Nghiên Cứu Phân Lập, Xác Định Cấu Trúc Và Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Các Hợp Chất Steroid Từ Cây Lá Đắng (Vernonia Amygdalina).doc

Tải tài liệu tại sividoc.com
Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
BỘ GIÁO DỤC VÀ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------
Lê Thị Liên
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH
GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC HỢP CHẤT STEROID TỪ
CÂY LÁ ĐẮNG (Vernonia amygdalina)
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Hà Nội, năm 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------
Lê Thị Liên
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ
ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC HỢP CHẤT
STEROID TỪ CÂY LÁ ĐẮNG (Veronia amygdalina)
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 8440114
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. HOÀNG LÊ TUẤN ANH
Hà Nội, năm 2020

Lời cam đoan
Luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa
học của PGS.TS. Hoàng Lê Tuấn Anh.
Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được
công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Tác giả luận văn
Lê Thị Liên

Lời cảm ơn
Luận văn tốt nghiệp cao học này được hoàn thành, tôi xin bày tỏ lòng
biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Hoàng Lê Tuấn Anh đã trực tiếp
hướng dẫn tận tình, dìu dắt và giúp đỡ tôi với những chỉ dẫn khoa học quý giá
trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể phòng Ứng dụng và Triển khai Công
nghệ - Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung, đặc biệt là TS. Lê Cảnh Việt
Cường, đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo giúp đỡ tôi hoàn thành được luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Phạm Việt Cường, chủ nhiệm đề
tài “Nghiên cứu phát triển cây dược liệu Vernonia amygdalina Delile (cây lá
đắng) tại tỉnh Thừa Thiên Huế và định hướng ứng dụng” đã hỗ trợ tôi thực
hiện luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo và các thầy cô giáo của Học
viện Khoa học và Công nghệ đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt những kiến
thức khoa học chuyên ngành cho tôi trong những năm tháng qua.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp,
bạn bè, những người đã luôn động viên, chia sẻ, ủng hộ tôi trong suốt thời
gian qua./.
Xin chân thành cảm ơn!
Tác giả luận văn
Lê Thị Liên

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Viết tắt Tiếng Anh Diễn giải
1
H-NMR Proton nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
resonance spectroscopy proton
13
C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
resonance spectroscopy cacbon 13
ABTS 2,2'-Azino-bis (axit 3-
ethylbenzthiazoline-6-
sulfonic)
A-549 Human lung carcinoma cell Tế bào ung thư phổi ở người
line
A2780 Human ovarian carcinoma Tế bào ung thư biểu mô
cell line buồng trứng ở người
Bel-7402 Human endocervical Tế bào ung thư biểu mô
adenocarcinoma cell line tuyến nội tiết ở người
CC Column chromatography Sắc ký cột
DPPH 2,2-diphenyl-1-
picrylhydrazyl
DEPT Distortionless enhancement Phổ DEPT
by polarisation transfer
ED50 Median effective dose Liều lượng ảnh hưởng đến
50% đối tượng thử nghiệm
G6Pase Glucose 6-phosphatase
HL-60 Human promyelocytic Tế bào ung thư máu cấp ở

leukemia cell line người
HeLa HeLa cell Tế bào ung thư cổ tử cung
HepG2 Hepatocellilar carcinoma Tế bào ung thư biểu mô gan
cell line
HMBC Heteronuclear multiple Phổ tương tác dị hạt nhân
bond coherence qua nhiều tương tác
HSQC Heteronuclear single Phổ tương tác dị hạt nhân
quantum coherence qua 1 liên kết
IC50 Inhibitory concentration at Nồng độ ức chế 50% đối
50% tượng thử nghiệm
MIC Minimum inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu
concentration
L-1210 l-1210 cell line Tế bào ung thư bạch cầu
NCI-661 Large cell lung carcinoma Tế bào ung thư biểu mô tế
cell line bào phổi lớn
OD Optical density Mật độ quang học
TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng
HR-ESI-MS High resolution Phổ khối lượng phân giải
electronspray ionization cao phun mù điện tử
mass spectrum
KB Human epidemoid Tế bào ung thư biểu mô
carcinoma cell line người
L-NMMA N-methylarginine

T-47D Breast cancer cell line Tế bào ung thư vú
GM-CSF Granulocyte-macrophage Yếu tố kích thích đại thực
colony stimulating factor bào bạch cầu
SMMC-7721 Human papillomavirus- Tế bào ung thư biểu mô
related endocervical tuyến nội tiết liên quan đến
adenocarcinoma cell line papillomavirus ở người
DLD-1 Colorectal adenocarcinoma Tế bào ung thư biểu mô
cell line tuyến
HSC4 Human oral squamous Tế bào ung thư vòm họng ở
carcinoma cell line người

Danh mục các bảng
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất VA1 và hợp chất tham khảo.........30
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất VA3 và hợp chất tham khảo (VA2)
40
Bảng 3.11. Các hợp chất phân lập được từ loài lá đắng................................49
Bảng 3.12. Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme α-amylase và enzyme α-
glucosidase của các hợp chất..........................................................................51
Bảng 3.13. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế các enzyme α-amylase và α-
glucosidase theo nồng độ của các hợp chất phân lập được ...........................51
* Acarbose được dùng làm chất đối chứng dương. ........................................52

Danh mục các hình vẽ
Hình 1.1. Hình ảnh của một số loài thuộc chi Vernonia. .................................5
“Nguồn: Thư viện điện tử Wikipedia ”.............................................................5
Hình 2.1. Cây lá đắng (V. amygdalina) ..........................................................22
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài V. amygdalina.......................26
Hình 3.1. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VA1
29
32
Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất VA3 và hợp chất tham khảo (VA2)
34
Hình 3.4. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VA3................................................35
Hình 3.5. Phổ 1
H-NMR của hợp chất VA3.....................................................35
Hình 3.6. Phổ 13
C-NMR của hợp chất VA3...................................................36
Hình 3.7. Phổ HSQC của hợp chất VA3.........................................................37
Hình 3.9. Phổ HMBC của hợp chất VA3........................................................38
Hình 3.10. Phổ NOESY của hợp chất VA3.....................................................39
Hình 3.11. HPLC của VA3 sau khi được acid hóa.........................................42
Hình 3.12. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất
VA4..................................................................................................................42
VA5..................................................................................................................44
VA6..................................................................................................................47
Phổ 1
H-NMR của hợp chất VA1.....................................................................64
Phổ 13
C-NMR của hợp chất VA1 ...................................................................64
Phổ HMBC của hợp chất VA1........................................................................65
Phổ HSQC của hợp chất VA1.........................................................................65

Phổ 1
Phổ 13
Phổ 13
Phổ 1
Phổ 13
Phổ 1
Phổ 13

1
MỤC LỤC
MỤC LỤC....................................................................................................... 10
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN............................................................................. 5
1.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu chi Vernonia ............................................. 5
1.1.1. Phân loại chi Vernonia ở Việt Nam ................................................. 5
1.1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
chi Vernonia ............................................................................................... 5
1.2. Những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây
lá đắng (Vernonia amygdalina) .............................................................................. 17
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 22
2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 22
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 22
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất ................................................. 22
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất ...................... 23
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế các enzyme α-amylase và α-
glucosidase .................................................................................................. 24
2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase 24
2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-amylase ...... 25
2.3. Phân lập các chất ................................................................................................ 25
2.3.1. Phân lập các hợp chất từ mẫu dược liệu ........................................... 25
2.3.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ các hợp chất ...................................... 26
2.3.2.1. Hợp chất VA1: (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy-7,8,9,11-
tetradehydro-3β-16α,21,24-tetrahydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5α-
stigmastane .............................................................................................. 26
2.3.2.2. Hợp chất VA2: vernoniacum B ................................................ 27
2.3.2.3. Hợp chất VA3: vernoamyoside E (chất mới) ............................ 27
2.3.2.4. Hợp chất VA4: vernonioside B1 ............................................... 27
2.3.2.5. Hợp chất VA5: vernonioside B2 ............................................... 27
2.3.2.6. Hợp chất VA6: (23S,24R,28S)-3β,22α-dihydroxy-7,8,9,11-
tetradehydro-24,28-epoxy-5α-stigmastane-21,23-carbolactone ............. 27

2
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 29
3.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được ........................... 29
3.1.1. Hợp chất VA1: (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy-7,8,9,11-
stigmastane .................................................................................................. 29
3.1.2. Hợp chất VA2: vernoniacum B ........................................................ 32
3.1.3. Hợp chất VA3: vernoamyoside E (chất mới) .................................... 34
3.1.4. Hợp chất VA4: vernonioside B1 ....................................................... 42
3.1.5. Hợp chất VA5: vernonioside B2 ....................................................... 44
3.1.6. Hợp chất VA6: (23S,24R,28S)-3β,22α-dihydroxy-7,8,9,11-
tetradehydro-24,28-epoxy-5α-stigmastane-21,23-carbolactone ................. 47
CTPT: 50
M: 470 50
3.2. Hoạt tính sinh học của các chất phân lập được ........................................... 50
3.2.1. Sàng lọc hoạt tính ức chế các enzyme α-amylase và α-glucosidase
của các hợp chất phân lập được từ cây lá đắng ........................................... 50
3.2.2. Đánh giá hoạt tính ức chế các enzyme α-amylase và α-glucosidase
theo nồng độ của các hợp chất phân lập được ............................................ 51
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 53
4.1. Kết luận ................................................................................................................. 53
4.1.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học ................................................ 53
4.1.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học .................................................... 53
4.2. Kiến nghị ............................................................................................... 53
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ............................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 56

3
MỞ ĐẦU
Việt Nam là quốc gia có khí hậu nhiệt đới gió mùa, rất thích hợp cho sự
sinh trưởng và phát triển của các loài thực vật. Điều này có thể thấy rõ qua sự
đa dạng về số lượng và các chủng loại loài thực vật khác nhau. Theo thống kê
mới nhất của Viện Dược liệu, nước ta có hơn 5.000 loài thực vật có thể sử
dụng làm thuốc để chữa trị nhiều loại bệnh. Đây là nguồn tài nguyên rất lớn
trong việc nghiên cứu phát triển các thuốc mới phục vụ cho việc chữa nhiều
bệnh mà con người đang phải đối mặt như tim mạch, ung thư, tiểu đường,
gout, alzheimer, … Do đó, hướng nghiên cứu, sàng lọc các loại thảo dược có
công dụng chữa bệnh nhằm tìm kiếm các hợp chất tự nhiên mới có hoạt tính
sinh học cao đã và đang nhận được sự quan tâm lớn từ các nhà khoa học trong
nước và quốc tế.
Bệnh tiểu đường là căn bệnh mãn tính thường gây nhiều biến chứng
nguy hiểm đối với người bệnh. Là nguyên nhân hàng đầu gây nhồi máu cơ
tim, đột quỵ, suy thận giai đoạn cuối, mù lòa… Đái tháo đường được xem là
một trong 4 nguyên nhân gây tử vong hàng đầu và làm giảm tuổi thọ trung
bình của con người từ 5 đến 10 năm. Theo Hiệp hội đái tháo đường thế giới
(IDF), năm 2017, cứ trung bình 7 giây lại có một người chết do các biến
chứng liên quan đến bệnh đái tháo đường và cứ 30 giây lại có một bệnh nhân
đái tháo đường có biến chứng bàn chân bị cắt cụt chi [1]. Hiện nay, số lượng
bệnh nhân đái tháo đường vẫn đang gia tiếp tục tăng nhanh trên toàn thế giới.
Vì vậy, việc nghiên cứu các phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường đang
rất được các nhà khoa học quan tâm.
Cây lá đắng (Vernonia amygdalina), còn được gọi với các tên khác như
khổ diệp thụ hay cúc ban cưu, là loại cây thường được sử dụng theo kinh
nghiệm để chữa một số bệnh như cao huyết áp, táo bón, viêm dạ dày, viêm
gan… Tại Việt Nam, V. amygdalina đã được một số bệnh nhân bệnh đái tháo
đường sử dụng và cũng đạt được một số kết quả nhất định. Tuy nhiên, hiện
nay việc sử dụng lá cây này để điều trị bệnh đái tháo đường chủ yếu dựa theo
kinh nghiệm truyền miệng, chưa có một nghiên cứu nào được tiến hành để

4
đánh giá toàn diện thành phần hóa học cũng như hoạt tính ức chế enzyme α-
amylase và α-glucosidase của V. amygdalina sinh trưởng tại Việt Nam.
Từ những cơ sở trên tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phân lập, xác định
cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học các hợp chất steroid từ cây lá
đắng (Vernonia amygdalina)”.

5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHI Vernonia
1.1.1. Phân loại chi Vernonia ở Việt Nam
Chi Vernonia Schreb. (họ Asteraceae) có khoảng 1.000 loài. Chúng
phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi, Bắc và Nam Mỹ. Theo từ
điển cây thuốc Việt Nam, có 15 loài thuộc chi Vernonia có thể sử dụng làm
thuốc bao gồm: bạch đầu sát trùng (V. anthelmintica), bạch đầu nhám (V.
aspera), bông bạc (V. arborea), bạch đầu ông (V. cinerea), dây chè (V.
cumingiana), dây dọi tên (V. elliptica), bạch đầu rau (V. esculenta), bạch đầu
to (V. macrachaenia), cúc lá cà (V. solanifolia), bạch đầu Spire (V. spirei),
bạch đầu lông (V. parishii), bạch đầu nhỏ (V. paluta), bạch đầu lá liễu (V.
saligna), bạch đầu bao gai (V. squarrosa), bạch đầu lá lớn (V.
volkameriaefolia). Các loài Vernonia thường được dùng để chữa trị các bệnh
như: giun sán, viêm gan, đau dạ dày, sốt, ho, mụn nhọt, rắn cắn, viêm phế
quản, bỏng lửa, sốt rét...[2]
V. elliptica V. anthelmintica V. cinerea
Hình 1.1. Hình ảnh của một số loài thuộc chi Vernonia.
“Nguồn: Thư viện điện tử Wikipedia ”
1.1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
của chi Vernonia
Hiện nay, các loài thuộc chi Vernonia đang nhận được sự quan tâm lớn
của các nhà khoa học trên thế giới. Tuy nhiên, các công trình công bố về các
loài thuộc chi Vernonia ở Việt Nam còn rất ít, vì vậy chưa có được đầy đủ cơ

6
sở khoa học để định hướng khai thác và phát triển nguồn dược liệu tiềm năng
này.
Trong số 15 loài thuộc chi Vernonia được sử dụng để làm thuốc ở Việt
Nam, V. anthelmintica là 1 trong 3 loài được công bố nhiều nhất. Các nghiên
cứu cho thấy thành phần hóa học của loài V. anthelmintica chủ yếu là các
steroid và sesquiterpenoid. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học loài V. anthelmintica được bắt đầu từ năm 1968, Frost và cộng sự
thông báo đã phân lập được 2 steroid từ hạt loài V. anthelmintica là 7,24(28)-
stigmatadien-3β-ol (1), 7,24(28)-stigmatadien-3β-ol acetate (2) và 1 hợp chất
steroid đã biết khác là avenasterol (3) [3]. Trong các nghiên cứu tiếp theo về
loài này, 7 steroid mới được thông báo phân lập từ hạt gồm 8,14,(Z)-24(28)-
stigmastatrienol (4), stigmasterol (5), 5-stigmasten-3β-ol (6), 7,22-
stigmastadienol (7), 3-oxo-7,(Z)-24(28)-stigmastadiene (8), 5-α-stigmasta-
8(14),15,24(28)-triene -3β-ol (9), 4α-methylvernosterol (10) [4-7]. Bên cạnh
đó, các hợp chất flavonoid, 2ʹ,3,4,4ʹ-tetrahydroxychancone (11), 4ʹ,5,6,7-
tetrahydrohyflavone (12) và 3ʹ,4ʹ,7-trihydroxydihydroflanoe (13) cũng được
phân lập từ hạt của V. anthelmintica [8]. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh
học cho thấy dịch chiết ethanol từ hạt loài này có tác dụng hạ đường huyết ở
chuột mắc bệnh tiểu đường do streptozotocin gây ra. Kết quả thử nghiệm
cũng cho thấy với liều thử 0,5 g/kg, mức giảm đường huyết tối đa đạt 82%
sau 6 giờ [9]. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu cấp HL-60 của 2
sesquiterpenoid, vernodalidimer A-B (14-15) phân lập từ V. anthelmintica
cũng đã được Liu và cộng sự thông báo với giá trị IC50 lần lượt là 0,72 và
0,47 μM [10].

7
Năm 2012, Hua và cộng sự đã phân lập được 6 steroid từ phần trên mặt
đất của V. anthelmintica sinh trưởng ở Pakistan gồm vernoanthelsterone A
(16), 24ξ-hydroperoxy-24-vinyllathosterol (17), (24R)-stigmast-7,22(E)-dien-
3β-ol (18), (22E,24R)-24-methyl-5α-cholesta-7,22-diene-3β,5,6β-triol (19),
(22E,24S)-5α,8α-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,22-dien-3β-ol (20), và
(22E,24S)-5α,8α-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,9(11),22-trien-3β-ol (21)
[11]. Kết quả đánh giá tác dụng đối kháng vi sinh vật kiểm định của các
steroid phân lập được cho thấy 4 hợp chất 16-19 có hoạt tính đối kháng với

8
các chủng Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và
Escherichia coli với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) từ 7,25 đến 250 μg/mL
[11]. Trong một nghiên cứu sau đó, Hua và cộng sự tiếp tục thông báo phân
lập được 11 steroid gồm vernoanthelcin A–I (22–30) và ernoantheloside A-B
(31-32) [12].

9
Năm 2014, Zhang và cộng sự đã thông báo 4 sesquiterpene lactone
thuộc khung guaianolide và elemanolide, (1R,4R,5S,6R,7R,8S)-8,15-
dihydroxyguaia-10(14),11(13)-dien-12,6-olide (33),
(1R,4R,5S,6R,7R,8S,11S)-8,15-dihydroxyguaia-10(14)-en-6,12-olide (34),
(4S,5R,6R,7R,8S,10R,11S)-11,13-dihydrovernolepin (35),
(5R,6R,7R,8S,10R,11S)-melitensin (36) có hoạt tính gây độc tế bào ung thư đối
với các dòng tế bào ung thư máu cấp HL-60 và ung thư biểu mô tuyến nội tiết
SMMC-7721 với giá trị IC50 từ 24,54 - 28,00 μg/mL. Tuy nhiên, hoạt tính gây
độc của các hợp chất này thấp hơn so với đối chứng dương (mitomycin) với giá
trị IC50 lần lượt là 0,56 và 1,85 μg/mL [13]. Ba hợp chất elemanolide dimer mới,
vernodalidimer C-E (37-39) được phân lập từ hạt V. anthelmintica cũng có tác
dụng gây độc mạnh trên dòng tế bào ung thư vú T-47D với giá trị IC50 lần lượt
là 5,58, 0,95 và 12,75 μM (đối chứng dương doxorubicin có giá trị IC50 là 25,50
μM). Tuy nhiên, cả 3 hợp chất 37-39 đều không thể hiện hoạt tính gây độc đối
với các dòng tế bào ung thư phổi A-549 và ung thư tuyến tiền liệt PC-3 với IC50
> 80 μM [14]. Ito và cộng sự (2016) đã phân lập được 5 sesquiterpene lactone
gồm vernonilide A và B (40-41), vernomelitensin (42), vernodalin (43) và
vernolepin (44) từ hạt V. anthelmintica. Kết quả đánh giá hoạt tính cho thấy tất
cả 5 hợp chất phân lập được đều có hoạt tính gây độc đối với các dòng tế bào
ung thư A-549, Hela và MDA-MB231 với giá IC50 từ 0,25 đến 21,6 μM [15].
Gần đây, Turak và cộng sự cũng thông báo phân lập được 5 hợp chất
sesquiterpene, vernodalidimer F-H (45-47), vernonilide C (48), vernonilide A
(40) từ hạt của V. anthelmintica thu ở Trung Quốc. Các hợp chất này đều thể
hiện hoạt tính gây độc đối với 4 dòng tế bào ung thư ở người, bao gồm ung thư
ruột kết HCT-15, ung thư tuyến tiền liệt PC-3, ung thư phổi A-549 và ung thư cổ
tử cung Hela với giá trị IC50 từ 5,3 đến 56,1 μM
[16]. Ngoài ra, dịch chiết từ loài V. anthelmintica cũng được thông báo có các
hoạt tính khác như kháng vi sinh vật, ức chế tế bào ung thư, kháng viêm,
chống oxi hóa, bảo vệ gan [17-20].

10
Loài Vernonia cinerea cũng được các nhà nghiên cứu trên thế giới rất
quan tâm. Năm 1981, Gunasingh và cộng sự đã phân lập được 4 flavonoid từ
hoa loài dược liệu này, gồm luteolin (49), luteolin-7-O-glucoside (50),
isoorientin (51) và chrysoeriol (52) [21]. Các hợp chất thứ cấp thuộc lớp chất
steroid, triterpenoid và acid béo cũng phân lập được từ loài V. cinerea như
stigmast-5,17(20)-dien-3β-ol (53), 26-methylheptacosanoic acid (54) [22], 24-
hydroxytaraxer-14-ene (55) [23], 3β-acetoxyurs-19-ene (56) [24], lupeol

11
palmitate (57), α-amyrin palmitate (58), stigmasterol-3-O-β-D-
glucopyranoside (59) [25]. Năm 2003, Kuo và cộng sự đã phân lập được 2
sesquiterpene lactone mới, vernolide A và B (60-61) từ vỏ loài V. cinerea thu
ở Đài Loan [26]. Cả hai hợp chất 60-61 đều có hoạt tính gây độc đối với các
dòng tế bào ung thư người gồm ung thư biểu mô KB, ung thư biểu mô tuyến
DLD-1, NCI-661 và ung thư cổ tử cung Hela. Hợp chất 60 thể hiện hoạt tính
gây độc mạnh đối với cả 4 dòng tế bào ung thư KB, DLD-1, NCI-661 và Hela
với giá trị ED50 lần lượt là 0,02, 0,05, 0,53 và 0,04 mM, trong khi đó hợp chất
61 có tác dụng gây độc đối với 3 dòng tế bào ung thư KB, NCI-661 và Hela
với giá trị ED50 lần lượt là 3,78, 5,88 và 6,42 μM [26]. Trong một nghiên cứu
khác, Pratheeshkumar và Kuttan cũng đã thông báo hợp chất 60 có tác dụng
làm tăng các yếu tố như interleukin-2 (IL-2) và interferron-gamma (INF-γ),
đồng thời làm suy giảm đáng kể các yếu tố tiền viêm như IL-1β, IL6; suy
giảm yếu tố hoại tử khối u (TNF-α) và yếu tố kích thích đại thực bào bạch cầu
(GM-CSF) trong quá trình di căn. Các bằng chứng này cho thấy hợp chất 60
có tác dụng tăng cường đáp ứng miễn dịch chống lại quá trình di căn của các
tế bào ung thư B16F-10 ở chuột [27].

12
Năm 2012, Youn và cộng sự đã phân lập được 9 hợp chất sesquiterpene
lactone từ V. cinerea, 8α-tigloyloxyhirsutinolide (62), 8α-
hydroxyhirsutinolide (63), 8α-hydroxyl-1-O-methylhirsutinolide (64), 8α-
tigloyloxyhirsutinolide-13-O-acetate (65), 8α-(2-methylacryloyloxy)-
hirsutinolide-13-O-acetate (66), 8α-(2-methylacryloyloxy)-1α-
methoxyhirsutinolide-13-O-acetate (67), vernolide-B (61), hirsutinolide-13-
O-acetate (68), vernolide-A (60). Cả 9 hợp chất (60-68) đều được đánh giá
hoạt tính kháng viêm thông qua khả năng ức chế sự sản sinh NO trong đại
thực bào RAW-264.7 được kích thích bởi LPS. Kết quả cho thấy, các hợp
chất 60-61, 65, 67-68 thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh với giá trị IC50 lần
lượt là 2,4, 1,2, 2,0, 1,5 và 2,7 mM, cao hơn so với đối chứng dương L-
NMMA (IC50 = 25,1 μM). Các hợp chất còn lại thể hiện hoạt tính kháng viêm
yếu hơn với giá trị IC50 từ 5,7 đến 28,4 μM [28].

13
Từ lá và vỏ của V. cinerea, Youn và cộng sự đã phân lập được 16 hợp
chất gồm 4 sesquiterpene mới, 8α-(2′Z-tigloyloxy)-hirsutinolide (69), 8α-(2′Z-
tigloyloxy)-hirsutinolide-13-O-acetate (70), 8α-(4-hydroxytigloyloxy)-
hirsutinolide (71), 8α-hydroxy-13-O-tigloyl-hirsutinolide (72), 8α-(2-
methylacryloyloxy)-hirsutinolide (73), 8α-tigloyloxyhirsutinolide (74), 8α-
tigloyloxyhirsutinolide-13-O-acetate (75), 8α-(2-methylacryloyloxy)-
hirsutinolide-13-O-acetate (76), vernolide-B (61), 8α-hydroxyhirsutinolide
(77), và vernolide-A (60), loliolide (78), isololiolide (79), (3R)-3-
hydroxyionone (80), apigenine (81), (9Z,12S,13S)-dihydroxy-9-octadecanoic
acid (82). Trong đó, các hợp chất 61, 72, 75-76 có tác dụng ức chế 64,8 – 88,8
% sự phát triển của dòng tế bào ung thư U251 tại nồng độ thử nghiệm 5 μM.
Ngoài ra, hợp chất 75 cũng có tác dụng ức chế 81,7% sự phát triển của dòng
tế bào ung thư vú ở người MDA-MB-231 tại nồng độ thử nghiệm 5 μM [29].
Năm 2018, tác giả và cộng sự đã phân lập được một sesquiterpene, 8α-
tigloyloxyhirsutinolide-13-O-acetat (75), từ phần trên mặt đất của V. cinerea.
Kết quả đánh giá hoạt tính cho thấy hợp chất 75 có hoạt tính ức chế sự phát
triển của dòng tế bào ung thư vòm họng ở người HSC4 theo cơ chế apoptosis.
Hợp chất 75 tác động vào quá trình phân chia tế bào HSC4 ở giai đoạn G2
thông qua việc ức chế quá trình phosphoryl hóa của STAT2 và STAT3 [30].
Ngoài ra, dịch chiết từ loài V. cinerea cũng được thông báo có hoạt tính kháng
viêm, chống sốt rét, kháng u, kháng vi sinh vật, bảo vệ gan, chống oxi hóa,
kháng vi rút, chống tiểu đường trên các thử nghiệm in vitro và in vivo [31-41].

14
Cũng trong năm 2018, Kuo và cộng sự đã phân lập được 7 hợp chất
sesquiterpene mới, vernolides E–K (83–89) từ V. cinerea. Kết quả đánh giá
hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản sinh NO trong đại thực bào
RAW-264.7 được kích thích bởi LPS của 5 hợp chất phân lập được (83-85,
88-89) cho thấy 4 hợp chất 84, 85, 88 và 89 có hoạt tính kháng viêm mạnh với
giá trị IC50 lần lượt là 2,82, 1,18, 4,51 và 0,85 μM (đối chứng dương, quecetin
có IC50 = 1,82 μM), trong khi đó hợp chất 83 có hoạt tính yếu hơn với giá trị
IC50 là 15,25 μM [42].
Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các
loài còn lại khá ít. Từ phần trên mặt đất loài V. arborea, Krishna và cộng sự
đã phân lập được hợp chất zaluzanin D (90). Tại nồng độ thử nghiệm 200

15
ppm, hợp chất 90 có tác dụng kháng nấm đối với cả 6 chủng nấm thử nghiệm
gồm Botrytis cinerea, Curvularia lunata, Colletotrichum lindemuthianum,
Fusarium oxysporum, Fusarium equisetii, Rhizoctonia solani với tỷ lệ ức chế
đạt từ 58 đến 100 % [43]. Dịch chiết ethanol từ lá của loài V. arborea cũng
được thông báo có tác dụng kháng viêm và chống oxi hóa trên mô hình thử
nghiệm in vivo [44].
Từ rễ loài V. cumingiana, Liu và cộng sự (2005) đã phân lập được 9
hợp chất gồm vernonioside G (91), VE-1 (92), 24-methylenelanost-9(11)-en-
3β-ol acetate (93), daucosterol (94), stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranoside
(59), ursolic acid (95), stearic acid (96), β-sitosterol (97), stigmasterol (98)
[45]. Trong một nghiên cứu khác về loài này, Suo và cộng sự đã phân lập
được 2 hợp chất mới là vernonioside S (99) và vernoniether S (100) [46].
Năm 2009 và 2010, Liu và cộng sự tiếp tục phân lập được 14 steroidal
glycoside mới khung stigmastane, vernocuminoside A–N (101–114) từ V.

16
cumingiana. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm thông qua tác dụng ức
chế yếu tố kính hoạt tiểu cầu (PAF) do enzyme β-glucoronidase tạo ra từ tế
bào bạch cầu đa nhân ở chuột (rat PMNs) của 12 sterodal glycoside phân lập
được (101-107, 109, 111-114) cho thấy hợp chất 102 có tác dụng kháng viêm
đáng kể với tỷ lệ ức chế 65,31% tại nồng độ thử nghiệm 10 μM (đối chứng
dương ginkgolide đạt tỷ lệ ức chế 81,05%). Các hợp chất 107-108, 112, 115
cũng có hoạt tính kháng viêm yếu hơn với tỷ lệ ức chế từ 13,33 đến 28,59%.
Các hợp chất 103-107 không thể hiện hoạt tính gây độc đối với các dòng tế
bào ung thư HCT-8, Bel-7402, BGC-823, A549 và A2780 ở nồng độ 10 μM
[47, 48].
Từ loài V. pulata, Liang và cộng sự cũng đã phân lập được 10 hợp chất,
gồm luteolin (49), tricin (115), luteolin 4'-O-β-D-glucoside (116), luteolin 7-
O-β-D-glucoside (50), 3,4-dicaffeoylquinic acid (117), Et 3,4-
dicaffeoylquinate (118), chlorogenic acid (119), esculetin (120), caffeic acid
(121), protocatechuic acid (122) [49]. Sau đó, Hira và cộng sự cũng đã phân
lập được 5 hợp chất, incaspitolide D (123), (S)-N-benzoylphenylalanine-(S)-2-
benzamido-3-phenyl-Pr ester (124), indole-3-carboxylic acid (125), apigenine
(80), diosmetin (126) [50]. Dịch chiết ethanol từ phần trên mặt đất

17
của V. pulata cũng được thông báo có tác dụng kháng viêm tương đương
indomethacin trên chuột bị phù do histamine và hoạt tính chống oxi hóa với
giá trị IC50 = 36,59 μg/mL [51].
1.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT
TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY LÁ ĐẮNG (Vernonia amygdalina)
Cho đến nay, trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về thành
phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài V. amygdalina (cây lá đắng). Các
kết quả nghiên cứu cho thấy, loài này thường chứa các hợp chất steroid
glucoside, sesquiterpene lactone và flavonoid. Một số hợp chất phân lập từ V.
amygdalina có tác dụng chữa bệnh đái tháo đường, kháng khuẩn, sốt rét,
kháng nấm, chống oxy hóa, bảo vệ gan.
Năm 1992, Mitsuo Jisaka và cộng sự phân lập được 4 hợp chất gồm
vernonioside A1 (127), vernonioside A2 (128), vernonioside A3 (129), là các
hợp chất góp phần tạo nên vị đắng của lá cây. Đặc biệt, hợp chất 130, với sự

18
mất đi nhóm OH ở vị trị C-16 và thêm nhóm OH ở C-23, không có tính chất
này [52]. Jisaka và cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất mới: vernonioside
A4 (131) và aglycone của nó, cũng như hai glucoside không liên quan đến vị
đắng, vernonioside B2 (132) và vernonioside B3 (133) [53].
Năm 2006, Erasto cùng cộng sự đã phân lập được hai hợp chất
sesquiterpene lactone mới là vernolide (134) và vernodalol (135). Cả hai hợp
chất đều có hoạt tính đối kháng đối với các chủng B. cereus, S. epidermidus,
S. aureus, M. kristinae và S. pyrogens [54].
Trong nghiên cứu của Atangwho và cộng sự năm 2013, nhóm tác giả đã
phát hiện ra hoạt tính chống oxy hóa và chống tiểu đường từ cao chiết của V.
amygdalina. Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết được đánh giá bằng
khả năng quét gốc tự do 2,20-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic
acid) (ABTS) hay còn gọi là khả năng chống oxy hóa tương đương Trolox
(TEAC), khả năng chống oxy hóa khử sắt (FRAP), và khả năng quét gốc tự
do 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt
tính chống oxi hóa của các cao chiết phụ thuộc vào liều lượng: cao chiết nước
> cao chiết methanol > cao chiết chloroform > cao chiết ether. Trong thử
nghiệm dung nạp glucose bằng đường uống, cao chiết chloroform cho hiệu
quả chống tiểu đường tốt nhất (33,3%), tương tự như metformin (27,2%), sau

19
2 giờ so với đối chứng (50,8%). Sau 14 ngày chuột bị tiểu đường được cho
uống cao chiết, cao chiết chloroform thể hiện tác dụng hạ đường huyết trong
máu (23,5%) và huyết thanh (21,4%) tốt nhất. Kết quả phân tích GC-MS cao
chiết chloroform cho thấy hàm lượng cao của các axit linoleic (4,72%), axit
α-linolenic (10,8%) và phytols (12,0%), cũng như các hợp chất khác [55].
Năm 2016, Quasie và cộng sự đã phân lập được 4 saponin steroid loại
D7 (136 – 139) mới từ lá của V. amygdalina thu được tại Châu Phi. Các hợp
chất này có hoạt tính kháng viêm thông qua tác dụng ức chế sản xuất NO
được kích hoạt bởi lipopolysacarit trong các tế bào RAW-264.7[56].
Năm 2017, Adefisayo và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ dạ dày
từ cao chiết methanol của lá V. amygdalina đối với dạ dày bị loét do aspirin
gây ra ở chuột. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng aspirin làm gia tăng đáng kể điểm
và chỉ số loét dạ dày, giảm pH dạ dày, axit dạ dày, giảm hoạt động superoxide
dismutase (SOD) và mức glutathione GSH, đồng thời làm tăng mức lipid
peroxidation (LPO), từ đó gây ra hoại tử các mô dạ dày. Trong khi đó cao
chiết methanol của V. amygdalina có tác dụng làm tăng pH của dạ dày, giảm
bài tiết acid dạ dày và thay đổi các thông số huyết học. Ngoài ra, cao chiết
methanol của cây lá đắng cũng làm tăng đáng kể hoạt động SOD và mức
GSH, trong khi đó làm giảm mức LPO. Các kết quả nghiên cứu này cho thấy
V. amygdalina có các tác dụng bảo vệ dạ dày chống lại bệnh loét dạ dày do
aspirin gây ra [57].

20
Vai trò của dịch chiết V. amygdalina trong phòng ngừa nhiễm độc thận
gây ra bởi chế độ ăn uống ô nhiễm dầu thô ở chuột cũng đã được Achuba và
cộng sự nghiên cứu. Kết quả cho thấy dịch chiết methanol từ lá V. amygdalina
có thể bảo vệ, chống lại các tác động tiêu cực gây ra bởi dầu thô, cải thiện và
khôi phục các chức năng thận bị mất bằng cách bảo vệ cấu trúc siêu mô [58].
Năm 2018, Wu và cộng sự tiến hành nghiên cứu tác dụng giảm tổn
thương gan từ cao chiết ethanol của V. amygdalina. Kết quả cho thấy cao
chiết ethanol V. amygdalina có tác dụng làm giảm FBG và cải thiện đáng kể
khả năng dung nạp glucose và kháng insulin (HOMA-IR) ở chuột gây ra bởi
STZ. Cao chiết ethanol cũng có tác dụng ức chế sự biểu hiện cao của các
enzyme glucoseogenesis chính (PEPCK và G6Pase) và tăng hoạt động AMPK
trong gan. Trong các tế bào HepG2 được kích hoạt bởi axit palmitic (PA), cao
chiết V. amygdalina có tác dụng làm giảm sản xuất glucose và biểu hiện của
các protein PEPCK và G6Pase, cũng như kích hoạt con đường chuyển hóa
AMPK. Những kết quả này cho thấy cao chiết ethanol của V. amygdalina có
tác dụng ức chế sự phát sinh glucose gan ít nhất một phần thông qua kích hoạt
AMPK [59].Năm 2019, Liu và cộng sự đã phân lập được 14 hợp chất steroid
loại stigmastane từ cây lá đắng (140 – 153) [60].

21
Ở Việt Nam, loài lá đắng mới chỉ có một vài nghiên cứu về đặc điểm thực
vật và sơ bộ thành phần hóa và hoạt tính sinh học. Năm 2016, Lê Thị Mi Chi
và công sự đã tiến hành khảo sát sơ bộ thành phần hóa học, đặc điểm vi phẫu
và hình thái của cây lá đắng[61]. Đặc điểm thực vật của cây lá đắng được Hồ
Thị Dung và công sự nghiên cứu (2018), nghiên cứu nhằm làm rõ thêm đặc
điểm và nâng cao giá trị sử dụng của loài lá đắng[62]. Gần đây, nghiên cứu của
Nguyễn Thị Hồng Hạnh và cộng sự về tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết
lá đắng trên chuột trắng chỉ ra rằng: Các lô chuột uống dịch chiết lá đắng đều
có nồng độ glucose giảm dần giảm về gần mức đường huyết ban đầu sau đợt
điều trị. Mức liều 200mg/kg cho kết quả giảm đường huyết mạnh nhất (50,3%)
và gần tương đương mức giảm của lô dùng insulin (52,7%)[63].
Tổng quan sơ bộ các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học của chi Vernonia cho thấy các lớp chất chính được phân lập từ chi
này chủ yếu là steroid, steroidal glycoside, sesquiterpenoid, và triterpenoid.
Ngoài ra, một số lớp chất khác như flavonoid, phenolic,… cũng được phân
lập từ chi này. Dịch chiết và các hợp chất phân lập được từ chi Vernonia có
nhiều hoạt tính thú vị như gây độc tế bào, kháng viêm, hạ đường huyết, chống
oxi hóa, kháng vi sinh vật, bảo vệ gan, kháng nấm,...

22
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Mẫu lá loài lá đắng (Vernonia amydalina) được thu hái vào tháng 6
năm 2017 tại Phú Thượng, Phú Vang, Thừa Thiên Huế. Mẫu được định danh
bởi TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản của cây lá đắng (số
MTB062017) được lưu tại Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hình 2.1. Cây lá đắng (V. amygdalina)
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
- Sắc ký lớp mỏng (TLC)

23
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien
60 F254 (Merck 1.05715), RP18 F254S (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử
ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch
H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp
điện đến khi hiện màu.
- Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và
pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh).
Pha đảo RP-18 (30-50 µm, Fuji Silysia Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion
Diaion HP-20 (Mitsubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự
kết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại
bao gồm:
- Phổ khối lượng (MS)
Phổ khối lượng phun mù điện ESI-MS được đo trên máy Agilent 1260
của Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS
Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy FT-ICR-Mass
spectrophotometer tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Phổ NMR được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là
TMS (Tetrametyl Silan).
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1
H-NMR, 13
C-NMR và
DEPT.

24
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, 1
H-1
H COSY
và NOESY.
+ Các dung môi được sử dụng bao gồm DMSO-d6, CD3OD, CDCl3,
pyridine-d5. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng
mẫu, trên nguyên tắc là dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu thử.
- Độ quay cực [α]D:
Độ quay cực được đo trên máy JASCO2000 Polarimeter của Viện Hóa
sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế các enzyme α-amylase
và α-glucosidase
- Nguyên liệu
Nguyên liệu gồm 03 chất sạch phân lập được (2, 3 và 5).
- Hóa chất
+ (Sulfanilamide) (BDH Chemical, Anh); pNPG), enzyme α-
glucosidase, enzyme α-amylase, starch azure (Sigma, Mỹ).
+ Tris hydroxymethyl aminomethane (Bio Basic, Canada); KH2PO4,
K2HPO4, DMSO, MeOH, acetic acid (Merck, Đức).
2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase
Nguyên tắc: hoạt tính ức chế α-glucosidase được thực hiện dựa trên
phản ứng thủy phân 4- nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) thành
đường glucose và p-nitrophenol, hợp chất có màu vàng dưới xúc tác của
enzyme α-glucosidase. Khi mẫu thử có hoạt tính ức chế enzyme α-
glucosidase, sự tạo thành hợp chất p-nitrophenol sẽ giảm, do vậy mật độ
quang (OD) của p-nitrophenol so với mẫu đối chứng, không bị ức chế sẽ giảm
theo. Mật độ quang (OD) của p-nitrophenol sinh ra sau phản ứng được đo ở
bước sóng 405 nm và được dùng để đánh giá hoạt động ức chế enzyme của
mẫu thử.
Tiến hành: trong mỗi giếng (đĩa 96 giếng) chứa: 50μL mẫu thử và 100
μL dung dịch enzyme α-glucosidase được ủ 25o
C trong 5 phút, tiếp

25
tục bổ sung 50 μL 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG). Mật độ quang
của phản ứng được đo trên máy ELISA ở bước sóng 405 nm [8]. Chất đối
chứng dương (acarbose) được dùng để kiểm soát độ ổn định và đánh giá hoạt
tính ức chế tương đương. Các phép thử được lặp lại 3 lần.
2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-amylase
Nguyên tắc: hoạt tính ức chế enzyme α-amylase được thực hiện dựa
vào phản ứng tạo màu của tinh bột với dung dịch đệm Tris dưới xúc tác của
enzyme α-amylase. Khi mẫu thử có hoạt tính ức chế enzyme α-amylase, sự
phân cắt liên kết α-1.4 của thành phần amilose và amilopectin trong tinh bột
bị cản trở, dẫn đến sự tạo thành các polysaccharide nhỏ, disaccharide glucose
và chất mang màu xanh giảm.
Tiến hành: trong mỗi giếng (đĩa 96 giếng) chứa 100 μL mẫu, 100 μL
tinh bột xanh và 50 μL enzyme α-amylase. Hỗn hợp được ủ tại 37o
C trong 15
phút, sau đó 250 μL axit axetic được thêm vào để dừng phản ứng, ly tâm ở tốc
độ 3000 vòng/phút trong 5 phút. Mật độ quang của phản ứng được đo bằng
máy ELISA ở bước sóng 595 nm.
2.3. PHÂN LẬP CÁC CHẤT
2.3.1. Phân lập các hợp chất từ mẫu dược liệu
Lá loài lá đắng (V. amygdalina) được sấy khô, xay nhỏ thu được 1,2 kg.
Bột khô này được ngâm chiết với methanol (3 lần x 3 lít) bằng thiết bị chiết
siêu âm (ở 500
C, mỗi lần 1 giờ). Dịch chiết được thu lại, lọc qua giấy lọc rồi
tiến hành cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 200 g cặn thiết
methanol. Cặn chiết này được phân bố đều trong 2 lít nước cất rồi đem chiết
lần lượt với n-hexane, dichloromethane và ethyl acetate. Các dịch chiết được
cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn n-hexane (VAH, 52
g), cặn dichloromethane (VAD, 42 g), cặn ethyl acetate (VAE, 31 g) và cặn
nước (VAW, 75 g). Kiểm tra vết chất của các cặn chiết trên sắc ký bản mỏng
pha thường, pha đảo. Kết quả cho thấy, các cặn VAH, VAD chứa nhiều diệp
lục, các vết chất ít và không rõ ràng. Các vết chất chính của loài đều có mặt ở
cặn VAE nên chúng tôi lựa chọn cặn VAE để tập trung phân lập các hợp chất.

26
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài V. amygdalina
Cặn ethyl acetate (VAE, 31 g) được tẩm với silica gel rồi đưa lên cột
sắc ký pha thường với hệ dung môi rửa giải gradient
dichloromethane/methanol (100/1 → 1/1, v/v) thu được 5 phân đoạn, VAE1-
VAE5. Phân đoạn VAE1 được phân tách trên cột sắc ký pha đảo với hệ dung
môi rửa giải methanol/nước (4/1, v/v/) thu được phân đoạn nhỏ hơn VAE1.1.
Tiếp tục tinh chế phân đoạn VAE1.1 trên cột sắc ký pha thường với dung môi
rửa giải dichloromethane/methanol/nước (20/1/0,05, v/v) thu được hợp chất
VA1 (2 mg). Hợp chất VA6 (2 mg) thu được khi phân tách phân đoạn VAE2
trên sắc ký cột RP-18 với hệ dung môi methanol/nước (3/1, v/v). Tiếp tục
phân tách phân đoạn VAE3 trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi rửa
giải ethyl acetate/methanol (20/1, v/v) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn
VAE3.1-VAE3.3. Hợp chất VA2 (9 mg) thu được khi tinh chế phân đoạn
VAE3.2 trên cột sắc ký pha đảo RP-18 với dung môi rửa giải methanol/nước
(2/1, v/v). Tương tự, các hợp chất VA3 (15 mg), VA4 (2 mg) và VA5 (17 mg)
2.3.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ các hợp chất
2.3.2.1. Hợp chất VA1: (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy-7,8,9,11-
tetradehydro-3β-16α,21,24-tetrahydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5α-stigmastane
Chất bột màu trắng, vô định hình.

27
25
: +78,1 (c = 0,12, MeOH)
Độ quay cực D
Công thức phân tử: C30H46O7. Khối lượng phân tử: 518
ESI-MS: m/z 553.4 [M + Cl]-
Số liệu phổ 1
H và 13
C-NMR xem bảng 3.1
2.3.2.2. Hợp chất VA2: vernoniacum B
Chất bột màu trắng, vô định hình.
Độ quay cực 25D : +39,3 (c = 0,1, MeOH)
Công thức phân tử: C38H58O13. Khối lượng phân tử:
722 Số liệu 1
H và 13
2.3.2.3. Hợp chất VA3: vernoamyoside E (chất mới)
Chất bột màu trắng, vô định hình
25
: +27,4 (c = 0,15, MeOH)
Độ quay cực D
Công thức phân tử: C36H56O11. Khối lượng phân tử: 664
HR-ESI-MS: m/z 687,3708 [M+Na]+
Số liệu 1
H và 13
2.3.2.4. Hợp chất VA4: vernonioside B1
25
: +32,1 (c = 0,11, MeOH)
Độ quay cực D
632 Số liệu 1
H và 13
2.3.2.5. Hợp chất VA5: vernonioside B2
Độ quay cực
25
: +38,4 (c = 0,15, MeOH)
D
674 Số liệu 1
H và 13
2.3.2.6. Hợp chất VA6: (23S,24R,28S)-3β,22α-dihydroxy-7,8,9,11-
tetradehydro-24,28-epoxy-5α-stigmastane-21,23-carbolactone

28
Độ quay cực 25
D : +57,0 (c = 0,14, MeOH)
470 Số liệu 1
H và 13

29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP
ĐƯỢC
3.1.1. Hợp chất VA1: (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy-7,8,9,11-
stigmastane
Hợp chất VA1 thu được dưới dạng chất bột, màu trắng. Độ quay cực
25
: +78,1 (c = 0,12, MeOH). Trên phổ
1
H-NMR (Bảng 3.1) của VA1 xuất
D
hiện tín hiệu của ba nhóm methyl singlet tại δH 0,61 (3H, s, H-18), 0,93 (3H, s,
H-19), 1,45 (3H, s, H-29); hai nhóm methyl doublet tại δH 0,95 (6H, d, J = 6,5
Hz, H-26, H-27); một nhóm methoxy tại δH 3,22 (3H, s, 28-OCH3); hai proton
olefin tại δH 5,44 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-7) và 5,57 (1H, d, J = 5,5 Hz, H-11) và
tín hiệu multiplet đặc trưng của H-3 tại δH 3,53 (1H, m, H-3). Trên phổ 13
C-
NMR (Bảng 3.1) của VA1 quan sát thấy tín hiệu của 30 carbon, bao gồm một
nhóm methoxy (δC 48,5) và 29 carbon thuộc phần khung chất. Các tín hiệu của
hai carbon bậc bốn tại δC 136,5 (C-8), 145,1 (C-9), hai carbon bậc ba tại δC
122,1 (C-7), 119,4 (C-11) và hai nhóm methyl tại δC 12,9 (C-18), 19,8 (C-19)
cùng với tín hiệu của hai proton olefin tại δH 5,43 (H-7), 5,53 (H-
11) cho phép xác định sự có mặt của hai nối đôi liên hợp tại C-7/C-8/C-9/C-11 ở
phần khung chất [47, 64]. Từ các bằng chứng phổ trên, hợp chất VA1 được xác
định có cấu trúc Δ7,9(11)
dienstigmanstane [47, 65]. Bên cạnh đó, các
tương tác HMBC giữa H-21 (δH 5,46) với C-20 (δC 48,8)/ C-22 (δC 81,6)/ C-23

30
(δC 91,9), giữa H-22 (δH 4,57) với C-21 (δC 100,0)/ C-23 (δC 91,9), giữa H-
23 (δH 4,58) với C-21 (δC 100,0)/ C-24 (δC 83,1) cho thấy phần chuỗi bên
cạnh có mặt hai vòng furan được nối với nhau tại C-22 và C-23. Các tín hiệu
proton tại δH 0,95 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-26), 0,95 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-27),
1,45 (3H, s, H-29) và 2,06 (1H, m, H-25) cùng với giá trị độ dịch chuyển hóa
học của ba nhóm methyl tại δC 17,4 (C-26), 18,1 (C-27), 17,4 (C-29) và nhóm
methine tại δC 33,1 (C-25) cho thấy sự có mặt của một nhóm isopropyl và
một nhóm methyl. Vị trí của hai nhóm này tại C-24 và C-28 lần lượt được xác
định dựa vào tương tác HMBC giữa H-26/H-27 (δH 0,95) với C-24 (δC 83,1)
và H-29 (δH 1,45) với C-28 (δC 114,1). Ngoài ra, tương tác HMBC proton của
nhóm methoxy (δH 3,22) với C-28 (114,1) xác định vị trí của nhóm methoxy
tại C-28. Từ những phân tích trên hợp chất VA1 được xác định là 28-
methoxy-7,8,9,11-tetradehydro-3,16,21,24-tetrahydroxy-21,23:22,28-
diepoxystigmastane. So sánh số liệu phổ NMR của VA1 với phần aglycone
của hợp chất vernonioside B2 [66] cho thấy số liệu phổ hoàn toàn phù hợp.
Điều này cho phép khẳng định VA1 là (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy-
7,8,9,11-tetradehydro-3β-16α,21,24-tetrahydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5α-
stigmastane. Theo nghiên cứu của Mitsuo Jisaka và cộng sự, hợp chất này thu
được khi thủy phân vernonioside B2[66]. Tuy nhiên, đây là lần đầu tiên hợp
chất (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy-7,8,9,11-tetradehydro-3β-16α,21,24-
tetrahydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5α-stigmastane được phân lập từ tự nhiên.
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất VA1 và hợp chất tham khảo
C δC
#
δCa,b δH
a,c
(mult., J in Hz)
1 35,2 35,3 1,81 (m); 1,93(m)
2 32,5 32,4 1,50 (m); 1,87 (m)
3 70,2 71,4 3,54 (m)
4 38,8 38,5 1,31(m); 1,72 (brd 12,0)
5 39,6 40,6 1,45(m)
6 30,4 31,0 1,92(m)

31
7 121,5 122,1 5,45 (d, 5,0)
8 135,0 136,7 -
9 144,2 145,1 -
10 36,2 37,0 -
11 118,6 119,4 5,56 (d, 6,5)
12 41,8 42,5 2,04 (m); 2,28 (dd, 4,0; 10,5)
13 43,7 44,3 -
14 49,2 49,7 2,58 (m)
15 35,3 36,0 1,37 (dd, 3,0; 13,5);
2,00 (dd, 3,0; 13,5)
16 76,3 77,3 4,34 (t, 7,0)
17 56,1 56,3 2,07 (dd, 2,5, 6,5)
18 14,6 14,5 0,61 (s)
19 19,7 19,8 0,93 (s)
20 48,6 48,8 2,23 (t, 5,0)
21 99,2 100.0 5.46 (brs)
22 81,0 81.6 4.57 (t, 5.5)
23 91,2 91,9 4,58 (brs)
24 82,0 83,1 -
25 32,4 33,1 2,06 (m)
26 17,5 17,4 0,95 (d, 6,5)
27 18,5 18,1 0,95 (d, 6,5)
28 113,4 114,1 -
29 17,5 17,4 1,45 (s)
OCH3 48,5 48,5 3,22 (s)
a)
đo trong CD3OD, b)
đo tại 125 MHz, c)
đo tại 500 MHz, #)
δC của hợp chất tham khảo [66].

32
3.1.2. Hợp chất VA2: vernoniacum B
Hợp chất VA2 thu được dưới dạng chất bột, màu trắng. Độ quay cực 25 :
D
+39,3 (c = 0,1, MeOH). Trên phổ 1
H-NMR của VA2 xuất hiện tín hiệu của ba
nhóm methyl singlet tại δH 0,64 (3H, s, H-18), 0,94 (3H, s, H-19), 1,42 (3H, s,
H-29); hai nhóm methyl doublet tại δH 0,93 (3H, d, J = 4,0 Hz, H-26), 0,96
(3H, d, J = 6,5 Hz, H-27); một nhóm methoxy tại δH 3,16 (3H, s, 28-OCH3);
hai proton olefin tại δH 5,44 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-7) và 5,57 (1H, d, J = 5,5
Hz, H-11); một proton anome tại δH 4,42 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′) và tín hiệu
multiplet đặc trưng của H-3 tại δH 3,53 (1H, m, H-3). Trên phổ 13
C-NMR của
VA2 quan sát thấy tín hiệu của 38 carbon, bao gồm sáu carbon của một phân
tử đường, hai carbon của một nhóm acetyl (δC 172,7, 21,9), một nhóm
methoxy (δC 48,5) và 29 carbon thuộc phần khung chất. Số liệu phổ NMR của
VA2 khá giống với VA1 ngoại trừ sự có mặt nhiều hơn các tín hiệu của một
phần đường O-β-D-glucopyranosyl tại C-3 và một nhóm acetyl tại C-16. Vị trí
của hai nhóm này được xác định dựa vào tương tác HMBC giữa proton
anome H-1′ (δH 4,42) với C-3 (δC 78,9) và H-16 (δH 5,27) với nhóm acetyl
(δC 172,7). Từ những phân tích trên kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo
cho phép khẳng định VA2 là vernoniacum B. Hợp chất này được phân lập lần
đầu tiên từ loài V. cumingiana[67]. Tuy nhiên đây là lần đầu tiên hợp chất
vernoniacum B được phân lập từ loài V. amygdalina.

33
C δC
#
δCa,b δH
a,c
(mult., J in Hz)
1 35,3 35,4 1,35 (m); 2,01 (m)
2 30,5 30,6 1,53 (m); 1,99 (m)
3 77,4 78,9 3,53 (m)
4 38,4 35,0 1,33 (m); 1,88 (m)
5 39,5 40,5 1,41 (m)
6 30,5 31,0 1,31 (m); 1,95 (m)
7 122,1 122,4 5,44 (d, 4,5)
8 135,4 136,3 -
9 144,3 145,0 -
10 36,5 37,1 -
11 119,1 119,6 5,57 (d, 5,5)
12 42,4 42,8 2,03 (m); 2,15 (m)
13 43,5 43,8 -
14 49,3 49,5 2,19 (m)
15 35,2 36,0 1,38 (m); 2,01 (m)
16 78,8 79,8 5,27 (m)
17 48,6 48,6 3,17 (m)
18 14,7 14,5 0,64 (s)
19 19,8 19,8 0,94 (s)
20 49,4 49,5 2,51 (m)
21 99,4 100,0 5,44 (d, 4,5)
22 80,4 80,7 4,31 (t, 6,0)
23 92,1 92,4 4,53 (d, 6,0)
24 82,3 83,0 -
25 32,8 33,1 2,02 (m)
26 17,7 17,5 0,93 (d, 4,0)
27 18,9 18,2 0,96 (d, 6,5)
28 113,1 113,4 -

34
29 17,9 17,4 1,42 (s)
1 102,7 102,4 4,42 (d, 8,0)
2 75,7 75,2 3,17 (m)
3 79,0 78,1 3,34 (m)
4 72,1 71,7 3,38 (m)
5 78,9 77,9 3,29 (m)
6 63,3 62,8 3,57 (dd, 5,0; 11,5)
3,87 (brd, 11,5)
16-OCOCH3 170,9 172,7 -
16-OCOCH3 22,2 21,9 2,06 (s)
OCH3 51,6 48,5 3,16 (s)
a) đo trong CD3OD, b)
δC của hợp chất vernoniacum
B [67].
3.1.3. Hợp chất VA3: vernoamyoside E (chất mới)
Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất VA3 và hợp chất tham khảo (VA2)
25 : +27,4 (c = 0,15, MeOH). Công thức phân tử của VA3 được xác định là D
C36H56O11 bởi sự xuất hiện của píc ion giả phân tử [M+Na]+
tại m/z
687,3708 trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (tính toán lý thuyết
cho công thức [C36H56O11Na]+
: 687,3720).

35
Hình 3.4. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VA3
Trên phổ 1
H-NMR (Bảng 3.3) của VA3 xuất hiện tín hiệu của ba nhóm
methyl singlet tại δH 0,57 (3H, s, H-18), 0,93 (3H, s, H-19), 1,42 (3H, s, H-
29); hai nhóm methyl doublet tại δH 0,94 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-26), 0,95 (3H,
d, J = 7,0 Hz, H-27); một nhóm methoxy tại δH 3,21 (3H, s, 28-OCH3); hai
proton olefin tại δH 5,43 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-7), 5,53 (1H, d, J = 5,5 Hz, H-
11); một proton anome tại δH 4,42 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′) và một proton tín
hiệu multiflet đặc trưng của H-3 tại δH 3,71 (m).
Hình 3.5. Phổ 1
H-NMR của hợp chất VA3

36
Phân tích các tính hiệu trên phổ 13
C-NMR, HSQC của VA3 quan sát
thấy tín hiệu của 36 carbon bao gồm 29 carbon thuộc phần khung steroid, lớp
chất chính trong thành phần hóa học của loài V. amygdalina; một carbon
thuộc nhóm methoxy và sáu carbon đặc trưng của phần đường glucopyranosyl
(Bảng 3.3). Các tín hiệu của hai carbon bậc bốn tại δC 137,2 (C-8), 144,8 (C-
9) và hai carbon bậc ba tại δC121,4 (C-7), 119,5 (C-11) cùng với tín hiệu của
hai proton olefin tại δH 5,43 (H-7), 5,53 (H-11) cho phép xác định sự có mặt
của hai nối đôi liên hợp tại C-7/C-8/C-9/C-11 ở phần khung chất [47, 64].
Bên cạnh đó, phần khung của VA3 còn có mặt hai nhóm methyl tại δC 12,9
(C-18), 19,8 (C-19). Từ các bằng chứng phổ trên, cấu trúc hóa học của hợp
chất VA3 được dự đoán là Δ7,9(11)
dienstigmanstane glycoside [47, 65].
Hình 3.6. Phổ 13
C-NMR của hợp chất VA3

37
Hình 3.7. Phổ HSQC của hợp chất VA3
Hình 3.8. Các tương tác HMBC chính của hợp chất VA3
Vị trí của hai nhóm methyl ở phần khung chất tại C-10 và C-13 khẳng
định lại dựa vào tương tác HMBC giữa H-19 (δH 0,93) với C-1 (δC 35,8)/ C-5
(δC 40,1)/ C-12 (δC 41,9)/ C-10 (δC 36,8) và H-18 (δH 0,57) với C-12 (δC 41,9)/
C-13 (δC 42,7)/ C-14 (δC 51,9)/ C-17 (δC 45,4). Bên cạnh đó, tương tác HMBC
giữa H-20 (δH 1,95) với C-21 (δC 100,0)/ C-22 (δC 81,0), giữa H-21 (δH 5,43)

38
với C-22 (δC 81,0)/ C-23 (δC 91,3), giữa H-22 (δH 4,26) với C-21 (δC 100,0)/ C-
23 (δC 91,3), giữa H-23 (δH 4,45) với C-21 (δC 100,0)/ C-24 (δC 83,2)/ C-28 (δC
112,9) cho thấy phần này có mặt hai vòng furan được nối với nhau tại C-
22 và C-23. Hơn nữa, các tín hiệu proton tại δH 0,94 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-
26), 0,95 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-27), 1,42 (3H, s, H-29) và 2,02 (1H, m, H-25)
cùng với giá trị độ dịch chuyển hóa học của ba nhóm methyl tại δC 17,4 (C-
26), 18,1 (C-27), 17,4 (C-29) và nhóm methine tại δC 32,7 (C-25) cho thấy sự
có mặt của một nhóm isopropyl và một nhóm methyl. Vị trí của hai nhóm này
tại C-24 và C-28 lần lượt được xác định dựa vào tương tác HMBC giữa H-26
(δH 0,94)/ H-27 (δH 0,95) với C-24 (δC 83,2) và H-29 (δH 1,42) với C-28 (δC
112,9). Vị trí của phần đường tại C-3 và nhóm methoxy tại C-28 lần lượt
được xác định dựa vào tương tác HMBC giữa C-3 (δC 78,9) với carbon anome
H-1′ (δH 4,42 ) và proton của nhóm methoxy (δH 3,21) với C-28 (δC 112,9).
Hình 3.9. Phổ HMBC của hợp chất VA3
Số liệu phổ NMR của VA3 và hợp chất VA2 khá giống nhau ngoại trừ
sự chuyển dịch về vùng trường cao của tín hiệu C-16 (δC 28,0) của VA3 so
với tín hiệu C-16 (δC 76,2) của hợp chất VA2 trên phổ 13
C-NMR. Điều này
cho thấy, cấu trúc của VA3 hoàn toàn giống VA2 ngoại trừ sự thiếu vắng

39
nhóm acetyl tại vị trí C-16. Ngoài ra, trên phổ NOESY của VA3 quan sát thấy
tín hiệu tương tác giữa H-20 với H-21/H-22; H-22 tương tác với H-23/OCH3;
H-23 tương tác với H-27 của nhóm isopropyl cho thấy các hydrogen tại C-20,
C-21, C-22, C-23, OCH3, và nhóm isopropyl đều định hướng β. Hơn nữa, kết
quả thủy phân VA3 trong môi trường acid thu được đường β-glucose (so sánh
trên HPLC với các đường chuẩn L-glucose và D-glucose) cùng với hằng số
tương tác của proton anome, JH-1ʹ/H-2ʹ = 8,0 cho phép xác định phần đường
của VA3 là O-β-D-glucopyranosyl. Từ những phân tích, cấu trúc hóa học của
VA3 được xác định là (22R,23S,24R,28S)-3β-D-glucosyl-28-methoxy-
7,8,9,11-tetradehydro-21,24-dihydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5α-stigmastane.
Tra cứu trên cơ sở dữ liệu scifinder cho phép khẳng định đây là hợp chất mới.
Hợp chất này được đặt tên là vernoamyoside E.
Hình 3.10. Phổ NOESY của hợp chất VA3

40
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất VA3 và hợp chất tham khảo (VA2)
C δC
#
δCa,b δH
a,c
(mult., J in Hz)
1 35,4 35,8 1,34 (m); 1,99 (m)
2 30,6 30,8 1,93 (m)
3 78,9 78,9 3,71 (m)
4 35,0 34,8 1,32 (m); 1,88 (m)
5 40,5 40,1 1,41 (m)
6 31,0 30,3 1,61 (m); 1,97 (m)
7 122,4 121,4 5,43 (d, 5,0)
8 136,3 137,2 -
9 145,0 144,8 -
10 37,1 36,8 -
11 119,6 119,5 5,53 (d, 5,5)
12 42,8 41,9 2,04 (m), 2,22 (m)
13 43,8 42,7 -
14 49,5 51,9 2,26 (m)
15 36,0 24,2 1,49 (m); 1,86 (m)
16 79,8 28,0 1,53 (m); 2,18 (m)
17 48,6 45,4 2,08 (m)
18 14,5 12,9 0,57 (s)
19 19,8 19,8 0,93 (s)
20 49,5 50,2 1,95 (m)

41
21 100,0 100,0 5,43 (d, 5,0)
22 80,7 81,0 4,26 (t, 5,5)
23 92,4 91,3 4,45 (d, 5,5)
24 83,0 83,2 -
25 33,1 32,7 2,20 (m)
26 17,5 17,4 0,94 (d, 7,0)
27 18,2 18,1 0,95 (d, 7,0)
28 113,4 112,9 -
29 17,4 17,4 1,42 (s)
1 102,4 102,6 4,42 (d, 8,0)
2 75,2 74,8 3,18*
3 78,1 77,4 3,29 (ddd, 2,5; 5,0, 9,5)
4 71,7 71,4 3,32*
5 77,9 77,7 3,39 (t, 9,0)
6 62,8 62,6 3,70 (dd, 5,5; 12,0)
3,87 (dd, 2,5; 12,0)
28-OCH3 48,5 48,3 3,21 (s)
16-OC OCH3 172,7 - -
16-OCOC H3 21,9 - -
a)
đo trong CD3OD & CDCl3, b)
δC của hợp chất tham khảo VA2

42
Hình 3.11. HPLC của VA3 sau khi được acid hóa
3.1.4. Hợp chất VA4: vernonioside B1
25D : +32,1 (c = 0,11, MeOH). Trên phổ 1
hiện tín hiệu của năm nhóm methyl tại δH 0,60 (s, H-18), 0,93 (s, H-19), 1,20

43
(d, J = 7,0 Hz, H-26), 1,14 (d, J = 7,5 Hz, H-27), 1,37 (d, J = 5,5 Hz, H-29), hai
proton olefin tại δH 5,41 (brs, H-7), 5,55 (d, J = 6,5 Hz, H-11), tín hiệu của một
proton anome tại δH 4,42 (d, J = 8,0 Hz, H-1′) và tín hiệu multiflet đặc trưng của
H-3 tại δH 3,67. Bên cạnh đó, trên phổ 13
C-NMR (Bảng 3.4) của VA4 xuất hiện
tín hiệu của 35 carbon ba gồm sáu carbon của phần đường và
29 carbon của phần khung chất. Số liệu phổ NMR của VA4 khá giống với các
hợp chất VA1, VA2, VA3 cho phép dự đoán hợp chất này là C29-steroid với
cấu trúc khung stigmanstane. So sánh giá trị phổ VA4 với hợp chất
vernonioside B1 [52] cho thấy số liệu phổ hoàn toàn phù hợp. Điều này cho
phép khẳng định hợp chất VA4 là vernonioside B1.
C δC
#
δCa,b δH
a,c
(mult., J in Hz)
1 35,01 35,9 1,35 (m); 2,00 (m)
2 30,15 30,5 1,61 (m); 1,99 (m)
3 78,56 79,1 3,67 (m)
4 34,54 35,1 1,35 (m); 1,88 (m)
5 39,25 40,4 1,42 (m)
6 30,27 30,9 1,92 (m)
7 120,68 121,1 5,41 (brs)
8 136,53 137,5 -
9 143,84 144,8 -
10 36,12 36,9 -
11 119,75 120,4 5,55 (d, 6,5)
12 41,16 42,6 2,17 (m), 2,76 (m)
13 42,63 43,2 -
14 51,93 52,6 2,29 (brs)
15 23,51 24,1 1,50 (m); 1,83 (m)
16 28,08 28,4 1,51 (m); 2,19 (m)
17 45,81 46,2 2,02 (m)
18 12,68 12,6 0,60 (s)

44
19 19,52 19,8 0,93 (s)
20 51,01 51,3 2,74 (dd, 4,0; 8,0)
21 176,36 177,6 -
22 77,04 73,7 4,44 (dd, 2,5; 4,0)
23 80,11 80,4 4,69 (d, 2,5)
24 63,81 65,4 -
25 30,33 30,8 1,87 (m)
26 18,49 18,4 1,20 (d, 7,0)
27 18,65 18,5 1,14 (d, 7,5)
28 56,17 57,5 3,38 (m)
29 13,19 13,1 1,37 (d, 5,5)
1 102,28 102,3 4,42 (d, 8,0)
2 75,34 75,0 3,20 (dd, 8,0; 9,0)
3 78,64 78,6 3,70 (m)
4 71,74 71,8 3,35 (m)
5 77,07 78,1 3,37 (m)
6 62,88 62,9 3,71 (dd, 5,0; 12,0)
3,86 (dd, 2,5; 12,0)
a)
đo trong CD3OD, b)
δC của hợp chất vernonioside B1.
3.1.5. Hợp chất VA5: vernonioside B2

45
25
: +38,4 (c = 0,15, MeOH). Trên phổ
1
D
hiện tín hiệu của ba nhóm methyl singlet tại δH 0,60 (3H, s, H-18), 0,94 (3H,
s, H-19) và 0,95 (3H, s, H-29); hai nhóm methyl doublet ại δH 0,95 (3H, d, J
= 7,0 Hz, H-26) và 0,98 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-27); một nhóm methoxy tại δH
3,16 (3H, s, 28-OCH3); hai proton olefin tại δH 5,44 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-7)
và 5,57 (1H, d, J = 5,5 Hz, H-11); một proton anome tại δH 4,43 (1H, d, J =
8,0 Hz, H-1′) và tín hiệu multiplet đặc trưng của H-3 tại δH 3,73 (1H, m, H-3).
Trên phổ 13
C-NMR (Bảng 3.5) của VA5 quan sát thấy tín hiệu của 36 carbon,
bao gồm sáu carbon của một phân tử đường, một nhóm methoxy (δC 48,5) và
29 carbon thuộc phần khung chất. Số liệu phổ NMR của VA5 khá giống với
VA2 ngoại trừ sự thiếu vắng tín hiệu của một nhóm acetyl tại C-16 so với
VA2 cùng với sự dịch chuyển về vùng trường cao trên phổ 13
C-NMR của tín
hiệu C-16 của VA5 (δC 77,3) so với VA2 (δC 79,8) cho thấy nhóm thế tại C-
16 của VA5 phải là hydroxy. Từ những bằng chứng phổ trên, hợp chất VA5
được xác định là vernonioside B2. Kết luận trên còn được khẳng định lại dựa
vào kết quả so sánh số liệu phổ NMR của VA5 với hợp chất vernonioside B2
[53] theo công bố trước đây.
C δC
#
δCa,b δH
a,c
(mult., J in Hz)
1 34,9 35,0 1,34 (m), 1,91 (m)
2 30,1 30,6 1,62 (m); 2,00 (m)
3 77,0 78,9 3,73 (m)
4 34,5 35,3 1,82 (m); 1,96 (m)
5 39,1 40,5 1,43 (m)
6 30,2 31,0 1,30 (m); 1,95 (m)
7 121,3 122,1 5,46 (d, 5,0)
8 135,8 136,7 -
9 144,1 145,1 -

46
10 36,2 37,1 -
11 118,6 119,4 5,56 (d, 6,0)
12 41,7 42,5 2,05 (m); 2,28 (m)
13 43,6 44,3 -
14 49,1 49,5 2,57 (m)
15 35,2 36,0 1,37 (m); 2,00 (m)
16 76,2 77,3 4,43 (t, 7,0)
17 56,0 56,3 2,08 (m)
18 14,5 14,6 0,60 (s)
19 19,5 19,8 0,94 (s)
20 48,5 49,0 2,23 (m)
21 99,1 100,0 5.46 (d, 5.0)
22 81,0 81,6 4,56 (dd, 6,0; 6,5)
23 90,1 91,8 4,58 (d, 6,5)
24 82,0 83,1 -
25 32,4 33,1 2,07 (m)
26 17,4 17,4 0,95 (d, 7,0)
27 18,5 18,1 0,98 (d, 6,5)
28 113,3 114,1 -
29 17,4 17,4 0,95 (s)
1 102,3 102,4 4,43 (d, 8,0)
2 75,3 75,2 3,17 (dd, 8,0; 9,0)
3 78,6 78,1 3,38 (t, 9,0)
4 71,8 71,7 3,30 (m)
5 78,4 77,9 3,31 (m)
6 62,9 62,8 3,68 (dd, 5,0; 12,0)
3,88 (dd, 2,5; 12,0)
OCH3 48,5 48,5 3,24 (s)
a)
đo trong CD3OD, b)
δC của hợp chất vernonioside B2 [53].

47
3.1.6. Hợp chất VA6: (23S,24R,28S)-3β,22α-dihydroxy-7,8,9,11-
tetradehydro-24,28-epoxy-5α-stigmastane-21,23-carbolactone
25
: +57,0 (c = 0,14, MeOH). Trên phổ
1
D
hiện tín hiệu của năm nhóm methyl tại δH 0,61 (s, H-18), 0,94 (s, H-19), 1,20
(d, J = 7,0 Hz, H-26), 1,15 (d, J = 7,0 Hz, H-27) và 1,37 (d, J = 5,5 Hz, H-29);
hai proton olefin tại δH 5,44 (brs, H-7) và 5,58 (d, J = 6,5 Hz, H-11) và một
proton tín hiệu multiflet đặc trưng của H-3 tại δH 3,53 (m). Bên cạnh đó, trên
phổ 13
C-NMR (Bảng 3.6) của VA6 xuất hiện tín hiệu của 29 carbon gồm:
năm carbon methyl, bảy carbon methylene, 11 carbon methine và sáu carbon
không liên kết trực tiếp với hydro. Số liệu phổ của VA6 khá giống với các
hợp chất VA6 ngoại trừ sự thiếu vắng các tín hiệu thuộc phần đường tại C-3
cùng với sự dịch chuyển về vùng trường cao của tín hiệu C-3 trên phổ 13
C-
NMR của VA6 (δC 71,5) so VA4 (δC 79,1) chỉ ra rằng cấu trúc của VA6 hoàn
toàn giống VA4 ngoài trừ sự thiếu vắng đơn vị đường β-D-glucopyranose tại
C-3. Từ các phân tích trên hợp chất VA6 được xác định là (23S,24R,28S)-
3β,22α-dihydroxy-7,8,9,11-tetradehydro-24,28-epoxy-5α-stigmastane-21,23-
carbolactone là aglycone của hợp chất vernonioside B1. Tra cứu trên cơ sở dữ
liệu Scifinder cho phép khẳng định, đây
là lần đầu tiên hợp chất (23S,24R,28S)-3β,22α-dihydroxy-7,8,9,11-
tetradehydro-24,28-epoxy-5α-stigmastane-21,23-carbolactone được phân lập
từ tự nhiên.

48
C δC
#
δCa,b δH
a,c
(mult., J in Hz)
1 35,30 36,0 1,35 (m); 2,00 (m)
2 32,58 32,3 1,50 (m); 1,86 (m)
3 70,28 71,5 3,53 (m)
4 38,78 38,8 1,31 (m); 1,71 (m)
5 39,73 40,7 1,43 (m)
6 30,39 31,0 1,30 (m); 1,93 (m)
7 120,85 121,3 5,44 (brs)
8 136,59 137,6 -
9 144,08 144,9 -
10 36,17 16,9 -
11 119,76 120,5 5,58 (d, 6,5)
12 42,20 42,8 2,13 (m); 2,82 (m)
13 42,67 43,3 -
14 51,03 51,4 2,86 (dd, 4,0; 10,5)
15 23,55 24,2 1,52 (m); 1,84 (m)
16 28,10 28,5 1,52 (m); 1,80 (m)
17 45,84 46,3 2,00 (m)
18 12,70 12,6 0,61 (s)
19 19,70 19,9 0,94 (s)
20 52,03 52,8 2,28 (m)
21 176,38 177,8 -
22 73,05 73,8 4,42 (dd, 2,5; 4,0)
23 80,11 80,5 4,77 (d, 2,5)
24 63,82 65,2 -
25 30,33 31,0 1,83 (m)
26 18,49 18,4 1,20 (d, 7,0)
27 18,65 18,6 1,15 (d, 7,0)
28 56,18 57,6 2,29 (s)

49
29 13,19 13,1 1,37 (d, 5,5)
đo trong CD3OD,
b)
đo tại 125 MHz,
c)
đo tại 500 MHz,
#)
δC của hợp chất tham khảo phần aglycone của vernonioside B1 [52].
Bảng 3.11. Các hợp chất phân lập được từ loài lá đắng
STT Tên chất, CTPT Cấu trúc
1 Hợp chất VA1:
(22R,23S,24R,28S)-28-
methoxy-7,8,9,11-
tetradehydro-3β-16α,21,24-
tetrahydroxy-21,23:22,28-
diepoxy-5α-stigmastane
CTPT: C30H46O7
M: 518
2 Hợp chất VA2: vernoniacum
B
CTPT: C38H58O13
M: 722
3 Hợp chất VA3:
vernoamyoside E (chất mới)
CTPT: C36H56O11
M: 664

50
4
5
6
Hợp chất VA4: vernonioside
B1
CTPT: C35H52O10
M: 632
Hợp chất VA5: vernonioside
B2
CTPT: C36H52O12
M: 676
Hợp chất VA6:
(23S,24R,28S)-3β,22α-
dihydroxy-7,8,9,11-
tetradehydro-24,28-epoxy-
5α-stigmastane-21,23-
carbolactone
CTPT: C29H42O5
M: 470
3.2. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC
3.2.1. Sàng lọc hoạt tính ức chế các enzyme α-amylase và α-
glucosidase của các hợp chất phân lập được từ cây lá đắng
Kết quả đánh giá sơ bộ hoạt tính chống tiểu đường thông qua ức chế
các enzyme α-amylase và α-glucosidase của ba steroid phân lập được (VA2,
VA3 và VA5) cho thấy ở nồng độ 500 μg/mL, hợp chất VA3 thể hiện hoạt

51
tính ở cả hai enzyme thử nghiệm với giá trị % ức chế lần lượt là 86,01 và
60,03%. Trong khi đó, hai hợp chất VA2 và VA5 thể hiện khả năng ức chế
chọn lọc đối với enzyme α-amylase với giá trị % ức chế lần lượt là 87,31 và
82,02 %.
Bảng 3.12. Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme α-amylase và enzyme α-
glucosidase của các hợp chất
Hợp chất
% Ức chế ở nồng độ 500 μg/mL
enzyme α-amylase enzyme α-glucosidase
VA2 87,31 ± 2,37 21,84 ± 2,47
VA3 86,01 ± 6,33 60,03 ± 3,85
VA5 82,02 ± 0,56 17,72 ± 0,54
Đối chứng * 98,06 ± 0,21 55,01 ± 2,14
* Acarbose: được dùng làm chất đối chứng dương trong các phép sàng
lọc ức chế enzyme α-amylase (100 μg/mL) và enzyme α-glucosidase (500
μg/mL)
3.2.2. Đánh giá hoạt tính ức chế các enzyme α-amylase và α-
glucosidase theo nồng độ của các hợp chất phân lập được
Bảng 3.13. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế các enzyme α-amylase và α-
glucosidase theo nồng độ của các hợp chất phân lập được
Hợp chất
IC50 (μg/mL)
enzyme α-amylase enzyme α-glucosidase
VA2 83,2 ± 2,5 > 500
VA3 102,2 ± 3,8 327,4 ± 7,8
VA5 87,1 ± 2,9 > 500
Đối chứng * 6,3 ± 0,1 450,0 ± 9,6

52
* Acarbose được dùng làm chất đối chứng dương.
Qua kết quả sàng lọc, hợp chất VA3 được lựa chọn để đánh giá hoạt
tính ức chế theo nồng độ trên cả hai enzyme thử nghiệm. Các hợp chất VA2
và VA5 chỉ nghiên cứu đánh giá hoạt tính ức chế theo nồng độ trên enzyme α-
amylase. Kết quả đánh giá cho thấy hai hợp chất VA2 và VA5 có hoạt tính ức
chế mạnh và chọn lọc với enzyme α-amylase với giá trị IC50 từ 83,2 - 87,1
μg/mL. Trong khi đó, hợp chất VA3, một steroid mới được phân lập từ loài lá
đắng (Vernonia amygdalina) có hoạt tính trên cả hai enzyme α-amylase và α-
glucosidase với giá trị IC50 lần lượt là 102,2 và 327,4 μg/mL.

53
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
4.1.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học
Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp, đề tài đã phân lập được 10 hợp
chất từ cao chiết MeOH của cây lá đắng (Vernonia amygdalina). Cấu trúc hóa
học của 10 hợp chất cũng đã được xác định bằng các phương pháp phổ hiện
đại như phổ khối lượng (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1D-, 2D-
NMR) và độ quay cực ([α]D
25
). Trong đó, có 1 hợp chất mới và 9 hợp chất đã
biết, cụ thể :
- Hợp chất steroid mới: vernoamyoside E (VA3);
- 2 hợp chất steroid lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên:
(22R,23S,24R,28S)-28-methoxy-7,8,9,11-tetradehydro-3β-16α,21,24-
tetrahydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5α-stigmastane (VA1) và (23S,24R,28S)-
3β-2α-dihydroxy-7,8,9,11-tetradehydro-24,28-epoxy-5α-stigmastane-21,23-
carbolactone (VA6)
- 7 hợp chất đã biết khác. Bao gồm 3 steroid, vernoniacum B (VA2),
vernonioside B1 (VA4) và vernonioside B2 (VA5).
4.1.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học
Đã nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme α-amylase và enzyme α-
glucosidase của 3 chất sạch phân lập được (VA2, VA3 và VA5). Kết quả cho
thấy hợp chất VA3 thể hiện hoạt tính ức chế cả enzyme α-glucosidase và
enzyme α-amylase với giá trị IC50 lần lượt là 102,2 và 327,4 μg/mL. Trong
khi đó, hợp chất VA2 và VA5 lại thể hiện hoạt tính ức chế chọn lọc đối với
enzyme α-amylase giá trị IC50 lần lượt là 83,2 và 87,1 μg/mL.
4.2. KIẾN NGHỊ
Từ các kết quả nghiên cứu ban đầu về thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học của các loài Vernoina amygdalina, chúng tôi nhận thấy các steroid
phân lập được thể hiện hoạt tính ức chế enzyme α-amylase và enzyme α-
glucosidase tốt, đặc biệt là hợp chất vernoamyoside E (VA3) thể hiện hoạt

54
tính ức chế với cả hai enzyme α-amylase và α-glucosidase. Vì vậy, cần có
thêm những nghiên cứu sâu hơn nữa về cơ chế ức chế enzyme của hợp chất
này. Ngoài ra, các thử nghiệm in vivo trên các mô hình động vật cũng cần
được nghiên cứu để để từ đó định hướng phát triển thành các sản phẩm phục
vụ cho việc hỗ trợ nâng cao sức khỏe và phòng ngừa, điều trị căn bệnh tiểu
đường.

55
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
1. Hoang Le Tuan Anh, Le Ba Vinh, Le Thi Lien, Pham Viet Cuong,
Masayoshi Arai,Tran Phuong Ha, Hoang Ngoc Lin,Ton That Huu Đat,
Le Canh Viet Cuong, Young Ho Kim. In vitro study on α-amylase
inhibitory and α-glucosidase of a new stigmastane-type steroid saponin
from the leaves of Vernonia amygdalina. Natural Product Research,
2019 DOI: 10.1080/14786419.2019.1607853.
2. Hoang Le Tuan Anh, Le Thi Lien, Pham Viet Cuong, Masayoshi
Arai,Tran Phuong Ha, Ton That Huu Dat, Le Canh Viet Cuong. Sterols
and flavone from the leaves of Vernonia amygdalina growing in Thua
Thien Hue. Vietnam Journal of Science and Technology, 2018, 56(6):
681-687.

56
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hoffstad, O., et al., 2015, Diabetes, Lower-Extremity Amputation, and
Death. Diabetes Care, 38(10), p, 1852.
2. Chi, V.V., 2012, Từ điển cây thuốc Việt Nam.
3. Frost, D.J. and J.P. Ward, 1968, Stereochemistry of 7,24(28)-
stigmastadien-3β-ol and the fucosterols. Tetrahedron Letters, 9(34), p,
3779-3782.
4. Frost, D.J. and J.P. Ward, 1970, Sterols in Vernonia anthelmintica seed
8,14,(Z)-24(28)stigmastatrienol, a new phytosterol. Recueil des
Travaux Chimiques des Pays-Bas, 89(10), p, 1054-1056.
5. Frost, D.J. and J.P. Ward, 1970, Sterols in Vernonia anthelmintica seed,
Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas, 1970. 89(2), p,186-192.
6. Fioriti, J.A., M.G. Kolor, and R.P. McNaught, New sterol from
Vernonia anthelmintica seed oil, Tetrahedron Letters, 34, p, 2791-2794.
7. Akihisa, T., et al., 1992, 4α-methylvernosterol and other sterols from
Vernonia anthelmintica seeds, Phytochemistry, 31(5), p, 1759-1763.
8. Tian, G., et al., 2004, Separation of flavonoids from the seeds of
Vernonia anthelmintica Willd by high-speed counter-current
chromatography, Journal of Chromatography A, 1049(1), p, 219-222.
9. Fatima, S.S., et al., 2010, Antidiabetic and antihyperlipidemic activity
of ethyl acetate: Isopropanol (1:1) fraction of Vernonia anthelmintica
seeds in Streptozotocin induced diabetic rats, Food and Chemical
Toxicology, 48(2), p, 495-501.
10. Liu, Y., et al., 2010, Vernodalidimers A and B, novel orthoester
elemanolide dimers from seeds of Vernonia anthelmintica, Tetrahedron
Letters, 51(50), p, 6584-6587.
11. Hua, L., et al., 2012, Biologically active steroids from the aerial parts
of Vernonia anthelmintica Willd, Fitoterapia, 83(6), p, 1036-1041.
12. Hua, L., et al., 2012, Highly oxygenated stigmastane-type steroids from
the aerial parts of Vernonia anthelmintica Willd, Steroids, 77(7), p,
811-818.
13. Zhang, L., et al., 2014, Guaianolides and elemanolides from Vernonia
anthelmintica, Phytochemistry Letters, 7, p, 14-18.
14. Turak, A., Y. Liu, and H.A. Aisa, 2015, Elemanolide dimers from seeds
of Vernonia anthelmintica, Fitoterapia, 104, p, 23-30.
15. Ito, T., et al., 2016, New sesquiterpene lactones, vernonilides A and B,
from the seeds of Vernonia anthelmintica in Uyghur and their
antiproliferative activities, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,
26(15), p, 3608-3611.

57
16. Turak, A., et al., 2017, Pseudo-disesquiterpenoids from seeds of
Vernonia anthelmintica and their biological activities, Phytochemistry
Letters, 21, p, 163-168.
17. Saluja, K.I.K. and V.K. Saxene, 1979, Antibacterial activity of essential
oils from Vernonia anthelmintica and Viola cinerea, Indian Drugs &
Pharmaceuticals Industry, 14(2), p, 29-30.
18. Lambertini, E., et al., 2004, Effects of extracts from Bangladeshi
medicinal plants on in vitro proliferation of human breast cancer cell
lines and expression of estrogen receptor alpha gene, International
Journal of Oncology, 24, p, 419-423.
19. Jamil, S., et al., 2017, Evaluation of anti-inflammatory and anti-oxidant
potential of seed extracts of Vernonia anthelmintica, Pakistan journal
of pharmaceutical sciences, 30(3), p, 755-760.
20. Jamil , S., R.A. Khan, and S. Ahmed, 2018, In vivo evaluation of
antihyperlipidemic, antihyperglycemic and hepatoprotective effects of
Vernonia anthelmintica seeds in diet model, Pakistan journal of
pharmaceutical sciences, 31(3), p, 813-820.
21. Gunasingh, C., G. Barnabas, and S. Nagarajan, 1981, Flavonoids of the
flowers of Vernonia cinerea, Indian Journal of Pharmaceutical
Sciences, 43(3), p, 114-118.
22. Misra, T.N., et al., 1984, Isolation of a natural sterol and an aliphatic
acid from Vernonia cinerea, Phytochemistry, 23(2), p, 415-417.
23. Misra, T.N., et al., 1984, Chemical constituents of Vernonia cinerea,
Part I. Isolation and spectral studies of triterpenes, Journal of Natural
Products, 47(2), p, 368-372.
24. Misra, T.N., et al., 1993, A new triterpenoidal from Vernonia cinerea,
Planta Med, 59(5), p, 458-460.
25. Tandon, M. and Y.N. Shukla, 1995, Some chemical constituents from
Vernonia cinerea, Indian Drugs 32(3), p, 132-133.
26. Kuo, Y.-H., et al., 2003, Two novel sesquiterpene lactones, cytotoxic
vernolide-A and -B, from Vernonia cinerea, Chemical and
Pharmaceutical Bulletin, 51(4), p, 425-426.
27. Pratheeshkumar, P. and G. Kuttan, 2011, Effect of vernolide-A, a
sesquiterpene lactone from Vernonia cinerea L., on cell-mediated
immune response in B16F-10 metastatic melanoma-bearing mice,
Immunopharmacology and Immunotoxicology, 33(3), p, 533-538.
28. Youn, U.J., et al., 2012, Anti-inflammatory sesquiterpene lactones from
the flower of Vernonia cinerea, Bioorganic & Medicinal Chemistry
Letters, 22(17), p, 5559-5562.

58
29. Youn, U.J., et al., 2014, Bioactive sesquiterpene lactones and other
compounds isolated from Vernonia cinerea, Fitoterapia, 93, p, 194-
200.
30. Pouyfung, P., et al., 2019, Anti-proliferative effect of 8α-
tigloyloxyhirsutinolide-13-O-acetate (8αTGH) isolated from Vernonia
cinerea on oral squamous cell carcinoma through inhibition of STAT3
and STAT2 phosphorylation, Phytomedicine, 52: p. 238-246.
31. Latha, R.M., T. Geetha, and P. Varalakshmi, 1998, Effect of Vernonia
cinerea Less flower extract in adjuvant-induced arthritis, General
Pharmacology: The Vascular System, 31(4): p. 601-606.
32. Chea, A., et al., 2006, Antimalarial activity of sesquiterpene lactones
from Vernonia cinerea, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 54(10):
p. 1437-1439.
33. Pratheeshkumar, P. and G. Kuttan, 2011, Modulation of immune
response by Vernonia cinerea L. inhibits the proinflammatory cytokine
profile, iNOS, and COX-2 expression in LPS-stimulated macrophages,
Immunopharmacology and Immunotoxicology, 33(1): p. 73-83.
34. Pratheeshkumar, P. and G. Kuttan, 2010, Vernonia cinerea Less.
Inhibits tumor cell invasion and pulmonary metastasis in C57BL/6
Mice, Integrative Cancer Therapies, 10(2): p. 178-191.
35. Rizvi, S.M.D., et al., 2011, In-vitro antibacterial and antioxidant
potential of leaf and flower extracts of Vernonia cinerea and their
phytochemical constituents, International Journal of Pharmaceutical
Sciences Review and Research, 9(2): p. 164-169.
36. Leelaprakash, G., S. Mohan Dass, and V. Sivajothi, 2011, Antioxidant
and hepatoprotective activities of Vernonia cinerea extract against CCl4
induced hepatotoxicity in albino rats, International Journal of
Pharmaceutical Sciences Review and Research, 10(2): p. 30-34.
37. Yadava, R.N. and M. Raj, 2013, A new antiviral flavone glycoside
from Vernonia cinerea Less, Asian Journal of Chemistry, 25(7): p.
3542-3544.
38. Kumar, P.O., et al., 2016, Anti-cancer activity of ethanolic extract of
Vernonia cinerea less by in vivo and in vitro method, International
Journal of Research in Pharmaceutical and Nano Sciences, 5(3): p. 95-
107.
39. Pomjunya, A., J. Ratthanophart, and W. Fungfuang, 2017, Effects of
Vernonia cinerea on reproductive performance in streptozotocin-
induced diabetic rats, The Journal of veterinary medical science, 79(3):
p. 572-578.

59
40. Naowaboot, J., S. Wannasiri, and P. Pannangpetch, 2018, Vernonia
cinerea water extract improves insulin resistance in high-fat diet–
induced obese mice, Nutrition Research, 56: p. 51-60.
41. Suresh, S.N., V. Varsha, and V. Prejeena, 2017, Oral toxicity study of
Vernonia cinerea aqueous leaf extract in Swiss Albino mice, World
Journal of Pharmaceutical Research, 6(14): p. 1003-1008.
42. Kuo, L.-M.Y., et al., 2018, New hirsutinolide-type sesquiterpenoids
from Vernonia cinerea inhibit nitric oxide production in LPS-stimulated
RAW264.7 cells, Planta Med, 84(18): p. 1348-1354.
43. Krishna Kumari, G.N., et al., 2003 Zaluzanin D: a fungistatic
sesquiterpene from Vernonia arborea, Fitoterapia, 74(5): p. 479-482.
44. Sridharan, S., et al., 2016, Anti-inflammatory screening of ethanolic
leaf extract of Vernonia arborea Buch. -Ham.in formalin induced albino
wistar rats, Indian Journal of Pharmaceutical Education and Research
50(4), 638-648. 50(4): p. 638-648.
45. Liu, Q.-H., et al., 2005, Chemical constituents of the roots of Vernonia
cumingiana Benth, Journal of Integrative Plant Biology, 47(8): p.
1016-1020.
46. Suo, M.R., J.S. Yang, and Z.S. Zhang, 2008, Two new compounds
from the stem of Vernonia cumingiana, Chinese Chemical Letters,
19(2): p. 180-182.
47. Liu, J., et al., 2009, New vernocuminosides from the stem barks of
Vernonia cumingiana Benth, Steroids, 74(1): p. 51-61.
48. Liu, J., et al., 2010, Seven new vernocuminosides from the stem bark of
Vernonia cumingiana Benth, Carbohydrate Research, 345(9), p. 1156-
1162.
49. Lin, Y.-L. and W.-Y. Wang, 2002, Chemical constituents of Vernonia
patula, Chinese Pharmaceutical Journal 54(3): p. 187-192.
50. Liang, Q.-L., J.-H. Jiang, and Z.-D. Min, 2010, A germacrane
sesquiterpenoid from Vernonia patula, Zhongguo Tianran Yaowu,
8(2),p. 104-106.
51. Hira, A., et al., 2013, Anti-inflammatory and antioxidant activities of
ethanolic extract of aerial parts of Vernonia patula (Dryand.) Merr,
Asian Pacific journal of tropical biomedicine, 3(10), p. 798-805.
52. Jisaka, M., et al., 1992, Bitter steroid glucosides, vernoniosides A1, A2,
and A3, and related B1 from a possible medicinal plant, Vernonia
amygdalina, used by wild chimpanzees, Tetrahedron, 48(4): p. 625-
632.
53. Jisaka, M., et al., 1993, Steroid glucosides from vernonia amygdalina, a
possible chimpanzee medicinal plant, Phytochemistry, 34(2), p. 409-
413.

Nghiên Cứu Phân Lập, Xác Định Cấu Trúc Và Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Các Hợp Chất Steroid Từ Cây Lá Đắng (Vernonia Amygdalina).doc

Nghiên Cứu Phân Lập, Xác Định Cấu Trúc Và Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Các Hợp Chất Steroid Từ Cây Lá Đắng (Vernonia Amygdalina).doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên Cứu Phân Lập, Xác Định Cấu Trúc Và Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Các Hợp Chất Steroid Từ Cây Lá Đắng (Vernonia Amygdalina).doc

Similar to Nghiên Cứu Phân Lập, Xác Định Cấu Trúc Và Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Các Hợp Chất Steroid Từ Cây Lá Đắng (Vernonia Amygdalina).doc (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (16)

Nghiên Cứu Phân Lập, Xác Định Cấu Trúc Và Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Các Hợp Chất Steroid Từ Cây Lá Đắng (Vernonia Amygdalina).doc