Получение радионуклидов и РФП для ПЭТ. РФП на основе F–18. Лекция 3, Красикова Р.Н.
1. Получение радионуклидов и
радиофармпрепаратов для позитронной
эмиссионной томографии (ПЭТ)
Р.Н. Красикова
Зав. лаб. радиохимии ФГБУН Институт мозга
человека им. Н.П. Бехтеревой РАН
Доцент каф. радиохимии химического
факультета СПбГУ
Курс лекций в рамках подготовки ПЭТ радиохимиков
МГУ май 2013 г.
1
2. Лекция
РФП для позитронной эмиссионной томографии. Особенности синтеза
РФП для ПЭТ. РФП на основе фтора-18; влияние введения фтора-18 в
структуру молекул на биохимическое поведение (концепция
блокированного метаболизма). Нуклеофильные и электрофильные
методы введения фтора-18 в структуры молекул. Удельная мольная
активность РФП в зависимости от метода синтеза. Хроматографические
экспресс методы очистки РФП для ПЭТ.
2
3. Ядерно-физические характеристики основных
ПЭТ радионуклидов
(более 90% всех ПЭТ исследований)
Изотоп
T1/2,
мин
Т
р
а
с
и
п
+, Макс.
п
а
д
а
%
,
э
н
е
М
р
г
э
и
В
я
,
М
п
м
а
р
о
ы
С
13
N
15
О
18
F
20,4
9,96
2,04
109,7
+
+
+
+(97),
(EC 3)
0,96
1,19
1,74
0,635
с
б
.
е
ш
м
11
к
ц
М
г
а
,
а
а
,
к
с
к
.
т
К
м
и
и
о
в
/
л
н
м
ь
о
о
с
л
н
т
а
ь
я
,
ь
м
4.1
5.4
8,2
2,39
9,22*109
1,89*1010
9,0*1010
1,71*109
Наиболее широко применяются РФП на основе фтора-18
3
4. Радионуклид фтор-18
•
•
1937 - впервые получен в циклотроне;
A.H. Snell:
Phys. Rev. 51, 143;
1940 - Изучена адсорбция в костях; J.F. Volker, H.C.
Hodge, H.J. Wilkson, J.Biol. Chem. 134, 543.
С 70-х годов 20 века фтор-18
интенсивно используется в ПЭТ
исследованиях
T1/2 110 мин
96.9% +
Emax 0.635 МэВ
4
5. Преимущества фтора-18
удобный способ получения больших активностей
водной мишени циклотрона
EMAX 0.635 МэВ
18F-фторида
в
идеально подходит для ПЭТ
исследований
Пробег позитронов 2.4 мм
T1/2 110 мин
высокое
разрешение ПЭТ
изображения
возможность
проводить
сложные
синтезы
начиная с 20
Ки 18F
высокая
удельная
активность
доставкаРФП в
клиники, не
имеющие
циклотрона
5
6. Влияет ли введение фтора-18 в состав молекулы
на ее биологическую активность?
vdW радиус [Å]:1.35
(водород: 1.20)
• замена водорода или гидроксила на 18F приводит к
минимальным структурным изменениям исходной молекулы;
• высокая реакционная способность фтора-18 позволяет
получать широкий спектр радиотрейсеров, принадлежащих к
разным классам соединений;
• получение «истинных» аналогов возможно при введении
фтора-18 в структуру фторсодержащих лекарственных
средств (18F-флюмазенил и др.)
Метаболизм меченых фтором-18 молекул
блокируется на ранних стадиях
6
7. Методы получения фтора-18 (T1/2 109.7 мин)
Ядерная реакция
Облучаемый
материал
Химическая
форма
Носитель
18O(p,n)18F
H218O
18F-фторид
No
F2
18F
2
Yes
+ F2
18F
2
Yes
18O(p,n)18F
18O +
2
(0.5-1%)
20Ne(d,α)18F
20Ne
(0.5-1%)
Наиболее широко применяется метод получения фтора-18 в
водной мишени циклотрона; полученный в виде 18F-фторида он
используется в реакциях нуклеофильного замещения
7
8. Удельная мольная активность
(Specific radioactivity - SRA)
высокая удельная активность необходима для рецепторных исследований и
при использовании потенциально токсичных соединений
8
9. Удельная мольная активность
(Specific radioactivity - SRA)
высокая удельная активность необходима для рецепторных исследований и
при использовании потенциально токсичных соединений
9
10. Методы введения фтора-18 в молекулы
[18F]F-
SNAr
SN2
без
носителя
Прямое введение метки
Нуклеофильный
через
синтоны
18F(Ar)X
18F(CH
ПЭТ
трейсер
2)X
через
[18F]AсOF
синтоны
с носителем SEAr
[18F]F2
Электрофильный
[18F]F2
ПЭТ
трейсер
Прямое введение метки
10
11. Выделение [18F]фторида из облученной воды для
реакций нуклеофильного фторирования
18O(p,n)18F
1.
Дистилляция с последующим
удалением следов воды
азеотропной отгонкой с
ацетонитрилом (в присутствии
основания)
2. Сорбция на анионообменной
смоле
3. Электрохимическое выделение
• объем мишени 1- 2.5 мл;
• облученная вода током
гелия доставляется на вход
модуля синтеза
11
12. Активация фтора-18 для участия в реакциях
нуклеофильного замещения
Комплекс с криптофиксом (К222) применяется
благодаря хорошей растворимости
и слабому образованию ионных пар с 18F-
Coenen. et al, 1989
Kilbourn et al, 1990
Другие агенты для
активации фтора-18:
Сильно
гидратированный
фторид-ион с малой
реакционной
способностью
Комплекс с К222 хорошо
растворим в органических
растворителях; высокая
реакционная способность
Rb2CO3
K2CO3
TBAOH
18F
без сольватной оболочки часто
называют «naked fluoride»
12
13. Реакции нуклеофильного замещения с участием
[18F]фторида: получение активированного комплекса
18O(p,n)18F
в 1-3 мл H2O
•
Адсорбция на картридже
QMA или PHCO3
Coenen. et al, 1989
Kilbourn et al, 1990
18F-
Элюирование с картриджа
K222 и K2CO3 в смеси
MeCN:H2O 96:4
Удаление растворителей в
токе азота или вакууме при
нагреве
[K/K222]+18F-
[K/K2.2.2]+18F13
14. Введение метки методом прямого нуклеофильного
радиофторирования: стадии процесса
• получение 18F-фторид-иона в водной мишени циклотрона
• сорбция 18F фторида на смоле QMA и элюирование
• получение высокореакционного комплекса 18F с
криптофиксом или ТБАК (удаление растворителя досуха)
• фторирование (алифатическое или ароматическое)
• гидролиз/снятие защиты
• очистка (твердофазная экстракция или ВЭЖХ)
• нейтрализация (pH 5-7)
• стерильное фильтрование (on-line)
14
15. Алифатическое нуклеофильное фторирование
• введение метки путем замещения «уходящей» группы 18Fфторидом в составе активированного комплекса;
• «уходящая» группа (LG - Leaving Group);
• SN2-механизм: инверсия Вальдена (обращение конфигурации);
• необходим строгий контроль щелочности среды, чтобы
избежать реакций элиминирования;
• реакции в апротонных растворителях в отстутствие воды
(ацетонитрил, ДМСО);
• протекают с высоким выходом при температурах 80-100оС
Большинство РФП для рутинных клинических ПЭТ
исследований получают именно реакцией алифатического
замещения уходящей группы 18F-фторидом
15
16. Алифатическое нуклеофильное фторирование: Синтез 18F-FMISO
- гипоксического агента для диагностики опухолей
• «уходящая группа» - тозил (Ts);
• реакция в ацетонитриле или ДМСО;
• выход около 40%;
16
19. Первый синтез 2-[18F]-2-дезокси-D-глюкозы ([18F]ФДГ)
Впервые [18F]ФДГ была получена в середине 1970-х в Брукхейвенской
национальной лаборатории, США . Синтез проводили реакцией электрофильного
радиофторирования с использованием меченного ацетилгипофторида, тогда как
радионуклид был получен в результате ядерной реакции 20Ne(d, α)18F,
протекающей при облучении газовой мишени. В реакции с 3,4,6-три-О-ацетил-Dглюкалью был получен [18F]3,4,6-три-О-ацетил-2-дезокси-2-фтор-Dглюкопиранозил фторид, гидролиз которого в кислых условиях приводил к
образованию [18F]ФДГ. Радиохимический выход реакции составил >96%. Но,
несмотря на подтвержденное уже в первых экспериментах высокое накопление
в опухолевых тканях, в то время радиотрейсер не нашел широкого применения
из-за очень сложного и трудоемкового метода синтеза, который выполнялся
практически вручную на обычном химическом оборудовании из стекла.
OH
OH
O
HO
HO
1) [18F]CH3COOF, H2O
2) HCl
O
HO
OH
HO
18
F
19
20. Cтереоспецифический нуклеофильный синтез [18F]ФДГ
Hamacher et al. 1986
Fuchtner et al. 1996
OH
AcO
O
OTf
AcO
H
AcO
1) [18F]KF/K2.2.2 or [18F]TBAF
AcN, 80oC
HO
2) OH- or H+
H
HO
O
H
H
18
H
H
H
OAc
F
H
OH
• Прямое введение метки в молекулу алифатического субстрата (трифлата
маннозы) с высоким и стабильным выходом на стадии радиофторирования
(до 90%)
• Щелочной гидролиз on-line на одноразовом картридже С18 SepPak
• Очистка на картриджах, без применения ВЭЖХ
• Высокая степень автоматизации в современных модулях
20
21. Cтереоспецифический нуклеофильный синтез [18F]ФДГ
Hamacher et al. 1986
В 1986 году немецкими учеными был предложен наиболее оптимальный метод
синтеза [18F]ФДГ [21], который был основан на более ранних работах по методам
введения фтора-18 в алифатические субстраты реакцией нуклеофильного
замещения «уходящей» группы в присутствии межфазных катализаторов [20]. В
синтезе [18F]ФДГ было предложено использовать реакцию нуклеофильного
замещения фторид-ионом трифлатной «уходящей» группы в молекуле 1,3,4,6тетра-О-ацетил-2-О-трифторметансульфонил-β-D-маннопиранозы, аналога
маннопиранозы с «защищенными» гидроксильными группами. Реакция
протекает стереоспецифично с инверсией Вальдена. Радионуклид в форме
фторид-иона получают по ядерной реакции 18О(p,n)18F в мишени циклотрона,
заполненной водой, обогащенной кислородом-18. Переход [18F]F- из водной фазы
в органическую фазу достигается путем добавления межфазного катализатора
(МФК) – криптофикса 2.2.2, противоионом служит ион калия в составе карбоната.
Наличие следов воды является критичным на данной стадии, комплекс
криптофикса с [18F]фторид-ионом подвергается дополнительной осушке путем
последовательного добавления и упаривания небольших порций ацетонитрила,
образующего азеотропную смесь с водой. Полученный реакционноспособный
комплекс [K/K2.2.2]+I8F- и является фторирующим агентом, участвующим в
реакции замещения трифлатной группы в молекуле трифлата маннозы Реакция
также крайне чувствительна к следам кислот, поэтому для приготовления
раствора трифлата маннозы в ацетонитриле нужно использовать безкислотный 21
растворитель с очень низким содержанием воды.
22. Cтереоспецифический нуклеофильный синтез [18F]ФДГ
Hamacher et al. 1986
Гидролиз: по окончании реакции фторирования и удаления
растворителя проводят кислотный гидролиз полученного
промежуточного продукта 2-[18F]фтор-1,3,4,6-тетра-О-ацетил-Dглюкозы при 120-130°С, в результате чего происходит удаление
защитных ацетильных групп с образованием [18F]ФДГ.
Этот метод, часто называемый методом Хамахера, положен в основу
технологии синтеза [18F]ФДГ во всех современных
автоматизированных модулях синтеза.
Предложенная позднее замена кислотного гидролиза 18Fфторированного интермедиата на щелочной [Fuchtner et al.], который
протекает легко при комнатной температуре, позволила сократить
время синтеза и существенно увеличить выход продукта. Важным
преимуществом варианта щелочного гидролиза является
возможность проведения реакции на одноразовом картридже C18 или
tC18 Sep-Pak (Waters) или аналогичных в режиме on-line, что и было
использовано в кассетных вариантах модулей синтеза.
22
24. Основные этапы синтеза [18F]ФДГ
• получение 18F-фторид-иона в водной мишени циклотрона
• сорбция 18F фторида на смоле QMA и элюирование
• получение высокореакционного комплекса 18F с
криптофиксом или ТБАК (удаление растворителя досуха)
• фторирование (алифатическое)
• щелочной гидролиз/снятие защиты на картридже С18
• очистка (твердофазная экстракция)
• смыв буфером (цитратный буфер)
• стерильное фильтрование (on-line)
24
25. Особенности синтеза и анализа РФП для ПЭТ
- малый период полураспада
основного ПЭТ радионуклида –
фтора-18 (110 мин) требует
использования экспресс методов
синтеза и анализа;
- анализ препарата нужно
проводить до введения пациенту
- метод радиоТСХ с детектором
радиоактивности отвечает этим
требованиям
ТСХ – тонкослойная хроматография
Радио ТСХ сканнер фирмы raytest,
Germany (установлен в ИМЧ РАН)
25
26. ray test Isotopenmeßgeräte GmbH
file: FDG0305 method: F date: 03.05.07 time: 12:14:12
• Метод ТСХ
рекомендован для
анализа [18F]ФДГ
Американской и
Европейской
фармакопеей
[18F]ФДГ
FDG
300.0
200.0
100.0
Fluoride
• Определение
примеси [18F]фторида
стандартными
методами обращеннофазовой ВЭЖХ
затруднительно ввиду
сорбции фторида на
колонке;
origin: 0.0 mm solvent front: 99.9 mm
400.0
Cnts
Анализ
радиохимической
чистоты [18F]ФДГ
методом радиоТСХ
c ount time: 200 s s moothing constant: 2.0 mm HV : 850 V LL: 300 keV UL: 1000 k eV
0.0
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0
90.0
100.0
mm
raytest Isotopenmeßgeräte GmbH
file: FDG0305 method: F date: 03.05.07 time: 12:14:12
count time: 200 s smoothing constant: 2.0 mm HV: 850 V LL: 300 keV UL: 1000 keV
origin: 0.0 mm solvent front: 99.9 mm
No
Name
Max.Pos
Pos
mm
rf_center
rf_max
mm-mm
%s
%
1
Fluoride
9.5
5.0-15.0
0.10
0.10
4.22
2
FDG
48.2
38.0-62.0
0.50
0.48
95.78
Total
129.13
Sum
29.13
в ИМЧ РАН,
Ст-Петербург
100.00
Rem
Анализ
[18F]ФДГ
26
27. Концепция блокированного метаболизма в ПЭТ
исследованиях с 18F-ФДГ
H OH
H O
HO
HO
H
H
H
18
F
OH
Злокачественные клетки
характеризуются более активными
процессами гликолиза, что
обусловлено повышенным уровнем
белков, транспортирующих глюкозу
(транспортеров глюкозы Глут1 1 и
Глут 2), и, в большей степени,
увеличением активности
гексокиназы в неоплазме.
ПЭТ с ФДГ позволяет количественно определять
регионарную скорость потребления глюкозы в тканях
27
28. Недостатки и ограничения ФДГ
Низкая специфичность к опухолевым клеткам;
Высокий уровень физиологического накопления в
сером веществе мозга;
Сложность диагностики опухолей с низкой
скоростью гликолиза;
Высокое накопление в очагах воспаления
Высокое накопление в мочевом пузыре
Высокое накопление в очагах воспаления - наиболее
частая причина ложно положительных заключений в
диагностике опухолей мозга
28
29. Приоритетные РФП на основе фтора-18 для диагностики
опухолей (кроме ФДГ) программа МАГАТЭ 2009-2014 г.
Класс
Функция/
радиотрейсеров применение
РФП
Метод синтеза
Аминокислоты
ФЭТ (FET)
Нуклеофильный
прямой
Транспорт АК
(опухоли мозга)
Транспорт АК
6-ФДОФА Электрофильный
(нейроэндокрин. (6-FDOPA) прямой
опухоли)
Нуклеозиды
Метастазы,
эффективность
терапии
ФЛТ (FLT)
Нуклеофильный
прямой
Гипоксические
агенты
Гипоксические
опухоли
ФАЗА
(FAZA)
Нуклеофильный
прямой
Производные
холина
РПЖ, опухоли
мозга
ФМеХол
(FMeChol)
Нуклеофильный
двустадийный
29
30. Синтез 3’-дезокси -3’-[18F]фтортимидина (FLT)
AF Shields et al, Nature Medicine 1998
O
O
DMBn
N
N
DMTrO
O
ONs
N
O
HO
O
1) [18F]KF/K2.2.2, AcN, 100oC
2) NaOH 0,5%
18
N
H
O
F
• фосфорилируется по 5’-OH-группе тимидин-киназой TK1
• из-за наличия фтора не инкорпорируется в ДНК
• накапливается в пролиферирующих клетках
• применяется для выявления метастаз, в оценке эффективности лечения
30
31. Алифатическое нуклеофильное фторирование: синтез
18F-фтороазомицин арабинозида (18F-FAZA)
18
TsO
CH2
O
NO2
N
18F-FAZA:
CH2
O
AcO
OAc
F
N
1) [18F]KF/K2.2.2, DMSO
2) NaOH
гипоксический агент
NO2
HO
N
OH
N
Piert et al, J Nucl Med 2005
• гипоксия характеризуется дефицитом кислорода;
• гипоксические клетки опухоли обладают повышенной (3-5 раз)
резистентностью к радиотерапии;
18F-FAZA накапливается в гипоксических клетках;
• недостаток: высокий уровень неспецифического связывания
31
32. Ароматическое нуклеофильное фторирование:
• нуклеофильная атака по атому углерода в sp2 конфигурации (в
положении «уходящей» группы);
• обязательно наличие активирующей (EWG) –группы в орто- или параположении;
• EWG-грппы: CHO, CN, COOR, NO2;
• «уходящие группы» (LG): NO2, Br, I, Cl, N+Me3
• реакции протекают в апротонных полярных растворителях;
• высокий выход достигается при температуре 160-180оС за 20-30 мин;
•
32
33. Введение метки в [18F]фторгетероарены методом
прямого нуклеофильного фторирования
N
N
K[18F]F/K2CO3 - K222
DMSO
18
X
F
X=I, Cl, NO2, N(Me)3+ TfO-
Dolle et al, 2004
33
34. Ароматические аминокислоты: выбор метода
синтеза зависит от положения метки
2-[18F]фтор-L-тирозин
O-(2’-[18F]фторэтил)-L-тирозин
NH2
COOH
HO
18
F
Электрофильный синтез
Coenen et al. J Nucl Med
(1989) 30:1367
Прямое введение метки в
ароматический фрагмент АА
невозможно
NH2
18
COOH
F
O
Нуклеофильный синтез
Wester et al. J Nucl Med
(1999) 40: 205
34
35. Методы получения [18F]фторэтил тирозина (ФЭТ)
Прямое нуклеофильное
фторирование
18F-фторалкилирование
TsO
OTs
[K+/2.2.2.]
AcN,
18F-
18
TsO
90oC
F
NH2
Tyrosine
(di-Na-salt)
DMSO,
18
90oC
Br
[K+/2.2.2.]
O
Hamacher, Coenen Appl Rad Isot 2002
18
TsO
F
Br
O
O
H
NH2
O
NH2
COOH
18
DMSO, NaOH, 100oC
F
O
o-DCB, 110oC
HO
18
TsO
18F-
O
OH
O
O
H2N
2)TFA
COO-
F
1) Bu4N+ 18F-
O
HN
Wester et al., J Nucl Med 1999
OTs
Ph
Ph
Ph
Ni
N
O
Гомзина НА и др. Радиохимия 2006
N
Ph
1)
2) 0,5M HCl
N
COOH
F
H2N
O
Bu4N+ 18F18
OH
F
O
H
O
Krasikova et al., Bioorg. Med. Chem., 2008
35
36. Прямое введение метки в сложные
ароматические субстраты: синтез 18F-MPPF
OCH3
N
N
N
K[18F]F/K2CO3 - K222
N
NO 2
OCH3
ДМСО, 140оС, 20 мин
O
N
N
N
N
18
F
O
18F-MPPF – радиолиганд для
визуализации 5HT1a рецепторов
(серотонинергическая система,
используется в иссл. депрессии)
36
37. Синтез 18F-флюмазенила, радиолиганда для
диагностики эпилепсии
Ro 15-2344 was
kindly provided by
Hoffmann La
Roche, Basel
N
N
COOC2H5
N
COOC2H5
N
[K/K2.2.2.]+/18F-
O2N
DMF, 160oC, 30 min
N
O
18F
CH3
N
O
CH3
Ro 15-2344
meta позиция уходящей группы; псевдоароматическая структура
Эффективность 18Fфторирования - 60%,
DMSO, 30 мин, 180oC
Ryzhikov N. et al,
Nucl Med Biol 2005
37
38. Многостадийный нуклеофильный асимметрический синтез
2-[18F]фтор-L-тирозина с МФ катализом S-НОБИНом
CHO
OMe
2
1
NO2
CH 2OH
CHO NaBH4 aq
[K/K222]+18F-, 180oC
OMe
OMe
18
F
18
F
3
O
OH
O
N
Ni N
N
O
Ph3PBr2
CH2Cl2, 5 min
H
CH 2Br
H
18
OMe
F
NH 2
Krasikova et al.,
Nucl Med Biol 2004
4
O
N
O
O
Ni N
N
CH2Cl2, NaOH, 20oC, 4 min
18
F
CH 2
H
OMe
NH 2
5
COOH
57% HI
170oC
HO
18
F
2-[18F]fluoro-L-tyrosine
38
43. Недостатки метода электрофильного
фторирования с использованием [18F]F2
18O(p,n)18F
20Ne(d,α)18F
Низкая производительность
газовой фторной мишени
Фторирование:
Теоретический
выход 50%
Изотоп получают в газовой
мишени; для его выделения из
мишени необходимо добавление
носителя (0.4% of F2)
Низкая удельная
активность
Критично для токсичных соединений и
рецепторных радиолигандов
43
46. Стереоселективный электрофильный синтез
6-18F-фтор-L-ФДОФА с использованием [18F]F2
EtOOC
HOOC
EtOOC
N
H
R
Sn(CH3)3
BocO
N
H
18
F
[18F]F2
CHCl3
R
NH2
HBr
130oC,
F
10 мин
HO
BocO
OBoc
18
OBoc
R = Boc, CHO
• высокая стереоспецифичность (>99 %
L-изомера);
• коммерчески доступный станнильный
прекерсор (АВХ);
• автоматизация с помощью модуля
TracerLab FX FE;
• Радиохимический выход: 33+4% (EOB)
OH
• Namavari et al.
Appl Rad Isot 1992
• E.F.J. De Vries et al,
Appl Rad Isot, 1999
46
47. Стадии синтеза 6-18F-фтор-L-ДОФА методом
электрофильного фторирования
• Время облучения неоновой мишени 150 мин.; ток 40 мкА; получают 8.95 ± 0.61 GBq
(n = 15);
• Улавливание в 10 мл фреона, содержащего 60 мг прекерсора при -20оС;
• Реакция: 30оС, 4 мин, удаление фреона в вакууме при 50оС;
• Снятие защиты: 2.0 ml, 47% HBr, 130оС, 10 мин;
• Охлаждение до 70оС, частичная нейтрализация добавлением 1.3 мл 25% раствора
NH4OH;
• Разбавление фосфатным буфером перед ВЭЖХ очисткой;
• ВЭЖХ очистка (Nucleosil 100 C-18, 7 микрон, 16х250 мм; элюент 2% этанола в 0.05 M
NaH2PO4 (pH 4-5);
• Стабилизация: фракцию продукта собирают в вайл, содержащий 100 мкл раствора
(75 мг аскорбиновой кислоты в 0.6 мл 0.5 N NaOH)
47
48. Недостатки электрофильного синтеза 6-18F-фтор-LДОФА
• Длительное время облучения, длительное время
улавливания фтора-18 в растворе прекерсора во фреоне;
• Потери радиоактивности на стадии упаривания фреона
(фреон можно заменить на дейтерированный хлороформ!)
• Длительная процедура «подщелачивания» перед ВЭЖХ
очисткой
•Необходимость стабилизации продукта в отношении
радиолиза (добавление аскорбиновой кислоты)
• Обязательное определение высоко токсичного олова в
продукте
• Большое количество (60 мг на синтез) дорогостоящего
прекерсора
48
