1. Nội dung trình bày
01
02
03
Khái quát chung về thuốc kháng
sinh Penicillin
Khái quát chung về Penicillium
chrysogenum
Sản xuất Penicillin bằng cách sử
dụng Merodiploid chuyển gen
04 Ứng dụng của Penicillin
3. 1. Khái niệm chung về kháng sinh Penicillin
- Thuốc kháng sinh Penicillin là một phân
nhóm nhỏ thuộc nhóm beta-lactam
- Penicillin là một nhóm thuốc kháng khuẩn
có thể tấn công và tiêu diệt nhiều loại vi
khuẩn.
- Nấm Penicillium là nguồn cung cấp cho
penicillin
- Cách thức hoạt động:
gián tiếp rồi hỗ trợ phá vỡ các thành tế
bào của vi khuẩn.
Cấu trúc cơ bản kháng sinh
penicillin
Vòng
Betalactam
4. 4 loại
penicillin
Penicillin phổ
kháng khuẩn
hẹp
Penicillin phổ
kháng khuẩn hẹp
đồng thời có tác
dụng lên tụ cầu
Penicillin phổ
kháng khuẩn
trung bình
Penicillin phổ
kháng khuẩn
rộng đồng thời
có tác dụng lên
trực khuẩn mủ
xanh
1. Khái niệm chung về kháng sinh Penicillin
5. 1 .Khái niệm chung về kháng sinh Penicillin
Công dụng của thuốc kháng
sinh Penicillin
Thuốc kháng sinh Penicillin có tác
dụng ức chế sinh tổng hợp vách tế
bào vi khuẩn, từ đó tiêu diệt chúng
Chúng tác dụng lên hầu hết các vi
khuẩn Gram dương và thường được
chỉ định điều trị trong các trường hợp
viêm nhiễm do liên cầu khuẩn, tụ cầu
khuẩn, thí dụ như viêm màng não,
viêm tai - mũi - họng, …
6. - Công nghệ gen vào sản xuất thuốc kháng sinh:
Nguyên liệu: Sử dụng vi sinh vật.
Công nghệ kỹ thuật di truyền vào sinh tổng hợp kháng
sinh.
Sự phá vỡ gen, do việc chèn DNA vào một trình tự mã
hóa, về mặt kỹ thuật là phương pháp đơn giản nhất để bất
hoạt gen và đã được sử dụng cho một số loại kháng sinh.
1 .Khái niệm chung về kháng sinh Penicillin
8. 2.1 Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P. chrysogenum
- Vào những năm đầu: sử dụng các chủng có hoạt lực
cao thuộc loài P. notatum và P. baculatum
- Từ khoảng sau những năm 50 của thế kỷ XX đến nay
tất cả các công ty sản xuất penicillin trên thế giới đều sử
dụng các biến chủng P.chrysogenum công nghiệp
- Việc tuyển chọn chủng công nghiệp để lên men sản
xuất penicillin đã được áp dụng hiệu quả để thu nhận biến
chủng "siêu tổng hợp" penicillin
P. chrysogenum
9. 2.2 Penicillium chrysogenum
- Penicillium chrysogenum là một loài
nấm trong chi Penicillium, là một phức
hợp loài bao gồm P. notatum, P.
meleagrinum và P. Cyaneofulvum
- Bào tử có màu xanh lam đến xanh
lục, và nấm mốc đôi khi tiết ra sắc tố
màu vàng.
- Tổng hợp benzylpenicillin (penicillin
G) từ cùng một tiền chất axit amin và
phenylacetate.
- Đặc điểm hóa gen Penicillium
chrysogenum mã hóa yếu tố phiên mã
PacC được tổng hợp theo cách không
hoạt động và nó được kích hoạt bằng
quá trình phân giải protein
11. 3.1 Mô tả về sáng chế
Đối tượng của sáng chế
này là một dòng
merodiploid đã bị biến
đổi gen của Penicillium
chrysogenum
- Hoạt động của gen điều hòa kiểm soát quá trình tổng
hợp penicillin đã bị thay đổi.
- Điểm mới: Quá trình sinh tổng hợp penicilin được cải
thiện nhờ thao tác của gen điều hòa
12. 3.2 Các bước tiến hành tạo chủng merodiploid
Bước 1. Lựa chọn chủng P. chrysogenum tiếp nhận và các dấu hiệu biến nạp
Thí nghiệm 1:
Gen sC
enzym ATP-sulphurylase
adenosine 5'-
phosphosulphat
chuyển đổi sulphat
môi trường có sulphat
là nguồn lưu huỳnh
Đột biến sC
không phát
triển
Việc lựa chọn các thể biến nạp trong quỹ sC di truyền dựa trên khả
năng phát triển của chúng trong môi trường có sulphat, giúp phân
biệt chúng với dòng bố mẹ sC.
13. Gen sC chức năng của P. chrysogenum có trong plasmid pINES1 bổ sung cho các đột biến
tương ứng có trong các chủng này, điều này xác nhận rằng chúng đều là đột biến sC.
3.2 Các bước tiến hành tạo chủng merodiploid
Chọn tần số biến đổi cao nhất (45 phép biến đổi trên mỗi g pINES1). Alen sC đột biến từ dòng này
được gọi là sC14.
Chủng này sC14, được sử dụng làm máy thu biến đổi.
Bước 1. Lựa chọn chủng P. chrysogenum tiếp nhận và các dấu hiệu biến nạp
Thí nghiệm 1:
14. Promoter gpdA của A. Nidulans
+gen Saccharomyces cerevisiae
CYC1
trình tự promoter
phiên mã
Gen ble của vi khuẩn kháng
phleomycin
kiểm soát
Chuyển đổi gen chimeric Để lựa chọn các thể biến nạp ở P. Chrysogenum
Vậy qua các thí nghiệm, đã xác định rằng nồng độ phleomycin 1 g / ml là tối ưu, để
lựa chọn các chất biến nạp trong chủng kiểu thuần chủng NRRL1951.
Bước 1. Lựa chọn chủng P. chrysogenum tiếp nhận và các dấu hiệu biến nạp
Thí nghiệm 2:
15. 3.2 Các bước tiến hành tạo chủng merodiploid
Bước 2. Chuẩn bị các plasmid biến nạp, biến nạp và chọn lọc các chủng biến đổi gen
Alen Pc-paCC đột biến(pacC33)
vectơ pPhleo
và pPcsC
plasmid tái tổ hợp
pPacC33 (Phleo) và
pPacC33 ( sC)
Đặc tính của gen Penicillium chrysogenum mã hóa yếu tố phiên mã PacC và các vị trí liên kết của nó
trong promoter pcbAB-pcbC phân kỳ của cụm sinh tổng hợp penicilin.
Các plasmid được nói tới bằng cách biến đổi trong P. chrysogenum NRRL1951 (pPacC33 (Phleo)) hoặc
trong dòng đột biến có nguồn gốc sC14 (pPacC33 (sC) và pPacC (sC)) của nó
16. Để đối chứng:
Xây dựng plasmid pPacC (sC) khác với pPacC33 (sC) ở chỗ nó có alen Pc-pacC + thay vì pacC33
3.2 Các bước tiến hành tạo chủng merodiploid
18. 3.3 Kết quả của sáng chế
• Các dòng merodiploid TX5 , TSC4
và TSC7 sản xuất quá mức penicilin
G, so với dòng NRRL1951 và với
dòng đột biến NRRL1951 sC14
nhận các gen bị thay đổi.
• Việc sản xuất penicillin và tốc độ
tăng trưởng của chủng sC14 và
chủng mẹ NRRL1951 của nó rất
giống nhau, cho thấy rằng đột biến
sC14 không ảnh hưởng đến việc
sản xuất kháng sinh
Sự tăng trưởng và sản xuất penicillin từ các chủng P. chrysogenum NRRL1951 và sC14. Sản
xuất penicillin, pH và trọng lượng khô trong môi trường nuôi cấy NRRL 1951 và sC14 trong môi
trường sản xuất penicillin với 3% saccharose (A) hoặc lactose (B) là nguồn cacbon chính.
19. 3.3 Kết quả của sáng chế
Chủng TSC03 (với hai bản sao của gen pacC kiểu thuần
chủng) cũng sản xuất quá nhiều penicilin so với chủng sC14,
mặc dù ít hơn nhiều, ví dụ, chủng TSC7 với một bản sao của
gen kiểu hoang dã và bản sao thứ hai của alen pacC33
Sự tăng trưởng và sản xuất penicillin từ chủng pacC + / pacC + đã được biến đổi gen .
• Tốc độ tăng trưởng (pH ngoại bào, A) và sản xuất penicilin (B = từ chủng TSC03 đã biến đổi gen, pacC + / pacC + merodiploid, so với dòng
mẹ sC14. Các mẫu cấy được nuôi trong môi trường sản xuất penicilin với saccharose là nguồn cacbon chính.
• Trong bảng B, quan sát thấy sự khác biệt trong việc sản xuất penicillin giữa pacC + / pacC + merodiploid (TSC03) và
merodiploid pacC + / pacC33 (TSC7)
20. 3.3 Kết quả của sáng chế
• Những kết quả này xác nhận các nguyên tắc được sử dụng trong sáng chế này về thiết kế các chủng
biến đổi gen với chức năng pacC tăng lên để sản xuất quá mức penicillin và thiết kế các đột biến
pacC cung cấp sự tăng chức năng và hoạt động.
Các chủng TX5 , TSC4 và TSC7 cũng là những chất sản xuất
quá mức penicilin trong môi trường lactose, ở đó mức sản xuất
xấp xỉ gấp đôi so với sC14 hoặc NRRL 1951.
Sản xuất penicillin trong môi trường có lactose.
Việc sản xuất penicilin trong lactose từ các dòng merodiploid pacC + / pacC33
TSC4, TSC7 và TX5, so với dòng mẹ sC14.
21. Bằng kỹ thuật Northern với các đầu
dò cụ thể cho các gen cấu trúc pcbAB,
mã hóa cho ACV synthetase và pcbC,
mã hóa cho IPNS synthetase, từ quá
trình sinh tổng hợp penicillin tuyến
đường.
Việc định lượng bằng Phosphorimager
các tín hiệu lai của các màng, cho phép
xác định cấu hình phiên mã của các
gen này trong chủng thu sC14 được
nuôi cấy trong điều kiện rung và cấy
có kiểm soát. Ở dòng này, các bản sao
của các gen này được phát hiện vào
ngày thứ 3, với mức tối đa vào ngày
thứ 5 và 6
Kết luận:
Phát minh này mô tả một quy trình mới giúp tăng tổng hợp
penicillin bằng cách điều khiển di truyền của một gen điều hòa,
pacC.
Một dạng đột biến của gen này được trình bày ở P.
chrysogenum , được gọi là pacC33, mã hóa một protein có chức
năng tăng và trình tự của chúng.
3.3 Kết quả của sáng chế
22. 3.4 Ứng dụng của công nghệ
Phát triển các dạng đột biến hoàn
chỉnh hoặc một phần, bằng cách tổng
hợp trình tự DNA mới ,phân lập và
xác định các dạng tự nhiên, của các
gen tương đồng
Có chủng sản xuất quá mức penicilin và
có mức độ phiên mã cao của ít nhất hai
gen liên quan. trong sinh tổng hợp
penicillin.
Tăng tổng hợp các chất chuyển hóa
hữu ích hoặc các enzym ngoài tế bào
tổng hợp các chất chuyển hóa
không mong muốn như aflatoxin.
24. Thuốc Penicillin
- Thuốc penicillin G-(kể cả penicillin V) chủ yếu
được dùng để chống lại:
* Vi khuẩn Gram dương
* Một số cầu khuẩn gram âm (ví dụ, bệnh viêm
màng não cầu khuẩn)
- Penicillin G là thuốc được lựa chọn cho bệnh giang
mai, đối với một số nhiễm trùng đường mật, và, với
gentamicin, đối với viêm nội tâm mạc do enterococci
benzathine penicillin tinh khiết để điều trị bệnh giang
mai và phòng chống thấp khớp.
25. Thuốc Penicillin phổ
kháng khuẩn rộng
- Những thuốc thuộc phân nhóm này thường được sử
dụng để điều trị:
+ Vi khuẩn còn nhạy cảm với ampicillin
+ Một số chủng Enterobacter và Serratia spp
+ Nhiều chủng P. aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh)
26. * Lưu ý khi sử dụng
Penicillin
- Cần cân nhắc liều sử dụng thuốc kháng sinh
Penicillin trong trường hợp sau:
- Vì các penicillin, ngoại trừ nafcillin, có nồng độ
thuốc cao trong nước tiểu. Vì vậy, nên cân nhắc giảm
liều ở những bệnh nhân suy thận nặng.
- Probenecid ức chế sự bài tiết thuốc ở ống thận một
số penicillin, do đó làm tăng nồng độ thuốc trong máu.
