Penelitian ini mengevaluasi efek perlindungan protein yang diisolasi dari tanaman herbal Phyllanthus niruri terhadap kerusakan hati yang diinduksi obat nimesulide pada tikus. Pemberian pra dan pasca perlakuan protein ini meningkatkan enzim antioksidan, mengurangi stres oksidatif, dan mencegah kerusakan jaringan hati.

1. Disusun oleh:
Mumfasiroh Saputri
(1808045025)

2. Penelitian ini dilakukan untuk mengevaluasi
kelompok protein (PI, Isolat protein) dari ramuan,
PN yang stres oksidatif diinduksi nimesulide in vivo
menggunakan tikus. Tikus diobati secara
intraperitonial dengan dosis 5 mg/kg bb selama 7
hari setelah nemesulid (dengan dosis 10 mg/kg bb
selama 7 hari) evaluasinya adalah sebagai
pencegahan. Tingkat pengurangan Glutathion
(GSH), enzim anti oksidan, Superoksida Dismutase
(SOD), dan katalase (CAT), serta zat reaktif Asam
Tiobarbiturat (TBARS) dalam homogenat hati dalam
setiap kelompok studi.

3.  Hati adalah target utama untuk paparan
toksik
 Paparan utama ini menyebabkan gangguan
hati terutama menghasilkan ROS
 Salah satu tanaman herbal dengan efek
samping minim yaitu Pphyllantus Ninuri yang
telah terbukti memiliki peran sebagai
pelindung dari berbagai toksin dan gangguan
hati yang disebabkan oleh obat, efek samping

4. 2.1. Hewan dan bahan kimia
 Tikus albino Swiss (jantan, berat badan 25 ± 2 g) digunakan
dengan mempertimbangkan prinsip-prinsip internasional dan
peraturan setempat tentang perawatan dan penggunaan hewan
laboratorium. Hewan-hewan tersebut disesuaikan dalam kondisi
sesuai standar laboratorium selama 2 minggu sebelum memulai
percobaan apa pun. Hewan yang diet standar dan libitum yang
ditambahkan air.
 Nimesulide, perangkat radikal bebas dan protein DPPH dibeli dari
Perusahaan Kimia Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) USA. 1-Chloro 2,
4 dinitrobenzene (CDNB), asam ethylenediamine tetraacetic
(EDTA), asam thiobarbituric (TBA), nitroblue tetrazolium chloride,
phenazine metho-sulphate dan nicotinamide adenine
dinucleotide dikurangi (NADH) telah diperoleh dari penelitian di
laboratorium India.

5. 2.2. Persiapan pemisahan protein dari P. niruri
 Semua langkah dilakukan pada 4 ◦ C. Daun muda segar dan batang P.
niru ri dihomogenisasi dalam 50 mM dapar fosfat, pH 7,2, dan homogenat
disentrifugasi pada 12.000 × g.
 Supernatan 60% saturasi dengan (NH 4 ) 2 SO 4 .
 Endapan didialisis buffer fosfat untuk menghilangkan (NH 4) 2 SO 4.
 Protein selanjutnya dikonsentrasikan dengan menambahkan dua volume
aseton (awalnya didinginkan pada - 20 ◦ C) ke satu volume larutan protein.
 Protein diendapkan; itu kemudian dilarutkan buffer fosfat, didialisis terhadap
buffer yang sama untuk menghilangkan aseton. Semua percobaan dilakukan
menggunakan pemisahan protein ini, yang disebut protein isolate (PI).
 Untuk memeriksa efek perlakuan panas terhadap aktivitas
biologis pemisahan protein P. niruri ini , dipanaskan pada 95 ◦ C selama 10
menit, didinginkan dan kemudian diaplikasikan secara intraperitoneal
dengan dosis 5 mg / kg berat badan selama 7 hari setelah nime - Pemberian
sulfida (10 mg / kg berat badan). Untuk memeriksa efek protease pada
aktivitas biologisnya, ia diinkubasi dengan trypsin pada suhu 37 ◦ C selama 1
jam dan kemudian diberikan secara intraperi setelah pemberian nimesulide.
 Konsentrasi protein ditentukan dengan menggunakan alat estimasi protein
yang diperoleh dari Sigma Chemical Company. Estimasi ini dilakukan sesuai
dengan metode Brad-ford menggunakan albumin serum serum kristal
sebagai standar.

6. 2.3. Penentuan aktivitas biologis
2.3.1. Peran pencegahan
Peran pencegahan dari isolat protein terhadap kerusakan hati
yang diinduksi nimesulide ditentukan :
 Hewan-hewan dibagi menjadi enam kelompok, masing-masing
kelompok memiliki delapan tikus. Kelompok I adalah kontrol normal,
kelompok II hanya menerima 50 mM dapar fosfat, pH 7,2, kelompok III
menerima nimesulide pada tingkat dosis 10 mg / kg berat badan
selama 1 minggu; kelompok IV diberi perlakuan awal dengan fraksi
protein terisolasi pada dosis intraperitoneal 5 mg / kg berat badan
selama 7 hari dan kemudian diobati dengan nimesulide dengan dosis
10 mg / kg berat badan selama 1 minggu. Hewan dikorbankan dengan
anestesi eter ringan 24 jam setelah dosis terakhir pemberian
nimesulide. Untuk memvalidasi penelitian, efek dari protein yang tidak
relevan, BSA, dan antioksidan yang dikenal, Vitamin E, juga ditentukan
pada tekanan oksidatif yang diinduksi oleh nimesulide.


7. 2.3.2. Peran kuratif
 Hati memiliki sifat regenerasi yang unik setelah cedera dari obat dan
toksin . Untuk memastikan apakah protein dapat menyebabkan
penyembuhan hati lebih cepat daripada regenerasi alami, studi waktu
dilakukan di mana delapan tikus dalam setiap kelompok disuntik dengan
isolat protein selama 1, 2, 3, 4 dan 5 hari setelah nimesulide diberikan dosis
dan waktu yang sama seperti yang disebutkan sebelumnya. Tikus
dikorbankan setelah hari ke-2, ke-3, ke-5 dan ke-6.
 Perlakuan lainnya, delapan tikus di masing-masing kelompok diperlakukan
dengan hanya nimesulide dan dikorbankan setelah hari ke-2, ke-3, ke-5,
ke-6 dan ke-6. Selain itu, delapan tikus disimpan sebagai kontrol normal.
2.4. Penentuan GSH dan kadar enzim antioksidan dalam homogenat hati
 Level GSH hati ditentukan oleh metode Ell-man
 Aktivitas SOD diuji mengikuti metode yang awalnya dikembangkan oleh
Nishikimi et al. dan kemudian dimodifikasi oleh Kakkar et al.
 Aktivitas CAT diukur dengan metode Bonaventura

8. 2.5. Estimasi produk akhir peroksidasi lipid
 Tingkat peroksidasi lipid dalam sampel hati eksperimental dinilai
menggunakan metode kolorimetri di mana terutama malondialdehyde
diproduksi oleh reaksi thiobarbituric acid (TBA) seperti yang dijelaskan
oleh Esterbauer dan Cheese-man
2.6. Histopatologi hati
 Spesimen hati dari semua kelompok eksperimen difiksasi dalam formalin
buffer 10% dan diproses untuk pemotongan parafin. Dengan
ketebalan sekitar 5 mm diwarnai dengan hematoksilin dan eosin untuk
mempelajari perubahan ultrastruktur hepar pada kondisi percobaan
yang berbeda.
2.7. Analisis statistik
 Semua nilai direpresentasikan sebagai rata-rata ± SD ( n = 8). Uji-
t Student diterapkan untuk menghitung signifikansi perbedaan antar
kelompok. Nilai P 0,05 atau kurang dianggap signifikan.

9.  Pemisahan protein yang diisolasi dari P.
niruri mencegah nimesulide yang diinduksi
sebagian gangguan hati
 Perlakuan panas dan pencernaan tryptic
menghancurkan aktivitas perlindungan
dari pemisahan protein P. niruri yang terisolasi
ini . Ketika DPPH diinkubasi dengan fraksi protein
pada berbagai konsentrasi, absorbansi pada 517
nm berkurang.Ini menunjukkan bahwa ia
memiliki aktivitas pembersihan radikal bebas.
 Aktivitas SOD hati berkurang pada tikus yang
diobati nimesulide. (394 ± 7,3, 575 ± 12,5 unit /
mg protein pada tikus kontrol hati).

11.  Gambar histopatologis hati tikus normal (A), hati tikus yang diobati
nimesulide (B) dan tikus histologi hati diobati fraksi protein P. niruri sebelum
dan sesudah pemberian nimesulide (masing-masing C dan D). Bagian hati
diwarnai dengan hematoksilin dan eosin (H dan E, perbesaran 40 × ).
 jaringan) lebih rendah dibandingkan dengan tingkat itu dalam hati tikus yang
diobati nimesulide (61,0 ± 0,70 nmole / g jaringan). Setelah 4 hari tingkat
MDA jauh lebih sedikit (37,5 ± 0,68 nmole / g jaringan) dibandingkan
kontrol nimesulide masing-masing (46,9 ± 0,80 nmole / g tis-sue). Pasca
perawatan dengan PI selama 5 hari mengurangi tingkat MDA ke tingkat
normal (28,7 ± 0,65 nmole / g jaringan) sementara pada kontrol yang
diobati nimesulide pengurangan spontan lebih sedikit (40,6 ± 0,82 nmole /
g jaringan).
 Penilaian histopatologis telah diwakili pada . Pengobatan Nimesulide
menyebabkan perubahan besar termasuk nekrosis centrilobular, proliferasi
saluran empedu, dis-organisasi pola radiasi normal pelat sel di sekitar vena
sentral, dll. ( B).
 Secara kualitatif, peradangan pada fraksi protein P. niruri yang diobati tikus
sebelum dan sesudah pemberian nime-sulide kurang parah ( C dan D).

12.  Nimesulide menyebabkan pengurangan kadar
GSH dan berbagai enzim antioksidan meningkat
secara signifikan ketika hewan secara intraperi-
toneal perawatan dengan pemisahan protein
yang dimurnikan, sebagian diisolasi dari daun
muda segar dan batang P. niruri .
 Selain itu, peningkatan yang diinduksi nimesulide
dari peroksidasi lipid juga berkurang secara
signifikan oleh pra-perawatan ini.
 Juga pasca perawatan hewan dengan pemisahan
protein ini mengembalikan kadar enzim
antioksidan, GSH dan lipid yang berubah.

13.  hati adalah organ sentral untuk memetabolisme semua senyawa
asing seperti paparan polutan yang beragam, racun, bahan kimia
berbahaya dan juga oleh sejumlah obat ketika diminum sering
atau di luar dosis terapeutik mereka.
 Racun ini merusak hati dengan memproduksi spesies oksigen
reaktif, ROS .
 Untuk menghadapi stres oksidatif, mekanisme pertahanan
antioksidan beroperasi dalam tubuh kita untuk mendetoksifikasi
atau membersihkan ROS.
 Sistem antioksidan terdiri dari berbagai jenis komponen
fungsional termasuk enzim antioksidan yang berbeda, bersama
dengan zat yang mampu mengurangi ROS atau mencegah
pembentukannya.
 Di antara mereka, SOD terutama bertindak dengan pendinginan
superoksida (O 2
-), sebuah radikal oksigen aktif ,
 yang diproduksi dalam metabolisme aerob yang berbeda. CAT
bertindak dengan mengkalkulasi dekomposisi H 2 O 2 menjadi air
dan oksigen