SẮC KÝ LỌC GEL GVHD TRẦN THANH TUẤN

1. SẮC KÝ LỌC GELSẮC KÝ LỌC GEL
GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: TRẦN THANH TUẤN

2. GIỚI THIỆUGIỚI THIỆU

3. Sắc kí gel dùng để tách các phân tử dựa trên
sự khác nhau về kích thước của các phân tử.
Những phân tử không bị giữ lại bằng liên kết
hóa học nên thành phần của dung môi giải li
(buffer) không ảnh hưởng trực tiếp đến độ(buffer) không ảnh hưởng trực tiếp đến độ
giải li (resolution).
Sắc kí gel phù hợp với những phân tử sinh
học nhạy cảm với pH, nồng độ ion kim loại,
môi trường khắc nghiệt.

5. Quá trình phân tách bằng phương pháp sắc kí gel
(gel filtration)
Gel được nhồi vào cột tạo thành đệm (packed bed).
Đệm là mạng lưới lỗ xốp hình thành từ hạt hình cầu
đặc tính bền vật lý, bền hóa học và trơ.
Lớp gel cân bằng với dung dịch đi qua (buffer). DungLớp gel cân bằng với dung dịch đi qua (buffer). Dung
dịch điền đầy vào mạng lưới lỗ xốp và khoảng không
giữa các hạt.
Chất lỏng bên trong lỗ xốp được xem như là pha tĩnh
và chất lỏng bên ngoài được xem là pha động.

6. LÝ THUYẾT CỦA QUÁ
TRÌNH SẮC KÍ GELTRÌNH SẮC KÍ GEL

7. Đặc điểm của quá trình
Kết quả của quá trình sắc kí gel thường được
biểu diễn trên giản đổ giải li hay phổ đồ sắc kí
cho thấy sự khác nhau về nồng độ (liên quan
đến mức độ hấp thụ tia UV ở vùng 280 nm)đến mức độ hấp thụ tia UV ở vùng 280 nm)
của các thành phần trong mẫu khi chúng
được giải li khỏi cột dựa trên trật tự về kích
thước phân tử.

9. Trạng thái của mỗi cấu tử được biểu diễn liên
quan đến thể tích giải li của chúng, Ve (elution
volume) được đo trực tiếp từ phổ đồ sắc kí.volume) được đo trực tiếp từ phổ đồ sắc kí.
Có 3 cách để xác định Ve:

12. Biểu đồ thể hiện V0 và Vt

14. Đường cong chọn lọc và lựa chọn
phương pháp
Chọn lựa phương pháp sắc kí gel
chỉ phụ thuộc hoàn toàn vào sự phân bố kích
thước lỗ xốp và được mô tả bởi đường cong
chọn lọc. Bằng cách vẽ đường cong đi qua
những điểm giá trị Kav ứng với log Mr của các
protein chuẩn có thể xây dựng được đường
cong chọn lọc.

16. Phương pháp lọc gel được chọn lựa sao cho khối lượng
phân tử lớn được giải li ở thể tích khoảng
trống Vo (Kav = 0) với mũi giản rộng ít nhất và thời
gian là tối thiểu. Những hợp chất có khối lượng phân
tử nhỏ nhất được giải li gần giá trị Vt (Kav = 1)
+ Nếu Kav > 1, có thể phân tử bị mắc kẹt trong
mạng lưới gel do kích thước quá nhỏ (V > V ).mạng lưới gel do kích thước quá nhỏ (Ve > Vt).
+ Nếu Kav < 0, có thể trong cột đã xuất hiện
những kênh, rãnh mà các phân tử có thể chảy tắt qua
cột (Ve < Vo).

17. Độ giải li

18. Các thông số để xác định độ giải li

19. Độ giải li là hàm của độ chọn lọc của
phương pháp và hiệu quả của phương pháp
tạo ra những mũi hẹp.

20. Hiệu quả của cột nhồi phụ thuộc vào việc tạo ra
mũi hẹp đối xứng trong quá trình giải li và được
xác định dựa trên số đĩa lý thuyết trên đơn
vị chiều dài (N):
N = 5.54(Ve/W1/2)2 . 1000/L
Trong đó:Trong đó:
+ Ve: thể tích mũi giải li.
+ W1/2: chiều rộng mũi tại một nửa chiều cao
mũi.
+ L: chiều cao đệm.

21. Sự pha loãng mẫu là không thể tránh khỏi bởi
vì khi mẫu đi qua cột thì quá trình khuếch tán
xảy ra. Để giảm tối thiểu việc pha loãng mẫu
thì sử dụng thể tích mẫu tối đa trong giới hạn
khoảng cách có thể phân tách. Nếu không có
vùng giản rộng thì thể tích tối đa của mẫu có
thể lớn bằng thể tích phân tách:
VSep = VeB - VeA

22. PHÂN LOẠI GELPHÂN LOẠI GEL

23. Khi lựa chọn loại gel thích hợp cần xem xét hai
yếu tố:
+ Mục tiêu của thí nghiệm (phân tích độ phân
giải cao hay tách thành từng nhóm hợp chất)
+ Khối lượng phân tử của protein mục tiêu và
chất bẩn
Trên thị trường có 5 nhóm thông dụng là
Superdex,Sephacryl, Superose và Sphadex và
Sphadex LH-20

24. Superdex
Từ phòng thí nghiệm đến qui mô công nghiệp
Superdex là loại gel được lựa chọn đầu tiên cho
độ giải li cao với thời gian ngắn và độ thu hồi tốt.
Superdex được sản xuất với hai loại kích
thước hạt với 4 độ chọn lọc khác nhau (Superdex
Peptide , superdex 30, Superdex 75, Superdex
200).

27. Sử dụng cột được nhồi sẵn hạt kích thước 13 của
Superdex Peptide Superdex 30, Superdex 200 cho
phân tích độ phân giải cao với thể tích mẫu nhỏ.
Sử dụng cột nhồi sẵn hạt kích thước 34 của
Superdex perep grade cho qui mô công nghiệp.
Khi không biết khối lượng của protein quan tâmKhi không biết khối lượng của protein quan tâm
thì nên bắt đầu với Superdex 200. Superdex 200 hay
Superdex 200 prep grade đặc biệt thích hợp cho việc
phân tách kháng thể đơn dòng từ dimerr và từ chất
bẩn có khối lượng phân tử thấp.

28. Sephacryl
Sephacryl là lựa chọn cho phân tách nhanh,
độ thu hồi cao tại phòng thí nghiệm và qui mô
công nghiệp.
Sephacryl Superdex High Resolution (HR)Sephacryl Superdex High Resolution (HR)
thay thế cho superdex prep grade trong những
ướng dụng đòi hỏi khoảng tuông đối rộng ,độ bền
hóa học và chịu được tốc độ dòng cao là cho
Sephacryl phù hợp cho sử dụng trong công
nghiệp.

30. Superose
Superose có thể dùng trong khoảng khối lượng
phân tử rộng nhưng không phù hợp cho phân tách qui
mô công nghiệp
Superose là loại gel bền vật lí và hóa học cao, hình
thành dựa trên liên kết ngang cùng phân tử lỗ xốpthành dựa trên liên kết ngang cùng phân tử lỗ xốp
agarose. Một vài tương tác kị nước với gel làm cho
những phân tử kị nước nhỏ, aromatic peptides,
membrane proteins và lipoproteins có thể được giải li
chậm hơn dự đoán. Tuy nhiên, trong 1 vài ứng dụng ,
những tương tác này có thể giúp làm tăng độ giải li
của quá trình phân tách.

32. Sephadex
Sephadex được dùng để tách nhanh những
nhóm có khối lượng phân tử nhỏ , khử muối, đổi dạng
dung môi và làm sạch mẫu.
Sephadex được tạo thành bởi liên kết ngangSephadex được tạo thành bởi liên kết ngang
giữa dextran với epichlorohydrin.
Những loại khác nhau của Sephadex là do mức độ
khác nhau của liên kết ngang và vì vậy nó có những
mức độ trương nở và độ chọn lọc khác nhau cho
những kích thước phân tử đăc trưng.

33. Sephadex LH-20
Sephadex LH-20 được sản xuất dành
riêng cho việc phân tách và tinh chế các hợp
chất tự nhiên mà đòi hỏi sự có mặt của dung
môi hữu cơ để duy trì độ bền cả chúng.môi hữu cơ để duy trì độ bền cả chúng.
Nó được sư dụng trong phân tích và trong
qui mô công nghiệp để phân tách những
nhóm chất có tính chất tương tự nhau.

34. Sephadex LH-20 phù hợp cho giai đoạn tinh
chế ban đầu trước khi tinh chế với độ tinh
khiết cao bằng sắc kí tao đổi ion hay sắc kí
pha đảo hay nó có thể dùng cho giai đoạn tinh
chế với độ tinh khiết cao đối với các đồng
phân không đối quang (diastereoisomers).

35. ỨNG DỤNGỨNG DỤNG

36. Khử muối – đổi dung môi – làm
tang nồng độ protein

37. Quá trình khử muối protein nóng chảy (His)6

38. Quá trình khử muối ghép nhiều cột để tăng thể tích
mẫu

40. Sắc kí gel trong chiến lược tinh chế.
Để tinh chế ở mức độ cao hay khi không tìm
được phối tử phù hợp cho phương pháp tinh chế một
giai đoạn bằng cột ái lực, một phương pháp nhiều giai
đoạn hiệu quả được phát triển để sử dụng cho quá
trình tinh chế, phương pháp này gọi tắc là CIPP.
CIPP được sử dụng cho công nghệ dược và
nghiên cứu trong phòng thí nghiệm để đảm bảo phát
triển một phương pháp nhanh, hiệu quả và chất lượng
cao.

42. Xác định khối lượng phân tử và phân tích sự
phân bố khối lượng phân tử.
Không giống như kỹ thuật điện di, sắc kí gel
cung cấp phương pháp để xác định khối
lượng phân tử hay kích thước của protein tự
nhiên hay protein biến tính dưới những điều
kiện khác nhau về pH,nhiệt độ, ái lực các ion.

43. Việc xác định khối lượng phân tử bằng
phương pháp sắc kí gel có thể thực hiện bằng
cách so sánh thông số thể tích giải li (Vc) hay
Kav của chất quan tâm với giá trị thu được từ
chất chuẩn đã biết trước.

44. Đường cong chuẩn được xây dựng bằng cách đo thế
tích giải li của một vài chất chuẩn, tính giá trị Kav tương
ứng và vẽ giá trị Kav tương ứng với logarit khối lương phân
tử của chúng.
Khối lượng phân tử của một chất chưa biết có thể
xác định từ đường cong chuẩn khi đo giá trị Vc và tính giá
trị Kav của chúng.av
Thông số giải li khác như V0, Vc/Vo, Kd cũng có thể
được sử dụng để xây dựng đường cong chuẩn nhưng giá trị
Kav thường được sử dụng vì nó ít bị ảnh hưởng bởi sai số
do sự khác nhau về thông số và sự chuẩn bị cột; ngoài ra
không đòi hỏi xác định chính xác giá trị Vi như đối với Kd.

45. CẢM ƠN THẦY VÀ
CÁC BẠN ĐÃ LẮNG
NGHENGHE
THE END