[123doc] - bai-giang-sac-ky-long-hieu-nang-cao-hplc.ppt

2
Lựa chọn công nghệ nào?

MỞ ĐẦU
• Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kỹ thuật tách chất và phân
tích đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu từ đa lượng
đến vi lượng mà sắc ký cổ điển không đáp ứng được
• Ngày nay, kết hợp với một số các phương pháp sắc ký hiện
đại khác như sắc ký khí, điện di, điện. Sự phát triển và ứng
dụng của kỹ thuật phân tích hiện đại đã đi vào nhiều lĩnh vực
trong cuộc sống: Công nghiệp, môi trường, vệ sinh an toàn
thực phẩm, sinh học, hình sự,..đặc biệt là trong Y – Dược học.
• Cơ sở của sắc ký lỏng cao áp HPLC dựa trên sự tương tác của
các thành phần chất phân tích, pha tĩnh và pha động

Nguyên tắc – Phân loại
1
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
2
Các thông số đặc trưng
3 4
4
Nội dung
Kỹ thuật sắc ký HPLC
Tối ưu hóa quá trình sắc ký
5
6 Ứng dụng sắc ký HPLC

5
Nguyên tắc – phân loại
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)

1.1. Nguyên tắc
* HPLC là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá
trình vừa có tính chất hoá học lại vừa có tính chất lý học. Nó là
những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha
động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan
(hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột ( pha
tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách.
* Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào nhiều yếu tố.
Vì thế trong quá trình sắc ký có chất tan bị lưu giữ lâu trên cột, có
chất tan bị lưu giữ ít. Điều đó dẫn đến kết quả có quá trình tách các
chất xảy ra trên cột sắc ký.
1. Nguyên tắc – Phân loại

Các chất được tách ra với thời gian lưu tương ứng
T=0
T=10’
T=20’
Injector
Injector Detector
Detector
Most
Most Interaction with Stationary Phase
Interaction with Stationary Phase Least
Least
Flow of Mobile Phase
T=0
T=10’
T=20’
Injector
Injector Detector
Detector
Most
Most Interaction with Stationary Phase
Interaction with Stationary Phase Least
Least

CỘT TÁCH
PHA TĨNH
CHẤT
PHÂN TÍCH
PHA ĐỘNG
F1 F2
F3
Ft = F1 + F2 + F3

* Phân loại HPLC dựa vào kỹ thuật sắc ký
 Sắc ký phân bố
 Sắc ký hấp phụ hoặc lỏng-rắn
 Sắc ký trao đổi ion
 Sắc ký loại trừ kích thước
1.2. Phân loại
Trao đổi ion Sàng lọc
Phân bố

Pha tĩnh được nhồi trong cột
Pha động ở trạng thái lỏng: Các dung môi, hỗn hợp dung môi hoặc nước
* Phân loại HPLC dựa vào vật liệu nhồi
 Pha thông thường (Normal phase): vật liệu nhồi là silica đơn giản
 Trao đổi ion: silica biến tính (modified silica)
 Pha đảo (reverse-phase): silica biến tính
Silica biên tính C18
Silica Backbone
Quaternary Amine anion exchanger
Acetate counter ion
(Standard anion exchanger carries Cl-
)

Sử dụng pha đảo trong tách các vitamin tan trong dầu

13
Cấu tạo máy HPLC

2. Bơm
3. Hệ tiêm mẫu
4. Cột
5. Detecter
6. Máy tính
1 Pha động
Cấu tạo máy HPLC

2.1. Pha động (Dung môi)
 Có một hoặc nhiều bình chứa dung môi ( Thể tích 500 ml)
 Loại bỏ hoàn toàn khí hòa tan và cặn trong dung môi giảm độ rộng
của peak (band spreading) và ảnh hưởng đến chất lượng detector
 Đuổi khí hòa tan trong dung môi bằng khí trơ (sparger)
 Lựa chọn chế độ tách rửa (elution) cho dung môi
 Trang bị các loại valves tỷ lệ (proportionating valves) cho phép đưa
dung môi từ hai bình chứa với các lưu lượng thay đổi liên tục
2.1.1. YÊU CẦU VỚI DUNG MÔI
• Nhiệm vụ: Cung cấp dung môi cho quá trình sắc ký,
đưa chất phân tích ra khỏi cột sắc ký

Polar Solvents
Water > Methanol > Acetonitrile > Ethanol > Oxydipropionitrile
Non-polar Solvents
N-Decane > N-Hexane > N-Pentane > Cyclohexane
Độ phân cực của một số dung môi sử dụng trong HPLC
 Chủ yếu dựa vào sự phân cực của cấu tử phân tích, pha động, pha tĩnh
 Quy tắc chung: độ phân cực (polarity) của cấu tử cần phân tích và pha động là
tương đương còn pha tĩnh có độ phân cực khác biệt → thời gian phân tích ngắn
 Khi độ phân cực của cấu tử và pha tĩnh quá giống nhau: tương tác mạnh giữa
cấu tử cần phân tích và pha tĩnh  thời gian phân tích kéo dài
2.1.2. Lựa chọn dung môi

 Sử dụng một dung môi đơn giản có thành phần không đổi:
isocratic
 Sử dụng hai hay nhiều hơn các hệ dung môi có độ phân cực
(polarity) khác nhau nhiều: gradient elution
 Tỷ lệ các loại dung môi được chương trình hóa liên tục hoặc
theo từng bậc
 Gradient elution: tăng chất lượng của quá trình tách (improve
seperation efficiency)
2.1.3. Chế độ chạy - Quá trình tách rửa (Elution)

Tên dung môi
Giới hạn dưới đo
UV (nm)
Chỉ số khúc
xạ
Điểm sôi
(oC)
Độ nhớt CP,
25oC
Độ phân cực
(Theo Snyder)
n-hexan 190 1,372 69 0,3 0,1
Benzen 280 1,498 80 0,6 2,7
Metylen clorit 233 1,421 40 0,4 3,1
n-propanol 240 1,385 97 1,9 4,0
Tetrahydrofuran 212 1,405 66 0,46 4,0
Etyl axetat 256 1,370 77 0,43 4,4
Clorofom 245 1,443 61 0,53 4,1
Axeton 330 1,456 56 0,30 5,1
Etanol 210 1,359 78 1,08 4,3
Axit axetic - 1,370 188 1,1 6,0
Axetonitril 190 1,341 82 0,34 5,8
Metanol 205 1,326 65 0,54 5,1
Nước 190 1,333 100 0,89 10,2
Tính chất một số loại dung môi sử dụng trong HPLC

• Ảnh hưởng của dung môi khác nhau

Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi thay đổi
• Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi

Tách một số các hợp chất hữu cơ
Chế độ chạy: Đẳng dòng
Gradien

* Chương trình trộn dung môi ở áp suất thấp
DUNG MÔI 2
DUNG MÔI 3
BỘ PHẬN
HÒA TRỘN
BƠM VAN MẪU
DUNG MÔI 1
2.1.4. Chương trình trộn dung môi
Ưu điểm: Chỉ dùng một bơm
Nhược điểm: Hệ thống 3 van lấy 3 dung môi phức tạp, chi phí ko
cao

* Chương trình dung môi ở áp suất cao
DUNG MÔI 1 BƠM 1
DUNG MÔI 2 BƠM 2
DUNG MÔI 3 BƠM 3
BỘ PHẬN
HÒA TRỘN
VAN MẪU
Ưu điểm: Độ đúng và độ lặp lại cao hơn
Nhược điểm: Tốn kém và cồng kềnh

2.2. Hệ thống bơm
* Yêu cầu hệ thống bơm
 Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào 5000psi trở lên
 Bơm lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01 – 5ml/phút
 Có thể chịu được tác động của nhiều loại dung môi
* Nhiệm vụ: Để bơm pha động (dung môi rửa giả chất) qua cột tách
thực hiện quá trình sắc ký của các chất mẫu đã được nạp vào cột sắc ký
BƠM ĐẨY MỘT PITTONG BƠM ĐẦY NHANH BƠM ĐẨY KÉO

• Ảnh hưởng của tốc độ dòng

* Nguyên lý: Hệ bơm mẫu cho
sắc ký lỏng sử dụng nguyên lý
cơ bản là mẫu ban đầu được
nạp vào trong vòng chứa mẫu
có thể tích nhất định bằng một xi
lanh ở áp suất thường
2.3. Hệ tiêm mẫu
* Nhiệm vụ: Để nạp (bơm)
chính xác một lượng mẫu nhất
định (hỗn hợp chất phân tích)
vào cột tách sắc ký
* Chế độ tiêm
Tiêm mẫu bằng xylanh
Tiêm mẫu tự động

27
Tiêm mẫu bằng xylanh
Mặt trước
Tiêm mẫu
 Sử dụng valve 6 cổng
 Có thể thay thể sampling loops từ 5 l đến 500 l
 Sai số của lượng mẫu nạp dưới 1%

28
Tiêm mẫu tự động
Step 1 Step 2
Step 3

• Ảnh hưởng của kích thước hạt nhồi

• Ảnh hưởng của loại cột khác nhau

 Cột thông thường:
L = 10 – 30 cm và có thể nối tiếp 2 cột hoăc nhiều hơn
ID = 4 – 10 mm, kích thước hạt nhồi: 3, 5 và 10m
40.000 – 60.000 đĩa/m cột
 Cột tốc độ cao và hiệu quả hơn
L = 3 - 7 cm và có thể nối tiếp 2 cột hoăc nhiều hơn
ID = 1 – 4,6 mm, kích thước hạt nhồi: 3 hoặc 5 m
100.000 đĩa/m cột
* Nhiệm vụ: Tách các mẫu chất ra khỏi nhau
* Cấu tạo: Cột nhồi và cột bảo vệ

2.4.3. Ổn định nhiệt độ của cột (Column Thermostats)
 Phần lớn ứng dụng của HPLC được thực hiện ở nhiệt độ phòng
 Tuy vậy chất lượng của sắc ký đồ sẽ tốt hơn nếu duy trì nhiệt độ
của cột không thay đổi (sai số < 0,05°C)
 Thiết bị HPLC hiện đại được trang bị thêm lò gia nhiệt cho cột
(Column heater) ổn định nhiệt độ ở gần 150°C với sai số < 0,05°C
 Trang bị hệ thống phun nước làm lạnh (water jackets fed) từ bể ổn
nhiệt để khống chế chính xác nhiệt độ

2.5. Detector
2.5.1. Yêu cầu
 Đáp ứng nhanh và lặp lại
 Độ nhạy cao, phát hiện chất phân tích ở nồng độ thấp
 Vận hành ổn định, dễ sử dụng
 Khoảng tuyến tính rộng
 Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng
* Nhiệm vụ: Phát hiện và đo nồng độ các chất phân tích theo tính chất
hóa lý bằng cách chuyển các tín hiệu không điện thành tín hiệu điện

* Một số đặc điểm của detector trong HPLC
Loại Detecter
Độ nhạy
(mg/ml)
Khoảng
tuyến tính
Đặc điểm
Rửa giải
gradient
Hấp thụ UV-VIS
- Đo quang (kính lọc)
- Đo quang phổ
- Mảng diod
5.10-7
5.10-7
> 2.10-7
10+4
10+5
10+5
Sử dụng phổ biến, chọn lọc với
các chất có cấu trúc hoặc nhóm
chức chưa bão hòa. Ít thay đổi
với tốc độ dòng và nhiệt độ
+
Huỳnh quang 10-9 104 Đặc biệt rất nhạy, chọn lọc +
Chỉ số khúc xạ 5.10-4 104 Vạn năng, độ nhạy vừa phải.
Thay đổi nhiều theo nhiệt độ
-
Tán xạ bay hơi 2.10-4 104 Vạn năng, độ nhạy vừa phải,
đáp ứng với khối lượng
+
Đo độ dẫn 10-5 104
Có thay đổi theo nhiệt độ và tốc
độ dòng. Không dùng cho
gradient, chỉ thích hợp với chất
tan ion
-
Đo ampe 10-9 105 Rất nhạy, chọn lọc, điện cực dễ
bị nhiễm bẩn
-

* Detector UV-VIS
Đây là loại được sử dụng phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự
hấp thụ bức xạ UV-VIS ( bước sóng 190-800nm) của các chất
phân tích.
 3 cấu hình của detector hấp thụ UV-VIS
 Detector đo ở bước sóng cố định
 Detector đo ở bước sóng thay đổi
 Detector mảng diod UV-DAD

* Detecter huỳnh quang
 Sử dụng thiết bị huỳnh quang kính lọc hoặc quang phổ huỳnh
quang cho detector huỳnh quang.
 Độ chọn lọc và độ nhạy có thể hơn đến 1000 lần detector hấp thụ UV
 Áp dụng: Hợp chất thơm đa vòng, dẫn chất quinolin, steroid, ancaloid..
 Do độ nhạy cao nên sử dụng cho phân tích lượng vết, mẫu sinh
học, giám định pháp y,…

Khối phổ
 Phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự
chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một
điện trường hoặc từ trường nhất định.
 Là một kỹ thuật cao, áp dụng cho phân tích được hầu hết các loại
chất, chất bền nhiệt hay không bền nhiệt
 Độ nhạy cao, có thể phát hiện được chất có LOD < 1pg

2.6. Máy tính
• Thể hiện thời gian lưu của chất
• Tách chất và xác định hàm lượng của chất thông qua độ hấp thụ
Phổ UV
Sắc ký đồ

40
Các đại lượng đặc trưng HPLC
1
2
3
4
5
mAU
time
6

3.1. Hệ số phân bố
Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng
phương trình như sau:
Hằng số K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số
phân bố
Với CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh.
CM : nồng độ cấu tử trong pha động.
Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích.

3.2. Thời gian lưu
tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột.
tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua
cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn
gọi là thời gian lưu chết.
tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử.
Thông số quan trọng để
tách chất, tối ưu hóa quá
trình sắc ký

3.3. Hệ số dung lượng k’
k’ được định nghĩa theo công thức sau:
Với VS : thể tích pha tĩnh
VM : thể tích pha động
Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại.
Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân
tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù.
Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’
có thể chấp nhận trong khoảng rộng 1-20.

3.4. Hiệu năng ( Số đĩa lý thuyết)
Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ.
Với W1/2 là chiều rộng pic sắc ký ở vị trí ½ chiều cao pic (phút)
W là chiều rộng pic sắc ký ở vị trí đáy pic (phút)
Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách
sắc ký của các cấu tử trên cột. N càng lớn, hiệu năng tách càng cao.
Hay

3.5. Độ chọn lọc
Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.
Giá trị chọn lọc luôn lớn hơn 1.
Giá trị lớn hay nhỏ đều tác động đến quá trình tách sắc ký

3.6. Độ phân giải
Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc
ký: sự giải hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách. Nó được
xác định qua phương trình sau:

50
Kỹ thuật tách HPLC

4. Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao
 Sắc ký phân bố (partition chromatography)
 Sắc ký hấp phụ hoặc lỏng-rắn
(adsorption or liquid-solid chromatography)
 Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)
 Sắc ký loại trừ kích thước (size exclusion chromatography)
SO3
-
SO3
-
Na
+
COO
-
H3N
+
Na
+
COOH
H3N
+
pH2
pH4.5
Ion-exchange Resin
VD: nguyên lý sắc ký trao đổi ion
(acide amine)
Sắc ký loại trừ kích thước

4.1. Sắc ký hấp phụ hoặc lỏng-rắn
(adsorption or liquid-solid chromatography)
* Nguyên lý: Là quá trình hấp phụ chất phân tích trên bề mặt
chất rắn. Pha tĩnh là chất rắn phân cực. Chất phân tích tranh
chấp với pha động ở các vị trí hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh.
Lưu giữ chất phân tích bằng lực hấp phụ
* Ứng dụng: Các chất phân tích có khối lượng phân tử dưới
5000, ít tan trong nước hoặc trong hỗn hợp nươc-dung môi hữu
cơ không thích hợp với sắc ký pha đảo. Có thế mạnh trong việc
tách các đồng phân vị trí các hợp chất hữu cơ, Phân tích các
chế phẩm dầu mỏ, thực phẩm, dược phẩm..

4.2. Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)
* Nguyên lý: Dựa vào lực hút của ion chất tan và vị trí mang
điện tích trên pha tĩnh. Chất trao đổi anion có nhóm mang điện
tích dương trên pha tĩnh hút anion chất tan. Chất trao đổi
cation có nhóm mang điện tích âm sẽ hút cation chất tan. Chất
trao đổi cation và anion là polymer không tan trong nước
mang các nhóm trao đổi ion
* Ứng dụng: Dùng để tinh chế nguyên liệu loại tạp chất ; Tăng
nồng độ các thành phần vi lượng trong dung dịch đủ để phân
tích ; Áp dụng cho săc ký hiện đại

4.3. Sắc ký loại trừ kích thước (size exclusion chromatography)
* Nguyên lý: Sự tách ở đây dựa theo kích thước của phân tử
của các chất mẫu được phân bố khác nhau vào trong các lỗ
xốp của pha tĩnh. Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ chui vào
bên trong lỗ xốp của hạt pha tĩnh nên được rửa giải ra sau.
Các phân tử có kích thước lớn nằm ở ngoai nên được rửa giải
ra trước
* Ứng dụng: Tách các mẫu có khối lượng phân tử lớn:
polyme, protmaauxo enzyme, xenlulo,...

* Nguyên lý: Sự tách loại săc ký này tuân theo các quy luật
phân bố của chất tan giữa 2 pha không trộn lẫn là pha
động và lớp màng pha tĩnh
* Ứng dụng: Sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều
nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không
phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion
có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000)
4.4. Sắc ký phân bố

4.4.1. Chọn pha tĩnh và pha động:
 Với pha tĩnh: Dựa vào nhóm thế R của dẫn chất siloxan
 Với pha động: Dựa vào độ phân cực, độ nhớt, giới hạn đo,…
 Với chất phân tích: Dựa vào nhóm chức
Hydrocacbon mạch thẳng < olefin < hydrocacbon thơm < dẫn chất
halogen < sunfid < ete < dẫn chất nitro < este ≈ andehyd ≈ xeton < ancol
≈ amin < sunfo < sunfoxid < axit cacboxylic < nước
* Nguyên tắc lựa chọn:
1. Độ phân cực của chất phân tích hợp với độ phân cực của pha tĩnh và
khác xa độ phân cực của pha động
2. Độ phân cực của chất phân tích hợp với độ phân cực của pha động và
khác nhiều với độ phân cực của pha tĩnh

Pha tĩnh
Mặc dầu có nhiều lý thuyết nghiên
cứu về việc sử dụng pha đảo
nhưng phần lớn các chương trình
HPLC pha đảo đều thu được từ
phương pháp thử và sai (by trial
and error).

* SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối
giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT và sắc ký pha
đảo – SKPĐ
* Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động.
Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. SKPT
dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với
phân tử lượng không lớn lắm.
* SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít
phân cực hơn pha động. Phương pháp này dùng phân tích các hợp
chất từ không phân cực đến phân cực..
4.4.2. Phân loại

4.4.3. Sắc ký pha đảo
a, Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
* Nhiệm vụ: Tách sắc ký một hỗn hợp chất phân tích
* Yêu cầu:
+ Phải trơ và bền dưới tác dụng của các điều kiện môi trường sắc ký, không
có các phản ứng hóa học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích,
đảm bảo cơ chế tách theo đúng bản chất của pha tĩnh và không làm mất chất
phân tích cần tách
+ Có tính chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký nhất
định của hệ pha HPLC
+ Tính chất bề mặt phải ổn định, độ xốp không bị biến dạng trong quá trình
sắc ký, không bị phân rã dưới áp suất cao của quá trình sắc ký
+ Cân bằng động học của sự tách sắc ký phải xẩy ra nhanh, thuận nghich và
lặp lại tốt
+ Cỡ hạt tương đối đồng nhất để cột tách có hiệu lực tách cao

Pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn
silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
 Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ
vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography).
 Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết
(bonded phase chromatography)
Sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng
* Phân loại

 Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động
nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây
nhiễm đối với hợp chất phân tích.
 Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên
người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient
dung môi
Sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng

* Thành phần cấu tạo
Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo HPLC chính là chất nhồi cột, nó là những
chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, diện tích bề mặt riêng lớn
 Bề mặt các hạt silica – SiO2 (các hạt
này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm)
được xử lý (thủy phân) bằng cách đun
nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai
ngày để tạo ra những nhóm SiOH như
sau (thông thường chỉ có khoảng 8
µmol SiOH/m2 bề mặt)
 Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các
organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung
bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.
Bề mặt silica đã thủy phân

• Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không
phân cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-
octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các
nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl
trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Người ta
nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại
khác nên sử dụng nhiều nhất.
Cấu trúc của cột ODS
Không sử dụng được trong môi
trường quá acid (pH < 2) hoặc
trong môi trường bazơ (pH > 7)

• Dùng các chất như trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc
hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn) để tương tác với
nhóm –OH này. Lúc này ta sẽ có loại cột ít tương tác với
chất phân tích có tính bazơ (cột LC-DB của hãng
SUPELCO).
Cấu trúc cột LC-DB

• Thế bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để
những nhóm này sẽ che đi những nhóm –OH, cản trở
tương tác của nhóm –OH với chất cần phân tích.
Cấu trúc cột có gốc isopropyl

 Người ta còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực
để tăng thêm độ phân cực của dây C18, làm cột có khả
năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân
cực mạnh (cột EPS – Expended Polar Selectivity).
 Ngoài sườn silica, thời gian gần đây người ta có sử
dụng đến nền nhựa polystyren (Polystyren Reversed
Phase – PRP) cho phép phân tích trong môi trường pH
từ 1 – 13. Cột này dễ sử dụng trong môi trường acid và
bazơ mạnh.

* Cơ chế: Khi tiến hành chạy sắc ký trên bề mặt pha tĩnh xảy ra các cân
bằng động như sau:
Sr + Xi ↔ SrXi ( Quá trình hấp phụ )
SrXi + M ↔ MXi + Sr ( Quá trình giải hấp )
Trong đó: Sr là pha tĩnh
Xi là chất phân tích
SrXi chất phân tích hấp phụ trên pha tĩnh
M là pha động
MXi chất phân tích trong pha động.

b, Pha động trong RP- HPLC
* Nhiệm vụ: Là dung môi dung để rửa giải các chất tan (chất phân tích)
ra khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký
* Yêu cầu:
Hòa tan mẫu phân tích
Phải trơ với pha tĩnh
Phải bền vững theo thời gian
Có độ tinh khiết cao
Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký
Phù hợp với loại detecter để phát hiện chất phân tích
Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao
Có tính chất kinh tế, không quá đắt, quá hiếm

• * Thành phần: Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ
phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều
dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH),
acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất
• Thông thường pha động kết hợp một hỗn hợp nước hoặc dung dịch
đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong
nước. Nước là một dung môi rất phân cực nên nó không tương tác
với những nhóm alkyl không phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được
coi như pha động yếu nhất và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất
cả các dung môi động của SKPĐ.
Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng

4.4.4. Sắc ký pha thuận NP-HPLC:
Thành phần pha tĩnh và pha động ngược lại với RP-HPLC
 Pha tĩnh: Là các chất phân cực như triethylen, glycol,
nước..
 Pha động: Dung môi ít phân cực như hexan, iso propyl
ether
 Ứng dụng: Phân tích dược phẩm, y học, môi trường,….

71
Tối ưu hóa qt sắc ký

5.Tối ưu hóa quá trình sắc ký lỏng cao áp
Mục đích của quá trình tối ưu hóa là có được sự tách hoàn toàn các
chất cần phân tích trong thời gian ngắn nhất khi đi qua cột

5.1.Tính cân đối của píc sắc ký
+ Sắc ký đồ rửa giải của một pic có dạng giống với biểu đồ phân bố Gauss
+ Phương trình Gauss có đồ thị là một đường cong đối xứng, đồ thị đi qua 2 điểm
uốn tại x = +1 và x = -1 ( chiều cao pic tương ứng tại điểm uốn là 60%). Độ rộng tại
điểm uốn là 2s.
+ Trong sắc ký đồ w1/2 là ký hiệu cho độ rộng tại ½ chiều cao pic (w = 2,35s). Độ
rộng của pic tính tại nền và được đo ở chiều cao đạt được là 13,5% so với chiều cao
cực đại là w = 4s

Pic thực tế thu được từ sắc đồ thường sai lệch với pic trong trường hợp
lý tưởng của phân bố Gauss do nhiều lý do như sai lệch về nồng độ giữa
các lần tiêm, tốc độ dòng pha động không đều tại các vị trí trong cột

+ Đĩa lý thuyết của Craig được coi là thuyết giải thích quá trinh di
chuyển và phân tách các cấu tử chất tan trong cột là hợp lý nhất
Trong sắc ký lỏng – rắn các tiến trình cơ bản này là tuần hoàn của
sự hấp phụ và giải hấp phụ. Các bước này tái lập lại tuần hoàn theo
sự di chuyển của các cấu tử trong cột
+ Mỗi bước tương ứng với một trạng thái cân bằng mới gọi là đĩa
lý thuyết
+ Các đĩa xếp dọc theo chiều dài của cột. Mỗi một chất khi di
chuyển trong cột sẽ có số lần tái tổ hợp khác nhau (hấp phụ / giải
hấp phụ) nên số đĩa khác nhau
+ Nếu gọi chiều cao tương ứng của một đĩa lý thuyết là H ta có: H
= L/N
5.2 Đĩa lý thuyết

+ Nếu tính lượng chất trên đĩa thứ J tại thời điểm I ta có: Tổng
lượng chât tan mT là tổng số lượng chất tan được pha động di
chuyển tới từ đĩa thứ (j -1) nằm cân bằng tại thời điểm (i-1) và
lượng chất tan thực sự có sẵn ở đĩa thứ j tại thời điểm (i-1) có
Hạn chế của đĩa lý thuyết: Không giải thích được hiện tượng giãn
rộng pic do không tính đến phân tán trong cột do sự khuyêch tán của
các hợp chất

5.2. Phương trình Vandemter
Phương trình mô tả sự ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động đến
hiệu quả tách.
Cu
u
B
A
H 


Trong đó: A là hệ số khuyêch tán xoáy
B là hệ số khuyếch tán dọc theo cột
C là hệ số truyền khối
Nếu H có đơn vị là cm thì A là cm, B là cm2/s ; C là s

Hiệu quả cột cao nhất khi H nhỏ nhất tương ứng tốc đọ tối ưu
C
B
u 

5.4. Các phương pháp nâng cao độ phân giải trong HPLC
 Tăng chiều dài của cột (Increase column length)
 Giảm đường kính của cột (Decrease column diameter)
 Giảm lưu lượng pha động (Decrease flow-rate)
 Pha tĩnh (vật liệu nhồi cột) đồng nhất (Uniform stationary phase (packing))
 Giảm thể tích bơm mẫu (Decrease sample size)
 Lựa chọn pha tĩnh sạch hơn (Select proper stationary phase)
 Lựa chon pha động tinh khiết hơn (Select proper mobile phase)
 Sử dụng áp suất ổn định hơn (Use proper pressure)
 Thành phần của pha động thay đổi hợp lý (Use gradient elution)

81
Ứng dụng của HPLC

Loại hợp chất không bền nhiệt
 Dược phẩm : aspirin, ibuprofen, acetaminophen (Tylenol)….
 Muối: sodium chloride, potassium phosphate….
 Proteins: Lòng trắng trứng, protein, enzym….
 Hợp chất hữu cơ: polymers (e.g. polystyrene, polyethylene)
 Hydrocarbon nặng: Dầu mỏ
 Sản phẩm tự nhiên: Sâm, thuốc chiết xuất từ cây cỏ,…
 Ngoài ra có thể xác định với các hợp chất bền nhiệt, tuy nhiên dùng
GC thích hợp hơn
6.1. HPLC sử dụng làm gì ?
Tách và phân tích chủ yếu các hợp chất khó bay hơi hoặc không bền nhiệt

83
Phạm vi ứng dụng
Hóa học
Môi trường
Dược phẩm
Sản phẩm tiêu dùng
Sinh hóa
polystyrenes
dyes
phthalates
tetracyclines
corticosteroids
antidepressants
barbiturates
amino acids
vitamins
homocysteine
Sinh học
proteins
peptides
nucleotides
lipids
antioxidants
sugars
polyaromatic hydrocarbons
Inorganic ions
herbicides
Hình sự

Vì sao HPLC được chọn trong phân tích dược liệu....
 Sắc ký lỏng cao áp có rất nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất
tự nhiên nói chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng.
 Ưu điểm lớn nhất của sắc ký lỏng cao áp là có thể phân tích được rất
nhiều loại hợp chất khác nhau, khả năng phân tích của nó rộng GC.
 Có thể dùng sắc ký lỏng cao áp để phân tích các chất từ chất phân cực tới
không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay hơi, từ các
chất trung tính tới các chất điện ly.
 Tính linh hoạt của sắc ký lỏng cao áp cũng cao hơn các phương pháp
khác nhờ các cơ chế tách, pha tĩnh và pha động đa dạng, phong phú.
 Với hiệu năng tách cao, khả năng phân tích rộng như vậy, sắc ký lỏng cao
áp hiện vẫn là lựa chọn ưu tiên trong phân tích hay điều chế các chất.

Dược động học
•Thiết bị HPLC và HPLC/MS là một trong những công cụ hỗ trợ rất lớn cho
nghiên cứu thực nghiệm (trên động vật như: chuột, thỏ) về mặt đánh giá
một số thông số dược động học.
•LC-MS được ứng dụng rất nhiều trong nghiên cứu về dược phẩm. Những
nghiên cứu trên HPLC cung cấp một cách nhanh chóng các thông tin về lưu
lượng, chu kỳ phân hủy của một loại thuốc ở trong máu, gan hay các bộ
phận của cơ thể
•Xác định được các sản phẩm chuyển hóa trung gian, biến tính của dược
phẩm trong cơ thể: sàng lọc thuốc, kiểm tra sự ổn định, nhận dạng các chất
chuyển hóa, xác định tạp chất, định lượng và kiểm soát chất lượng.

 Định lượng riêng lẻ các chất trong hỗn hợp phức tạp của dịch chiết dược liệu
Có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm
chí ppt.
 Phân tích điểm chỉ xác định nguồn gốc xuất xứ của dược liệu, phân biệt
dược liệu với các loài tương cận, xác định các nguyên liệu khác pha trộn vào
dược liệu, xác định các sản phẩm dược liệu nhái, giả mạo nhãn hiệu…
 Xác định và phân tích tính chất của các loại thuốc được sản xuất bởi các hợp
chất hóa học hay được chiết xuất từ sản phẩm thiên nhiên. Kiểm tra chất
lượng hợp chất trong thuốc suốt quá trình sản xuất.
 Nhiều nhà nghiên cứu hiện nay sử dụng các thiết bị ghép nối LC-MS-NMR
để phân tích thành phần các dịch chiết và xác định cấu trúc các chất trong
hỗn hợp mà không cần tách riêng các chất.
Dược phẩm

6.2. Phương pháp định tính

Phương pháp định lượng
Định lượng
Đường Chuẩn
Thêm Chuẩn
Phương pháp
cơ bản
Chuẩn hóa
diện tích

• Sắc ký lỏng với detecter khối phổ
Carbofuran
Propoxur
Carbaryl
Fenobucarb
Sắc đồ chuẩn hỗn hợp carbamat 500ng/g
(Điều kiện chạy: Cột C18, Pha động:acid focmic 0,1% : MeOH (chạy gradien), Tốc độ dòng 0,5ml/phút, Detector MS)
Carbofuran #954 RT: 13.85 AV: 1 NL: 4.38E5
F: + c ESI Full ms2 222.00@48.00 [ 60.00-230.00]
60 80 100 120 140 160 180 200 220
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relative
Abundance
Phổ khối ion con của Carbofuran
164.90
191.31
70.69 226.40
161.09
149.33
123.21 133.29 200.32
98.52 210.77
113.06 182.94
84.38
RT: 0.00 - 18.04
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Time (min)
0
50
100
0
50
100
0
50
100
Relative
Abundance
0
50
100
RT: 8.87
MA: 38708909
9.57 10.97
6.68 11.85
7.29 13.43
6.15 17.72
16.67
2.82 4.23
1.07
RT: 8.88
MA: 3668940
13.35
3.01 9.23 12.03
7.92 16.77
0.73 16.15
7.13
2.31 4.41 5.02
RT: 9.86
MA: 3127832
16.95
13.97
12.75 16.25
5.04 10.82
9.15
1.88 7.93
4.25
0.83 3.02 7.40
RT: 10.93
AA: 1923068
NL: 2.60E6
TIC F: + c ESI SRM ms2
222.00@48.00 [
164.50-165.50] MS mix
500ppb
NL: 2.57E5
210.00@45.00 [
152.50-153.50,
167.50-168.50] MS mix
500ppb
NL: 2.15E5
202.00@45.00 [
144.50-145.50] MS mix
500ppb
NL: 1.36E5
208.00@37.00 [
151.50-152.50] MS ICIS mix
500ppb
Carbamat Ion mẹ
Năng lượng
bắn phá
Ion con
Carbofuran 222 48 165

Phương pháp đường chuẩn
Đường chuẩn Fenobucarb
y = 3990x - 5018.5
R2
= 0.9994
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
0 500 1000 1500
Nồng độ (ppb)
Diện
tích
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
0 500 1000 1500 2000
Nồng độ (ppb)
Diện
tích
Nồng độ (ppb) 20 50 100 200 500 1000 1500
Diện tích (mAu) 1818155 4323952 8848970 17287122 38708909 75531554 95077738

Phương pháp thêm chuẩn
-3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
Y = A + B * X
Thong so Gia tri Sai so
-----------------------------------------------------------
A 201954,33333 2310,60358
B 94320 1789,78583
-----------------------------------------------------------
S
(mAu.s)
CPEN
(mg/l)
Tên hoạt
chất
C Diện tích S
(mAu.s)
Cx Cs C2 C3
PEN G
0 200921 2,14
1 298341 3,18
2 389561 4,15
3 478932 5,17

6.3. Sự phát triển từ HPLC lên UPLC
UPLC
HPLC

Lựa chọn phương pháp sắc ký

102
Lựa chọn kỹ thuật
Loại chất Kỹ thuật Pha tĩnh Pha động
Neutrals
Weak Acids
Weak Bases
Reversed
Phase
C18, C8, C4
cyano, amino
Water/Organic
Modifiers
Ionics, Bases, Acids Ion
Pair
C-18, C-8 Water/Organic
Ion-Pair Reagent
Compounds not
soluble in water
Normal
Phase
Silica, Amino,
Cyano, Diol
Organics
Ionics Inorganic Ions Ion
Exchange
Anion or Cation
Exchange
Resin
Aqueous/Buffer
Counter Ion
High Molecular Weight
Compounds
Polymers
Size
Exclusion
Polystyrene
Silica
Gel Filtration-
Aqueous
Gel Permeation-
Organic

6.2. Ứng dụng trong phân tích dược liệu
 Sắc ký lỏng cao áp có rất nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất
tự nhiên nói chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng.
 Ưu điểm lớn nhất của sắc ký lỏng cao áp là có thể phân tích được rất
nhiều loại hợp chất khác nhau, khả năng phân tích của nó rộng GC.
 Có thể dùng sắc ký lỏng cao áp để phân tích các chất từ chất phân cực tới
không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay hơi, từ các
chất trung tính tới các chất điện ly.
 Tính linh hoạt của sắc ký lỏng cao áp cũng cao hơn các phương pháp
khác nhờ các cơ chế tách, pha tĩnh và pha động đa dạng, phong phú.
 Với hiệu năng tách cao, khả năng phân tích rộng như vậy, sắc ký lỏng cao
áp hiện vẫn là lựa chọn ưu tiên trong phân tích hay điều chế các chất.

 Sắc ký lỏng cao áp thường được sử dụng nhất trong định lượng
riêng lẻ các chất trong hỗn hợp phức tạp của dịch chiết dược liệu khi
so sánh diện tích đỉnh với chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích.
Có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb,
thậm chí ppt.
 Sắc ký lỏng cao áp hiện nay cũng đang được quan tâm trong phân
tích điểm chỉ các chất trong hỗn hợp. Với sắc ký điểm chỉ, người ta
có thể xác định nguốn gốc xuất xứ của dược liệu, phân biệt dược liệu
với các loài tương cận, xác định các nguyên liệu khác pha trộn vào
dược liệu, xác định các sản phẩm dược liệu nhái, giả mạo nhãn
hiệu…
 Nhiều nhà nghiên cứu hiện nay sử dụng các thiết bị ghép nối LC-MS-
NMR-CD để phân tích thành phần các dịch chiết và xác định cấu trúc
các chất trong hỗn hợp mà không cần tách riêng các chất.

Phân lập các chất tinh khiết (HPLC điều chế). Về nguyên tắc, sắc ký
lỏng cao áp điều chế chia sẻ mọi nguyên lý của HPLC phân tích.
Điểm khác biệt duy nhất là hệ thống sử dụng cột sắc ký lớn hơn, với
lượng pha tĩnh nhiều hơn để có thể phân tích được nhiều mẫu hơn
và các chất tách ra khỏi cột được thu lại để có được các chất tinh
khiết. Theo truyền thống, các cột có đường kính trong lớn hơn
4,7mm có thể được xem là cột bán điều chế. Các cột chế điều chế
quy mô phòng thí nghiệm có kích thước thay đổi từ 1 – 10 cm. Trong
quy mô công nghiệp, các cột sắc ký lỏng cao áp điều chế có thể có
đường kính trong tới 100 cm. So với sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng
cao áp có chi phí cao hơn nên thường chỉ sử dụng trong các trường
hợp không tác được bằng các phương pháp sắc ký cột thông
thường hay MPLC

Triển khai sắc ký
? Xây dựng quy trình phân tích một chất hoặc một nhóm
chức bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp

Chọn detecter thích hợp
4
Xác định mục tiêu phân tích
1
Chọn kỹ thuật xử lý mẫu
2
Chọn cột tách phù hợp
3
Chọn điều kiện sắc ký
5
Quy trình phân tích
Đánh giá phương pháp phân tích
6

Nghiền mịn, cân 20mg
Lắc, siêu âm 15’ , lọc qua cartrig 0,45m
20mg thuốc + metanol
Dung dịch 20mg/20ml
QUY TRÌNH
PHÂN TÍCH
MẪU DƯỢC
PHẨM

BƠM MỘT PITTONG
 Có 1 pitong bằng lam ngọc, đường kính 3-4mm, dài khoảng 4cm, di chuyển
trong xi lanh thép không gỉ, dung tích thay đổi tùy theo đường kính cột
 Lưu lượng dòng 0,02-2,00ml/phút hoặc 0,20-10,0ml/phút ở áp suất 6000psi
 Nhược điểm: Trong dòng chảy xuất hiện xung

BƠM ĐẦY NHANH
 Bơm có 2 xi lanh dùng chung 1 pitong
 Hoạt động: Khi Khi dung môi pha động đang vào cột, pittong đang di chuyển về trái,
pha động đang được bơm vào cột, cùng lúc đó pha động từ hệ cấp đi vào buồng bên phải
 Khi pittong di chuyển trở lại về bên phải, lượng pha động buồng phải được đẩy về
buồng trái với tốc độ lớn hơn 100 lần so với tốc độ pha động đi vào cột
 Ưu điểm: Giảm xung ở chu kỳ làm đầy buồng bên trái

Đây là hệ thống kết nối 2 bơm 1 pittông. Hai bơm nối đầu với nhau, đường pha
động vào và đường đến cột chung nhau. Khi pitong của bơm bên trái tiến lên đẩy
pha động vào cột, đồng thời pittong của bơm bên phải hút pha động từ hệ cấp
vào đầy bơm.
Sau đó, khi pittong bơm bên phải tiến lên đẩy pha động vào cột, đồng thời kéo
pittong bơm bên trái lùi lại lấy pha động vào. Quá trình đẩy kéo diễn ra liên tục.
BƠM ĐẨY KÉO

[123doc] - bai-giang-sac-ky-long-hieu-nang-cao-hplc.ppt

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to [123doc] - bai-giang-sac-ky-long-hieu-nang-cao-hplc.ppt

Similar to [123doc] - bai-giang-sac-ky-long-hieu-nang-cao-hplc.ppt (20)

[123doc] - bai-giang-sac-ky-long-hieu-nang-cao-hplc.ppt