Salmonella

1.  Làm sao để các sản phẩm thực phẩm phải
thực sự an toàn, đảm bảo vệ sinh an toàn thực
phẩm ?
 Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học đã
ứng dụng kĩ thuật PCR (Polymerase Chain
Reaction) để xác định salmonella trong thực
phẩm và cho kết quả trong 24 giờ.

2. 1.1. Lịch sử phát hiện
 Năm 1889, nhóm nghiên cứu dưới quyền bác sĩ thú y Daniel Elmer
Salmon tìm thấy vi khuẩn gây ra bệnh "dịch tả cho heo" và tên vi khuẩn được
đặt theo tên của ông.
- Trong lịch sử đã có rất nhiều cái chết mà nguyên nhân được tin rằng là do
Salmonella gây ra:
+ Năm 2001, một nhóm các giáo sư trường đại học Maryland, trên cơ sở mô tả
của nhà sử học người Hilạp Nicomedia, họ đã kết luận rằng, nguyên nhân
chính cái chết kỳ bí của vua Alexander năm 323 trước công nguyên là do
nhiễm độc Salmonella.
+ Hoàng tử Albert, chồng của công chúa Victorya chết vào năm 1861 bởi
salmonella. Cũng trong thời gian đó, tại Anh xảy ra 50000 ca ngộ độ mỗi năm.
+ Trong chiến tranh Anh – Tây Ban Nha vào năm 1898 đã có 20738 lính Anh bị
ngộ độc salmonella và đã có 1590 người chết.

3. Nước (năm) Tác nhân Số ca
Tây Ban Nha (1976) Salát trứng 702
Canada (1984) Pho mát 2,700
USA (1985) Sữa tươi 16,284
Nhật (1988) Trứng 10,476
Pháp (1993) Mayonnaise 751
Scandinavie (1995) Salát 492
Một số thống kê nhiễm salmonella

4.  Nguồn truyền nhiễm chủ yếu là súc vật như bò, lợn bị bệnh phó thương hàn, gà ỉa
phân trắng... Bệnh viêm ruột phó thương hàn ở trâu, bò thường do Salmonella
typhimurium và Salmonella-enteritidis. Chim câu, chuột nhắt, chuột cống cũng là
nguồn truyền nhiễm.
 Nguồn nguy hiểm thứ hai là súc vật khỏe về lâm sàng nhưng có mang và đào thải vi
khuẩn ra ngoài theo phân, đôi khi theo nước tiểu. Với người bệnh sau khi khỏi còn
tiếp tục đào thải vi khuẩn sau vài chục ngày nữa có khi kéo dài tới 10-12 tháng.
Nguồn đào thải vi khuẩn nguy hiểm là gà, vịt, ngan, ngỗng

Thức ăn gây ngộ độc thường là thức ăn có nguồn gốc động vật như thịt gia súc gia
cầm. Thịt là nguyên nhân gây ngộ độc chiếm 68% ở Anh và 88% ở Pháp, ngoài ra có
thể ngộ độc do ăn trứng, cá, sữa... nhưng tỉ lệ ít hơn nhiều.

5.  Thời kỳ ủ bệnh thường từ 12-24 giờ, có khi ngắn hơn hoặc kéo dài sau vài
ngày. Các dấu hiệu đầu tiên là: bệnh nhân thấy buồn nôn, nhức đầu,
choáng váng, khó chịu, thân nhiệt tăng lên ít (37-38ºC) sau đó xuất hiện
nôn mửa, đi tiêu ngoài nhiều lần, phân toàn nước, đôi khi có máu, đó là
triệu chứng của viêm dạ dày ruột cấp tính. Ða số bệnh nhân trở lại bình
thường sau 1 đến 2 ngày không để lại di chứng.
 Ngoài các triệu chứng trên, cá biệt có bệnh nhân lại biểu hiện như một
bệnh thương hàn, cảm cúm, nghĩa là sốt rất cao 39-40ºC, mệt mỏi toàn
thân, đau ở vùng thắt lưng và cơ bắp. Các triệu chứng rối loạn tiêu hóa
biểu hiện rất nhẹ hoặc không có vì vậy chẩn đoán dễ nhầm lẫn.

6. Về phân loại khoa học salmonella được xếp vào:
 Giới: Bacteria
 Nghành: Proteobacteria
 Lớp: Gramma Proteobacteria
 Bộ: Enterobacteriaceae
 Giống: Salmonella Lignieres 1900
 các chủng salmonella mới phát hiện được đặt tên theo nơi mà nó
được phân lập như S.teheran, S.congo, S.london.
 Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, chủ yếu là kháng nguyên thân O và
kháng nguyên lông H, salmonella được chia thành các nhóm và các type
huyết thanh. Hiện nay được xác định gồm trên 2500 type huyết thanh
samonella.

7. Hệ thống phân loại

9. thuộc họ
Enterobacteriaceae
(vi khuẩn đường ruột)
đường kính:0,7 µm-1,5 µm,
Dài : 2 µm - 5 µm
có vành lông rung hình roi
di động bằng tiên mao,
sinh sống trong
đường ruột
kị khí tùy nghi
không tạo bào tử
là một giống vi khuẩn hình
que, trực khuẩn gram âm
Hình ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử quét cho thấy vi khuẩn
Salmonella (nhuộm màu đỏ) xâm nhập vào tế bào của con người
Salmonella không lên men
lactose (trừ Salmonella
arizona) và sucrose nhưng
lên men được dulcitol,
mannitol và glucose
Chúng kém chịu nhiệt
nhưng chịu được một số
hóa chất: brilliant green,
sodium lauryl sulfate,
selenite,.

10.  Salmonella xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng và hầu hết là do ăn phải thức ăn
bị nhiễm như thực phẩm, sữa, nước uống…. Sau khi xuyên qua hàng rào acid dạ
dày, vi khuẩn di động về phía ruột non và sinh sản ở đó, tiếp tục chui qua màng nhày
và vào thành ruột.
 Khả năng gây ngộ độc thức ăn của Salmonella cần có hai điều kiện:
 Thức ăn phải bị nhiễm một lượng lớn vi khuẩn vì khả năng gây ngộ độc của
Salmonella yếu.
 Vi khuẩn vào cơ thể phải phóng ra một lượng độc tố lớn. Vấn đề này phụ thuộc
nhiều vào phản ứng cơ thể của từng người.
Salmonella theo thức ăn vào đường tiêu hóa và phát triển. Một số khác đi vào hệ bạch
huyết và tuần hoàn gây nhiễm trùng huyết. Vì Salmonella là VK ưa môi trường ruột nên
lại nhanh chóng trở về ruột gây viêm ruột

11. Người ta xác định các chủng qua các loại kháng nguyên mà chủng đó sinh ra:
 Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân – KNO hay kháng nguyên thân O ):
có bản chất là lipopolysaccharide, rất bền nhiệt
 Kháng nguyên lông H :
Kháng nguyên tiên mao, nhạy cảm với nhiệt
 Kháng nguyên vỏ K. ( kháng nguyên Vi) :
Kháng nguyên màng, và chỉ tìm thấy ở một số loài là S.typhi, S.paratyphi, S.dublin.
+ Kháng nguyên Vi là kháng nguyên vỏ bao bọc bên ngoài kháng nguyên O,
+ Kháng nguyên Vi không tham gia vào quá trình gây bệnh.
+ Vi khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên V (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp
cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu.

12.  Phòng ngừa:
 Bảo đảm thời hạn cất giữ thức ăn đã chế biến và các nguyên liệu.
 Sử dụng ướp lạnh khi bảo quản thức ăn và nguyên liệu.
 Ðun sôi thức ăn trước khi ăn là biện pháp phòng bệnh tích cực và có hiệu quả.
 Ðiều trị:
 Không có thuốc điều trị đặc hiệu và phải nhanh chóng tìm mọi cách để đưa thức ăn
bị nhiễm trùng ra khỏi cơ thể bệnh nhân như rửa dạ dày, gây nôn... Nếu bệnh nhân
bị mất nước nhiều thì phải truyền nước và điện giải, đồng thời cho thuốc trợ tim khi
cần thiết. Người bệnh phải được ủ ấm và yên tĩnh, ăn uống theo chế độ ăn kiêng
đặc biệt (theo hướng dẫn của thầy thuốc) trong 3-5 ngày cho đến khi bệnh nhân trở
lại bình thường

13.  PCR- Polymerase Chain Reaction là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase.
 -Nguyên lý của kỹ thuật PCR
 Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ
bản của sao chép DNA trong cơ thể nhưng có sự khác biệt:
 + Kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới
trong môi trường thích hợp.
 + Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế
chuyên biệt, chủ động.
 Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn
DNA riêng biệt.

14. Giai đoạn biến
tính
Gai đoạn kéo
dài
Giai đoạn lai
- Trong giai đoạn này
phân tử DNA mẫu bị biến
tính ở nhiệt độ cao
(thường từ 94-95℃, lớn
hơn nhiệt độ nóng chảy
của phân tử)
- Trong vòng 30 giây - 1
phút,
- Tất cả liên kết hidro
giữa hai mạch của
phân tử bị bẻ gãy và
tạo thành các DNA
sợi đơn
- Nhiệt độ được hạ
thấp (thường 40-
70℃, thấp hơn nhiệt
độ nóng chảy của mồi
được sử dụng
khoảng từ 3-5℃)
- từ 30 giây đến 1
phút.
- cho phép các mồi
bám vào các phân tử
DNA sợi đơn, đánh
dấu phần DNA cần
được khuyếch đại.
- Nhiệt độ được tăng lên 72℃
giúp cho DNA polymerase xúc
tác tổng hợp DNA tốt nhất
- Thời gian của giai đoạn này
phụ thuộc vào kích thước của
DNA mẫu, thường kéo dài từ
- 30 giây đến 1 phút.
- Công việc của DNA
polymerase là di chuyển dọc
theo DNA sợi đơn và sử dụng nó
làm khuôn để tổng hợp sợi DNA
mới bổ sung vói DNA mẫu bằng
cách kéo dài các phần đã được
đánh dấu bởi các mồi.
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau.
- Chu kỳ phản ứng PCR: gồm 3 giai đoạn

15. 1. Mồi
(Primer)
- Là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến
phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA. Chúng bắt cập bổ sung với
một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản.
- Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi (forward
primer) và một mồi ngược
(reserse primer).
2. DNA bản
mẫu (DNA
template):
- Hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch, không chứa các
chất ức chế phản ứng (SDS), chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc
tố, heparin…).
- PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ tế bào hay
những mẫu DNA không được bảo quản tốt.
3. Nồng độ
MgCl₂
- Cần cho hoạt động của taq polymerase, hàm lượng quá cao sẽ tạo
nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì giảm hiệu quả nhân bản của
enzyme, nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua
nhiều lần thử nhiệm.
4. dNTP
(deoxy
nucleoside
triphosphate
- thành phần bốn loại dNTP phải cân bằng, sự mất cân bằng làm tăng
các lỗi sao chép của polymerase. Hàm lượng thường không đổi nhưng
có thể thay đổi tùy điều kiện thực tế.
5. Enzyme
polymerase
chịu nhiệt
- enzyme xúc tác cho quá trình lắp rắp các nucleotide A,T,G,C
vào mạch DNA mới tổng hợp, phải là men polymerase chịu được
nhiệt độ cao

16.  1.1 Thiết bị, dụng cụ
 1.2 Hóa chất, môi trường
 1.2.1 Mồi
 - Gồm 2 mồi invA1 và invA2 được thiết lập cách nhau 520bp trong gen invA có vai trò trong quá
trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật và người. trình tự của 2 mồi như sau:
 + invA1: 5` - TTGTTACGGCTATTTTGACCA-3`
 + invA2 : 5` - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG-3`
 Nồng độ mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 6pM trong đệm TE. Đệm TE có
thành phần: 10mM Tris- HCI, 1mM EDTA

17. - Tủ ấm 37 độ C Hộp đèn soi UV có
kính lọc 302mm
Máy luân nhiệt Bộ chụp ảnh trên đèn
UV
Máy li tâm dùng cho
ống
eppendorf 1,5 ml
Ống Eppendorf
0,2 / 0,5/ 1,5 ml
chuyên dùng cho PCR
- Thiết bị điện di ngang
và bộ nguồn điện di có
thế hoạt động từ 80
đến 150 V

18. Bước 1: Tiềm
tăng sinh
Bước 4: điện di
đọc kết quả
Bước 2: Ly
trích DNA
Bước 3: chạy
PCR

19.  - Thu thập các mẫu thủy sản tại những
nơi khác nhau như siêu thị, chợ,..
 - Mẫu thu thập được lưu trữ vào túi nylon
hay khay nhựa đã tiệt trùng để tránh sự
lẫn nhiễm
 - Vì sự phân bố của Salmonella trong
thực phẩm không đều nên ta phải chia ra
làm 2 hay nhiều mẫu nhỏ( để phát hiện
chính xác)
 VD 25g mẫu+225ml buffered peptone
water(BPW) trong tủ hấp, lắc đều, qua
đêm
 ủ 24h ở 37 độ
0
37 C

20.  Giúp gia tăng số lượng vi khuẩn trong mẫu
 Giúp pha loãng các chất ức chế PCR
 Kéo dài 18h- 24h
 Sử dụng môi trường chọn lọc/không chọn lọc
 Điều kiện nuôi cấy thuận lợi cho VSV mục tiêu

23.  Sử dụng nhiệt ( boiling)
 Sử dụng bột silica (silica-membrane spin column)

26.  Bước 1: chọn sinh khối
 Bước 2: ly giải
 Bước 3: gắn
 Bước 4: rửa
 Bước 5: ủ
 Bước 6: thu mẫu đặt vào PCR

27. Các muối chaotropic rất quan trọng đối với bước ly giải và bước gắn
acid nucleic lên màng silica. ADN được gắn lên màng ở lực ion cao và
sau đó rửa giải (elute) ở lực ion thấp.
Gắn ADN lên màng trong sự có mặt của muối chaotropic

28.  Bước 1: rút dung dịch
 Bước 2: ly tâm
 Bước 3: huyền phù vi khuẩn
 Bước 4: ly tâm
 Bước 5: gia nhiệt
 Bước 6: phóng thích DNA
 Bước 7: hút DNA tinh khiết cho
phản ứng PCR

33.  Kỹ thuật điện di
 Xuất hiện vạch trắng đây là
điểm tương ứng với kích
thước của vi khuẩn → dương
tính với vi khuẩn
 Ngược lại nếu không có gì thì
kết quả là âm tính

40. -Năm 1997,Chen và cộng tác viên đã ứng dụng thành công kỹ thuật PCR để phát
hiện salmonella trong một số thịt sống tại các siêu thị mà ông và đồng nghiệp thu
thaajptrong quá trình làm thí nghiệm. Trong thí nghiệm này,
PCR có thể phát hiện trong sữa ở mật độ 2 cfu/25ml sữa; 1.5 cfu/25g thịt bò và 3
cfu/25g thịt lợn
-Năm 2001, Luciana Ruschel Dosantos và những cộng sự đã ứng dụng
PCR vào phát hiện salmonella trong thịt gà sống bị ô nhiễm
-Ngoài ra kỹ thuật PCR còn được ứng dụng rất đa dạng và có nhiều công
trình nghiên cứu như: xác định giới tính ở heo bằng kỹ thuật PCR do Nguyễn Thị Thu
Lan, Nguyễn Hoàng Chương, Hồ Huỳnh Thùy Dương, Huỳnh Thị Lệ duyên, Phan kim
ngọc nghiên cứu được công bố trên tạp chí di truyền& ứng dụng,số 4; áp dụng kỹ
thuật PCR sản suất bộ KIT chuẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm, bệnh vàng lá gân
xanh của viện NC&PT Công nghệ sinh học –Đại học Cần Thơ…

41. Cảm
ơn cô
cùng
các
bạn
đã
lắng
nghe