‐ Без метки
‐ В режиме реального времени
‐ Кинетика взаимодействий
Biacore™ ‐ биосенсоры SPR
MicroCal™ ‐ калориметр

15. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Анализ взаимодействия различных
молекул:
• Белки
• Нуклеиновые кислоты
• Липиды и мембран‐ассоциированные молекулы
• Углеводы
• Низкомолекулярные соединения
• Целые клетки
• Вирусы/бактерии

16. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Biacore. SPR.
Используются в ведущих академических и биотехнологических
лабораториях с 1990 г.
Система
Программное
детекции SPR
обеспечение
‐ BiacoreTM
Сенсорный Микрофлюид/
чип проточные
ячейки

17. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Сенсограмма SPR
Точка отсчета
Форма кривой показывает
кинетику взаимодействий
• Специфичность
• Аффинность
Ответ
связывания
• Кинетика
Базовая линия
• Концентрация
• Термодинамика
ассоциация диссоциация
буфер образец буфер

18. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
MicroCal™ ‐ принцип
В шприце ‐ лиганд (связываемое соединение)
В экспериментальной ячейке ‐ целевой белок
В ячейке сравнения ‐ буфер
Шприц
Измеряется теплота взаимодействия
Обработанные Данные
данные эксперимента
0
Механизм
kcal/mole of injectant
-2
-4
-6
-8 Аффинность
-10 Стехиометрия
-12
-14
0 1 2
Molar Ratio
Ячейка
Экспериментальная
сравнения
ячейка

19. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Около 20 лет на рынке – более 10 000
научных публикаций
• Онкология
• Нейробиология
• Иммунология
• Инфекционные заболевания
• Протеомика
• Трансдукция сигнала
• Разработка вакцин, фармпрепаратов и диагностикумов
• Выбор и характеристика связывающих реагентов
• Исследования лекарств и многое другое….

20. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
High Content Analysis (HCA) это…
‐ Анализ «высокого содержания»
‐ Получение большого количества
разноплановых данных по одному образцу
‐ Многопараметрический анализ данных

21. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Эволюция клеточного анализа
Деструктивный Фиксированный Динамический Интегрированный
Информа‐
Тивноcть
Электрофорез Трансдукция Процессы в клетке Взаимодействия
сигнала

22. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Зачем нужен HCA?
• Сложные многопараметрические эксперименты
• Мультиплексность
• Широкомасштабные скрининговые исследования
• Быстрота получения данных
• Огромное количество данных по одному образцу
• Сохранение изображений и повторные анализы
Исследования:
• Изучение функции, локализации и кинетики в живой
клетке: транслокации, активация рецепторов, фазы
клеточного цикла
• Тестирование воздействия внешних условий
(токсинов, лекарственных средств, ингибиторов,
активаторов и пр.) на живую клетку
• Слежение за несколькими морфологическими
параметрами
• Возможность мечения нескольких мишеней

23. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Универсальность и возможности
Ми
кро
ско
пия
Cytometry
Цитофлуориметр
g
t in
oеtз
blр
о
tern
sтро
к
ф
We
Эле

24. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Основные компоненты HCA
Биологический Реактивы
объект Флуоресцентные метки
Культуры клеток
Ткани
Организмы
Оборудование
Инструмент для визуализации
фиксированных и живых клеток
Программное Дополнительные модули
обеспечение (инкубатор, система
Для получения, дозирования) для
обработки и хранения прижизненного наблюдения
HCA данных

25. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
IN Cell Analyzer 2200, 6000

26. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Высоко‐производительная камера
Стандартная CCD-камера
1.4 Mp CoolSNAP ES2
1392 x 1040 пикс.
6.45мкм кв. пикс.
137 клеток при 10X
увеличении
Широкоформатная камера
4.2 Mp CoolSNAP K4;
2048 x2048 пикс.
7.40мкм кв. пикс.
635 клеток при 10X увеличении
Больше клеток, больше данных, быстрее!!!

27. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Новейшая технология восстановления
изображения (Деконволюция)

28. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
3 режима проходящего света
-микроскопия светлого поля
-фазово-контрастная микроскопия
-ДИК (дифференциально-
интерференционный
контраст) для анализа живых клеток
Использование опции 3D/деконволюции
для улучшения качества изображения
2D 2D Deconvolved 2.5D Deconvolved

29. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Данные от одной клетки до популяции

30. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Spotfire – интерактивное получение изображений
Рост клеток
Клеточная
токсичность
Движение клеток Рост клеток

31. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Области применения
• Активация рецептора
• Токсикологический ответ клетки и апоптоз
• Трансдукция внутриклеточного сигнала
• Анализ дифференцировки стволовых клеток
• Клеточный цикл
• Органеллы и внутриклеточный транспорт
• Функционирование нейронов
• Морфологическое и физиологическое состояние клетки

32. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Данные пользователей на
IN Cell Analyzer
NIH-3T3 fibroblasts overexpressing src causing localization
of actin toward podosomes.
Cells stained for DNA (blue), actin (green) and phospho-src
(red).
Courtesy of Evelyn Griffin, Scripps Florida
Human Neuronal Stem Cells from fetal cortex. Cell stained
for DNA (blue), TUJ-1 (neuronal differentiation marker, green) and GFAP
(astrocyte differentiation marker, red).
Courtesy of Kymmy Lorrain, Brain Cells Inc
Primary Porcine Trabecular Meshwork cells stained for DNA
(blue), actin (rhodamine phalloidin, red) and Paxillin in focal
adhesions (green).
Courtesy of Carmen Laethem, Aerie Pharma

33. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Данные пользователей на
IN Cell Analyzer
Primary pig trabecular meshwork cells stained for actin
(green), DNA (blue) and paxillin focal adhesion points (red).
IN Cell 1000 Courtesy of Carmen Laethem, Aerie
Pharma
Rat cardiac H9C2 cells stained for DNA (blue), actin (red)
and tubulin (green). IN Cell 1000.
Courtesy of Connla Edwards, Trinity College Dublin
Human neural stem cells stained for neuronal TUJ-1 (green),
astrocyte GFAP (red) and DNA (blue). IN Cell 1000.
Courtesy of Kymmy Lorrain, BrainCells Inc.,
USA

34. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Качество изображений – это основа
Формирование ядрышка Срезы тканей Структура цитоскелета
(семенники мыши) (Актин, тубулин)
До воздействия
+ Этопозид
GFP репортеры
(AKT в PM ruffles)
Активация
рецептора Рост нейритов
(CypHer 5E)

35. Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Спасибо за внимание!