Luận Văn Thạc Sĩ Nghiên Cứu Trích Ly Polyphenol Từ Trà Camellia Sinensis (L.).doc

Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
Tải tài liệu tại kết bạn zalo : 0973.287.149
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
-------------------
NGUYỄN HẢI HÀ
NGHIÊN CỨU TRÍCH LY POLYPHENOL TỪ
TRÀ Camellia sinensis (L.)
CHUYÊN NGÀNH
MÃ SỐ NGÀNH
: CÔNG NGHỆ HỮU CƠ
: 02.10.04
LUẬN VĂN THẠC SĨ
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, tháng 7 năm 2006

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH
KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH
Cán bộ hướng dẫn khoa học:
TS.PHẠM THÀNH QUÂN
Cán bộ chấm nhận xét 1:
PGS.TS. TRẦN THỊ VIỆT HOA
Cán bộ chấm nhận xét 2:
PGS. TS. NGUYỄN NGỌC SƯƠNG
Luận văn được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUÂN VĂN THẠC SĨ,
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng năm 2006

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
PHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
Tp.HCM, ngày tháng năm 2006
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên : NGUYỄN HẢI HÀ
Ngày tháng năm sinh: 28/10/1981
Nơi sinh : Thanh Hoá
Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ HỮU CƠ MSHV : 00504105
I.TÊN ĐỀ TÀI
Nghiên cứu trích ly polyphenol từ trà
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG
ƒ Khảo sát các phương pháp so màu dùng để đánh giá hàm lượng polyphenol
tổng trong dịch trích trà.
ƒ Khảo sát phương pháp xử lý ức chế enzyme có sử dụng vi sóng.
ƒ Đánh giá lựa chọn giống trà nguyên liệu cho quá trình trích ly.
ƒ Khảo sát quá trình trích ly polyphenol từ trà bằng phương pháp có hỗ trợ vi
sóng.
ƒ Tinh chế sơ bộ dịch trích, tạo chế phẩm dạng bột.
ƒ Khảo sát một số tính chất về thành phần, hoạt tính kháng oxy hóa, kháng
khuẩn của sản phẩm.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:
V. HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. PHẠM THÀNH QUÂN
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH
Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua.
PHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC
Ngày tháng năm 2006 KHOA
QUẢN LÝ NGÀNH

Lời cảm ơn
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Phạm Thành Quân, thầy hướng dẫn đã
cho tôi ý tưởng, động lực và giúp đỡ tận tình trong nghiên cứu, xin cảm ơn các thầy
cô trong hội đồng bảo vệ đã có những nhận xét quý báu cho các kết quả.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Trương Ngọc Tuyền về những hỗ trợ
nhiệt tình trong quá trình làm thí nghiệm, anh Huỳnh Văn Tiến về kết quả phân tích
HPLC, chị Đặng Thị Thanh Bình với những ý kiến đóng góp và giúp tôi sửa chữa
trong giai đoạn viết bài, và đến các thầy cô, anh chị trong bộ môn CN Hữu cơ, đã
hết lòng ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn.
Xin cảm ơn các bạn sinh viên đã cùng tôi thực hiện đề tài.
Cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên hỗ trợ tôi hoàn thành luận văn.

i
TÓM TẮT
Trong luận văn này, một số nguyên liệu trà tại vùng trà Bảo Lộc, Lâm Đồng được
khảo sát để có những thông tin cơ bản phục vụ cho việc lựa chọn nguyên liệu trích
ly polyphenol. Các yếu tố liên quan và quy trình trích ly polyphenol từ trà bằng
phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng được khảo sát và thiết lập.
Các kết quả đạt được từ thực nghiệm như sau:
1. Đánh giá bố phương pháp phân tích so màu, qua đó đề xuất sử dụng phương
pháp Folin-ciocalteu cho quá trình phân tích hàm lượng polyphenol tổng
trong dịch trích.
2. Xác định điều kiện thực hiện bằng vi sóng quá trình ức chế enzyme
polyphenol oxidase của lá trà trước trích ly.
3. Khảo sát 5 giống trà tại vùng trà Bảo Lộc, Lâm Đồng và lựa chọn giống trà
HAT có hàm lượng EGCG và catechin tổng cao làm nguyên liệu trích ly.
4. Xác định các thông số cho quy trình trích ly polyphenol từ lá trà bằng
phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng quy mô phòng thí nghiệm.
5. Thăm dò tinh chế sơ bộ dịch trích, tạo sản phẩm dạng bột có hàm lượng
EGCG 35%, catechin tổng 70%, polyphenol tổng 95%.
6. Khảo sát một số tính chất kháng oxy hóa, kháng khuẩn của sản phẩm. Kết
quả cho thấy sản phẩm có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn so với các chất
đối chứng (vitamin C, trolox), có tiềm năng để nghiên cứu ứng dụng.

ii
ABSTRACT
In this thesis, tea resources in Bao Loc, Lam Dong were investigated to obtain
information for selecting a right type of material. Experiments were carried out
to evaluate involved factors and establish procedure of microwave-assisted
extraction method for extracting polyphenols from fresh tea leaves.
The results were shown as below:
1. Four quantitative spectrometric methods were investigated and Folin-
ciocalteu method was employed to monitor polyphenols content in the
extract.
2. A procedure for inactivating polyphenols oxidase enzyme in domestic
microwave oven was established.
3. HAT tea resource, with the highest amount of EGCG and total catechins, was
selected as suitable material for extraction.
4. Parameters were investigated for microwave-assisted extraction method.
5. A simple solvent-based procedure was used to purify the extract.
6. Antioxidant and antibacterial activities of polyphenols product were studied
and compared with standard antioxidants. Polyphenols product demonstrated
a strong antioxidant activity but weak antibacterial activity in experiments.

iii
MỤC LỤC
TÓM TẮT.......................................................................................................................................................I
ABSTRACT.................................................................................................................................................II
MỤC LỤC...................................................................................................................................................III
DANH SÁCH CÁC HÌNH - SƠ ĐỒ - BẢNG – ĐỒ THỊ.................................................. VI
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................... X
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................... X
MỞ ĐẦU...................................................................................................................................................... XI
1 TỔNG QUAN............................................................................................................................................1
1.1 Giới thiệu chung về trà ..............................................................................................................1
1.1.1 Sinh thái học của trà..................................................................................................................1
1.1.2 Phân bố trà.....................................................................................................................................2
1.1.3 Thành phần hóa học của lá trà ..............................................................................................3
1.2 Nhóm hợp chất catechin trong trà ......................................................................................8
1.2.1 Tính chất hóa lý...........................................................................................................................8
1.2.2 Sinh tổng hợp catechin trong lá trà..................................................................................11
1.2.3 Biến đổi sinh học của hợp chất nhóm catechin trong lá trà và quá trình sản
xuất sản phẩm trà truyền thống .......................................................................................................13
1.3 Tác dụng sinh học của trà và của nhóm hợp chất catechin................................15
1.3.1 Tác dụng dược lý của trà......................................................................................................15
1.3.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của nhóm catechin...............................................................17
1.3.3 Ứng dụng khả năng kháng oxy hóa của trà và các chất trích ly từ trà .............20
1.4 Trích ly polyphenol từ trà.....................................................................................................20
1.4.1 Lựa chọn và chuẩn bị nguyên liệu ...................................................................................21
1.4.2 Phương pháp trích ly..............................................................................................................23

iv
1.4.3 Các phương pháp trích ly hiện đại ...................................................................................24
1.4.4 Phương pháp trích ly có hỗ trợ của vi sóng .................................................................25
2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM..........................................................................................30
2.1 Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................................................30
2.2 Sơ đồ tiến hành thực nghiệm...............................................................................................30
2.3 Phương pháp thực nghiệm....................................................................................................31
2.3.1 Phương pháp phân tích HPLC ...........................................................................................31
2.3.2 Phương pháp so màu..............................................................................................................31
2.3.3 Lựa chọn nguyên liệu.............................................................................................................35
2.3.4 Phương pháp ức chế hoạt tính của enzyme..................................................................37
2.3.5 Xác định định tính thành phần các chất trong trà......................................................38
2.3.6 Đánh giá hàm lượng catechin trong trà nguyên liệu ................................................38
2.3.7 Đánh giá hàm lượng một số kim loại trong các mẫu trà ........................................39
2.3.8 Đánh giá phương pháp trích ly có hỗ trợ bằng vi sóng...........................................39
2.3.9 So sánh các phương pháp trích ly khác nhau ..............................................................41
2.3.10 Quá trình tinh chế sơ bộ sản phẩm ..................................................................................42
2.3.11 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro...................................................................43
2.3.12 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa tiền in vivo – phương pháp MDA .............44
2.3.13 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của sản phẩm polyphenol.................................44
3 KẾT QUẢ - BÀN LUẬN..................................................................................................................45
3.1 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng...............................................45
3.1.1 Phương pháp HPLC................................................................................................................45
3.1.2 Phương pháp so màu..............................................................................................................47
3.1.3 Đánh giá các phương pháp..................................................................................................51

v
3.2 Lựa chọn và xử lý nguyên liệu ...................................................................... 54
3.2.1 Điều kiện xử lý mất hoạt tính enzyme ......................................................... 54
3.2.2 Sơ bộ hóa thực vật trong trà ......................................................................... 59
3.2.3 Hàm lượng catechin trong các mẫu trà nguyên liệu ..................................... 60
3.2.4 Hàm lượng một số kim loại có trong mẫu nguyên liệu trà (Phương pháp
AS) 63
3.3 Đánh giá phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng ........................................ 64
3.3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi ................................................ 64
3.3.2 Ảnh hưởng của dung môi trích ly ................................................................. 65
3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sóng, nguyên liệu và công suất lò .............. 68
3.3.4 Ảnh hưởng của chất kháng oxy hóa hỗ trợ .................................................. 71
3.3.5 Hiệu quả trích ly ........................................................................................... 72
3.3.6 So sánh các phương pháp trích ly khác nhau ............................................... 73
3.4 Tinh chế sơ bộ và đánh giá sản phẩm .......................................................... 74
3.4.1 Quá trình tinh chế ......................................................................................... 74
3.4.2 Tính chất sản phẩm ....................................................................................... 75
3.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa in vitro của sản phẩm ............................. 76
3.4.4 Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa tiền in vivo của sản phẩm (phương pháp
MDA) ...................................................................................................................... 78
3.4.5 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm ............................................ 79
4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 81
5 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 83
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2

vi
DANH SÁCH CÁC HÌNH - SƠ ĐỒ - BẢNG – ĐỒ THỊ
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1.1 Cây trà và búp trà.................................................................................................................. 1
Hình 1.2 Cấu tạo khung cơ bản của hợp chất catechin và cách đánh số carbon .......... 8
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của các hợp chất catechin chính trong trà ........................... 9
Hình 1.4 Chu trình sinh tổng hợp tạo thành phenylpropan................................................. 11
Hình 1.5 Quá trình phản ứng kết hợp thành mạch cơ bản chalcone............................... 12
Hình 1.6 Chu trình sinh tổng hợp hình thành các hợp chất catechin.............................. 12
Hình 1.7 Quá trình oxy hóa các hợp chất catechin trong trà.............................................. 13
Hình 1.8 Biến đổi của catechin trong quá trình quét gốc tự do ........................................ 19
Hình 1.9 Nguyên tắc gia nhiệt bằng phương pháp thường (a) và vi sóng (b) ............ 28
Hình 1.10 Sơ đồ hệ thống trích ly có hộ trợ của vi sóng (a) trích ly với sinh hàn
hoàn lưu trong lò monomode; (b) trích ly kín trong lò multimode........................ 29
Hình 2.1 Màu tạo thành từ chất chuẩn và tác chất trong các phương pháp................. 35
Hình 2.2 Trà nguyên liệu sử dụng để trích ly polyphenol................................................... 37
Hình 2.3 Sơ đồ lắp ráp dụng cụ trích ly có hỗ trợ vi sóng .................................................. 40
Hình 2.4 Sơ đồ trích ly bằng phương pháp gia nhiệt thường............................................. 41
Hình 3.1 Đường chuẩn C, EC, EGCG, ECG, caffeine ......................................................... 45
Hình 3.2 Phổ HPLC của chất chuẩn ............................................................................................. 46
Hình 3.3 Biến đổi màu của lá trà đã được xay nhuyễn sau các khoảng thời gian xử
lý khác nhau ................................................................................................................................... 55
Hình 3.4 Màu dịch trích trà được xử lý trong các khoảng thời gian khác nhau ........ 57
Hình 3.5 Phổ đồ HPLC của dịch trích trà................................................................................... 61
Hình 3.6 Màu của dịch trích thu được ở các dung môi khác nhau.................................. 67
Hình 3.7 Sản phẩm polyphenol trà................................................................................................ 74

vii
Hình 3.9 Phổ đồ HPLC của sản phẩm polyphenol................................................................. 75
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1 Sơ đồ công nghệ của quá trình chế biến các sản phẩm trà............................. 14
Sơ đồ 1.2 Sơ đồ quá trình trích ly .................................................................................................. 21
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tiến hành thực nghiệm....................................................................................... 30
Sơ đồ 2.2 Sơ đồ tổng hợp diazotized từ sulfanilamide......................................................... 34
Sơ đồ 2.3 Sơ đồ trích kiệt polyphenol bằng phương pháp vi sóng.................................. 38
Sơ đồ 2.4 Sơ đồ trích ly polyphenol từ trà ................................................................................. 39
Sơ đồ 2.5 Sơ đồ tinh chế sản phẩm ............................................................................................... 42
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Số liệu về sản xuất trà của một số nước trên thế giới năm 2001..................... 2
Bảng 1.2 Kế hoạch phát triển trà Việt Nam.................................................................................. 3
Bảng 1.3 Thành phần hóa học của lá trà non............................................................................... 4
Bảng 1.4 Hàm lượng vitamin C trong lá trà................................................................................. 6
Bảng 1.5 Hàm lượng catechin trong từng bộ phận riêng biệt của búp trà.................... 10
Bảng 1.6 Tần số vi sóng quy ước trong ứng dụng gia dụng, y tế, công nghiệp,
nghiên cứu khoa học tại các khu vực khác nhau trên thế giới ................................. 26
Bảng 3.1 Độ lựa chọn của phương pháp..................................................................................... 51
Bảng 3.2 Độ nhạy của phương pháp............................................................................................. 52
Bảng 3.3 Đánh giá các phương pháp so màu trong phân tích định lượng catechin
tổng..................................................................................................................................................... 53
Bảng 3.4 Độ ẩm của nguyên liệu sau khi xử lý ức chế enzyme ....................................... 57
Bảng 3.5 Xác định định tính các thành phần trong nguyên liệu trà................................ 59
Bảng 3.6 Hàm lượng catechin trong các mẫu trà nguyên liệu........................................... 60
Bảng 3.7 Hàm lượng một số kim loại nặng có trong mẫu nguyên liệu trà .................. 63

viii
Bảng 3.8 So sánh hiệu quả trích ly của các phương pháp khác nhau............................. 73
Bảng 3.9 Hiệu suất tinh chế.............................................................................................................. 74
Bảng 3.10 Tính chất sản phẩm polyphenol thu được............................................................ 75
Bảng 3.11 Giá trị EC50 trong thử nghiệm hoạt tính quét gốc tự do............................... 77
Bảng 3.12 Giá trị EC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa MDA................. 78
Bảng 3.13 Hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm trên một số chủng vi khuẩn........... 79
DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1 Đường chuẩn trong phương pháp Folin-ciocalteu với các dung môi khác
nhau.................................................................................................................................................... 47
Đồ thị 3.2 Đường chuẩn trong phương pháp Prussian –Blue với các dung môi khác
nhau.................................................................................................................................................... 48
Đồ thị 3.3 Đường chuẩn trong phương pháp Vanillin – HCl với các dung môi khác
nhau.................................................................................................................................................... 49
Đồ thị 3.4 Đường chuẩn trong phương pháp Diazotized với các dung môi khác
nhau.................................................................................................................................................... 50
Đồ thị 3.5 Hiệu quả trích ly catechin theo thời gian xử lý diệt men khác nhau......... 58
Đồ thị 3.6 Phân bố hàm lượng catechin trong các nguyên liệu khác nhau.................. 61
Đồ thị 3.7 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi....................................................... 64
Đồ thị 3.8 Ảnh hưởng của các dung môi khác nhau.............................................................. 66
Đồ thị 3.9 Ảnh hưởng của lượng nguyên liệu và dung môi trích ly............................... 68
Đồ thị 3.10 Ảnh hưởng của công suất lò vi sóng lên hiệu quả trích ly.......................... 69
Đồ thị 3.11 Ảnh hưởng của chất kháng oxy hóa hỗ trợ........................................................ 71
Đồ thị 3.12 So sánh hiệu quả trích ly trong các lần trích..................................................... 72
Đồ thị 3.13 Đồ thị xác định EC50 của vitamin C ................................................................... 76
Đồ thị 3.14 Đồ thị xác định EC50 của sản phẩm polyphenol............................................ 76

ix
Đồ thị 3.15 Đồ thị xác định EC50 của chất chuẩn (+)- catechin...................................... 77
Đồ thị 3.16 Đồ thị xác định EC50 của Trolox.......................................................................... 78
Đồ thị 3.17 Đồ thị xác định EC50 của sản phẩm polyphenol............................................ 78

x
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
EC : (-) – epicatechin
ECG : (-) – epicatechin gallate
EGC : (-) - epigallocatechin
EGCG : (-) - epigallocatechin gallate
GC : (+) – gallocatechin
C : (+) – catechin
EC50 : Nồng độ cần thiết để tác động lên 50% chất cần khảo sát (Effective
concentration 50)
MAE : Trích ly có hỗ trợ vi sóng (Microwave-assisted extraction)

xi
MỞ ĐẦU
Trà là một loại thức uống lâu đời và được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Nhiều công
trình đã chứng minh trà có tác dụng trong việc phòng ngừa và chữa trị nhiều loại
bệnh khác nhau. Ngày nay, các kết quả nghiên cứu khả quan đã đẩy mạnh việc sản
xuất và sử dụng trà và các thành phần trích ly từ trà, đặc biệt là thành phần
polyphenol, như một loại thực phẩm chức năng dùng phòng bệnh. Do có tính chất
kháng oxy hóa mạnh, polyphenol từ trà còn được sử dụng trong nhiều mục đích
khác trong các ngành công nghệ như thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm.
Chính vì vậy, việc sản xuất các sản phẩm polyphenol trích ly từ trà mang lại lợi
nhuận cao hơn so với các sản phẩm trà truyền thống và đang là hướng ưu tiên của
các nước trồng trà trên thế giới. Các sản phẩm polyphenol từ trà có giá trị thương
mại cao và được sản xuất với quy mô công nghiệp tại các nước có vùng trồng trà tập
trung lớn như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ…
Việt Nam là một trong những nước có diện tích và sản lượng trà lớn trên toàn cầu,
giá trị xuất khẩu hàng năm khá cao. Tuy nhiên quy mô ngành công nghiệp trà Việt
Nam vẫn còn nhỏ bé, sản lượng chế biến thấp, chất lượng và công nghệ còn thua
kém các nước sản xuất trà khác. Việt Nam vẫn đang tập trung vào các sản phẩm trà
truyền thống như trà đen, trà xanh, trà oolong, chưa chú trọng đến việc phát triển
sản phẩm polyphenol từ trà.
Hiên nay đã có đề tài nghiên cứu về khả năng sản xuất polyphenol từ trà tại Việt
Nam, nhưng mới chỉ nghiên cứu trên nguyên liệu trà thành phẩm và sử dụng
phương pháp trích ly cổ điển. Vì vậy việc mở rộng nghiên cứu về đặc điểm nguyên
liệu và các phương pháp trích ly mới là cần thiết, giúp ích một phần trong quá trình
thúc đẩy sự phát triển của ngành trà Việt Nam.

TỔNG QUAN

1
1 TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu chung về trà
1.1.1 Sinh thái học của trà [3, 4, 8]
Tên khoa học của trà: Camellia sinensis (L.) O.Kuntze
Trà được xếp trong phân loại thực vật như sau: ngành Hạt kín Angiospermatophyta,
lớp Ngọc lan (hai lá mầm) Magnoliopsida, phân lớp Sổ Dilleniidae, bộ Trà
Theales, họ Trà Theaceae, chi Trà Camellia (Thea.) [4].
Hình 1.1 Cây trà và búp trà
Cây trà sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên chỉ có một thân chính, chia làm 3 loại:
thân gỗ, thân bụi, thân nhỡ (bán gỗ). Cành trà do mầm sinh dưỡng phát triển thành,
trên cành chia ra nhiều đốt, chiều dài biến đổi nhiều từ 1 – 10cm. Đốt trà càng dài
là biểu hiện của giống trà có năng suất cao. Lá trà mọc cách trên cành, mỗi đốt có
một lá, hình dạng và kích thước thay đổi tùy giống. Lá trà có gân rất rõ, rìa lá có
răng cưa. Búp trà là giai đoạn non của một cành trà, được hình thành từ các mầm
dinh dưỡng, gồm có tôm (phần lá non trên đỉnh chưa xòe) và 2 hoặc 3 lá non. Kích
thước của búp trà thay đổi tùy giống và kỹ thuật canh tác. Cây trà sau khi sinh
trưởng 2 – 3 tuổi bắt đầu ra hoa, mọc từ chồi sinh thực ở nách lá [8].
Tổng quan

2
Trà là cây lâu năm, có chu kỳ sống rất lâu, có thể đạt 60 – 100 năm hoặc lâu hơn.
Tuổi thọ kinh tế tối đa của một cây trà thương mại vào khoảng 50 – 65 năm tùy
thuộc điều kiện môi trường và phương pháp trồng trọt.
Trà cho năng suất cao vào mùa mưa từ tháng 5 – 11, sau 10 – 15 ngày thì thu hoạch
một lần. Trà nguyên liệu sử dụng trong cộng nghiệp chế biến chủ yếu là 1 tôm và 2
– 3 lá non.
1.1.2 Phân bố trà
1.1.2.1 Phân bố trà trên thế giới [3, 8]
Trà được trồng nhiều tại vành đai á nhiệt đới, khu vực có đặc điểm khí hậu ôn hòa,
ẩm ướt từ 30o
vĩ bắc đến 49o
vĩ nam. Hiện nay, trà được trồng ở hơn 30 nước và
được sử dụng ở hầu hết các nước trên thế giới. Các nước sản xuất và xuất khẩu trà
nhiều trên thế giới là Ấn Độ, Trung Quốc, Srilanca, Kenia, Thổ Nhĩ Kì, Indonesia,
Nhật Bản,….Năm 1995 diện tích trồng trà toàn thế giới là 2,500,000 ha, sản lượng
2,590,000 tấn trà khô.
Bảng 1.1 Số liệu về sản xuất trà của một số nước trên thế giới năm 2001 [3]
Quốc gia
Diện tích Sản Năng Xuất khẩu Mức tiêu
(ha) lượng suất (tấn) thụ
(tấn) (kg/ha) (g/người)
Trung quốc 1,130,000 685,000 598 227,934 325
Ấn Độ 438,000 835,000 1,840 191,863 650
Srilanca 196,000 294,880 1,453 239,000 1,300
Indonesia 158,000 196,000 1,453 101,105 600
Banladesh 49,000 52,033 975 15,402 -
Kenia 120,000 260,000 2,066 239,000 800
Nhật Bản 51,000 88,000 1,725 62,526 1,050
Tổng quan

3
Hiện nay, trà được sản xuất và chế biến thành nhiều loại sản phẩm khác nhau, trong
đó khoảng 76 – 78% là trà đen, 20 -22% là trà xanh, 2% là trà Oolong, còn lại là
các sản phẩm trà khác...
1.1.2.2 Phân bố trà tại Việt Nam [3]
Ở nước ta, trà được trồng tại hơn 20 tỉnh, hình thành các vùng trồng trà tập trung :
vùng thượng du: Hà Tuyên, Hoàng Liên Sơn, Lai Châu..; vùng trung du: Vĩnh
Phúc, Bắc Thái, Yên Bái…; vùng Tây Nguyên: Gia Lai, Kom Tum, Lâm Đồng…
Trong những năm gần đây diện tích trồng trà và các cơ sở chế biến trà tăng lên
nhanh chóng. Năm 1995, sản lượng trà cả nước đạt hơn 40,000 tấn, đến năm 2001,
cả nước có 100,000 ha đất trồng trà với hơn 200 cơ sở chế biến trà, sản lượng đạt
87,000 tấn khô, đứng thứ 8 trong 34 nước sản xuất trà thế giới; xuất khẩu 67,000
tấn sang 49 nước, đạt kim ngạch 78 triệu USD, đứng thứ 6 thế giới; tiêu dùng nội
địa 20,000 tấn, mức tiêu thụ đạt 256g/đầu người.
Bảng 1.2 Kế hoạch phát triển trà Việt Nam [3]
Chỉ tiêu Năm 2000 Năm 2005 Năm 2010
Diện tích (ha) 81,692 104,000 104,000
Năng suất bình quân (tấn tươi/ha) 4,23 6,1 7,5
Sản lượng trà khô (tấn) 66,000 108,000 147,000
Sản lượng xuất khẩu (tấn) 42,000 78,000 110,000
Kim ngạch xuất khẩu (triệu USD) 60 120 200
Tuy nhiên, ngành trà Việt Nam vẫn tập trung vào các sản phẩm trà truyền thống như
trà đen, trà oolong, trà xanh, gần đây là các sản phẩm trà hoà tan...; chưa phát triển
các sản phẩm trích ly từ trà, vốn là những sản phẩm có giá trị thương mại cao, nên
chưa tận dụng hết ưu thế về vùng nguyên liệu và khả năng phát triển của ngành.
1.1.3 Thành phần hóa học của lá trà
Trà là một loại thức uống truyền thống đã có lịch sử hàng ngàn năm, quá trình
nghiên cứu về trà trên thế giới đã được thực hiện từ rất lâu. Hiện nay thành phần
Tổng quan

4
hóa học của lá trà đã được mô tả tương đối đầy đủ. Thành phần chủ yếu của lá trà
được mô tả trong Bảng 1.3
Bảng 1.3 Thành phần hóa học của lá trà non [8, 10, 42, 56, 60]
Thành phần % khối lượng chất khô
Catechin 25-30
(-)- Epigallocatechin gallate 8-12
(-)- Epicatechin gallate 3-6
(-)- Epigallo catechin 3-6
(-)- Epicatechin 1-3
(+)- Catechin 1-2
(+)- Gallocatechin 3-4
Flavonol và flavonol glucoside 3-4
Polyphenolic acid and depside 3-4
Leucoanthocyanin 2-3
Chlorophyll và các chất màu khác 0,5 - 0,6
Khoáng 5-6
Caffeine 3-4
Theobromine 0.2
Theophylline 0.5
Amino acid 4-5
Acid hữu cơ 0,5 – 0,6
Monosaccharide 4-5
Polysaccharide 14-22
Cellulose và hemicellulose 4-7
Pectin 5-6
Lignin 5-6
Protein 14-17
Lipid 3-5
Các hợp chất dễ bay hơi 0,01 – 0,02
Tổng quan

5
1.1.3.1 Polyphenol [8, 42, 56]
Nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong lá trà.
Các hợp chất polyphenol của lá trà rất khác với các hợp chất polyphenol được tìm
thấy trong các loại cây khác. Các cấu tử chính chiếm đa số là các catechin (C, EC,
EGCG, EGC, ECG…). Ngoài ra trong thành phần polyphenol của trà còn có một số
chất khác với tỉ lệ thấp như các flavonol (quercetin, kaempferol, rutin…), các dẫn
xuất glucoside như myricetin-3-glucoside, kaempferol-3-glucoside, myricetin-3–
rhamnoglucoside, quercetin-3-rhamnoglucoside, kaempferol-3-rhamnodiglucoside
…, các leucoanthocyanin, các hợp chất polyflavonoid như theaflavin (theaflavin-3-
gallate, theaflavin-3’-gallate, theaflavin-3,3’-digallate...), thearubigin (procyanidine,
procyanidine gallate…). Các dạng hợp chất như theaflavin, thearubigin chiếm tỉ lệ
rất thấp trong búp trà và lá trà non nhưng tăng dần tỉ lệ trong các lá trà già hơn.
1.1.3.2 Caffeine [8, 32, 37]
Caffeine (1,3,7-trimethyl xanthine; 1,3,7-trimethyl-1H-purine -2,6 (3H,7H)-dione),
là một dẫn xuất tạo thành từ purine, caffeine chủ yếu được tổng hợp tại lá trà,
chiếm khoảng từ 3 – 5% lượng chất khô trong lá trà, và hàm lượng này ít biến đổi
trong quá trình phát triển của lá trà. Điều đáng chú ý là hàm lượng caffeine trong lá
trà cao hơn hàm lượng caffeine tương ứng trong hạt cà phê (chiếm khoảng 1,5%
trọng lượng khô). Ngoài caffeine, trong lá lá trà còn có các dẫn xuất khác của
methylxanthine như theobromine, theophylline với hàm lượng thấp hơn (<0.1%)
1.1.3.3 Acid amine [8, 10]
Các acid amine cơ bản trong lá trà bao gồm aspartic, arginine, glutamic, serine,
glutamine, tyrosine, valine, phenylalanine, leucine, isoleucine and theanine (5-N-
ethylglutamine)…. Khoảng 50% acid amine trong lá trà tồn tại ở dạng tự do. Trong
đó theanine chiếm hàm lượng cao nhất, khoảng 50-60% tổng hàm lượng acid amine
tự do, tiếp theo là aspartic acid và arginine. Theanine là acid amine đặc trưng của
cây trà, theanine chỉ có thể được tìm thấy ở các cây họ trà và một số ít các loài nấm.
Tổng quan

6
Khác với phần lớn các acid amine khác được tổng hợp tại lá trà, theanine được tổng
hợp tại bộ rễ của cây trà và vận chuyển lên lá.
1.1.3.4 Enzyme [8, 10, 56]
Trong búp trà có hầu hết các loại enzyme nhưng chủ yếu gồm 2 nhóm: nhóm
enzyme thủy phân gồm amilase, invectase, glucozidase, protease…; nhóm enzyme
oxy hóa khử gồm catalase, polyphenol oxidase và peroxidase…
Trong số các enzyme trong lá trà, enzyme polyphenol oxidase thu được nhiều sự
quan tâm do vai trò quan trọng trong quá trình oxy hóa nhóm catechin của trà.
1.1.2.5. Vitamin [8, 42]
Lá trà tươi có nhiều loại vitamin như nhóm vitamin tan trong dầu: A, D, E, F…, và
nhóm vitamin tan trong nước: B, PP, C…. Trong đó vitamin C chiếm hàm lượng
cao nhất, có thể đạt đến 280 mg/100 g trà khô.
Bảng 1.4 Hàm lượng vitamin C trong lá trà [8]
Bộ phận Tôm Lá 1 Lá 2 Lá 3 Lá già
mg/kg chất khô 7,03 9,99 10,44 7,88 3,83
1.1.3.6 Carbohydrate [8, 10, 42]
Nhóm carbohydrate có mặt trong lá trà bao gồm hợp chất cellulose, hemi-cellulose
và đường tự do.
Các gốc đường tự do có mặt trong lá trà bao gồm glucose, fructose, sucrose,
raffinose and stachyose... Các đường polysaccharide gồm có galactose, arabinose,
galacturonic acid, rhamnose và ribose... Các đường tự do là nguồn nguyên liệu
chính để tổng hợp catechin trong lá trà. Những nghiên cứu sử dụng glucose đánh
dấu bằng C14
(đồng vị carbon 14) đã chỉ ra rằng glucose là một trong những tiền
chất của polyphenol và acid amine (ngoại trừ theanine) trong lá trà.
Tổng quan

7
1.1.3.7 Các nhóm hợp chất khác [8, 10,
51] Protein
Protein chiếm khoảng 15% khối lượng chất khô của lá trà tươi, thay đổi tuỳ theo
giống trà, tuy nhiên ít biến đổi theo quá trình phát triển của lá trà.
Chất béo và các acid béo tự do
Các hợp chất lipid, phospholipid và các acid béo chiếm khoảng 5-6 % trong lá trà,
hàm lượng này biến đổi khá nhiều tuỳ theo từng giống trà khác nhau. Các acid béo
tự do tìm thấy trong lá trà có linolenic, linoleic, oleic và palmitic…
Carotenoid
β-carotene, lutein, violaxanthine và neoxanthine được tìm thấy trong lá trà.
Acid hữu cơ
Các acid như citric, tartaric, malic, oxalic, fumaric, caffeic, quinic, gallic, succinic,
chlorogenic, neo-chlorogenic, p-coumarylquinic, ellagic acid… đã được nhận diện
trong lá trà tươi.
Kim loại
Các chất vô cơ chiếm khoảng 5-6% khối lượng khô của trà, chiếm nhiều nhất là
nhôm, mangan, magie…. Hàm lượng các chất vô cơ trong lá trà biến đổi khá nhiều
tuỳ theo thổ nhưỡng vùng đất. Một điều đáng lưu ý là các một phần các kim loại,
đặc biệt là nhôm, tìm thấy trong trà dưới dạng phức chelate với các catechin [33].
Các chất dễ bay hơi (tinh dầu trà)
Thành phần tinh dầu trà chiếm tỉ lệ rất thấp trong tổng khối lượng của lá trà
(<0.01%). Các thành phần đã được nhận diện trong tinh dầu trà bao gồm linalol,
delta-cardinene, geraniol, nerolidol, alpha-terpineol, cis-jasmone, indole, beta-
ionone, 1-octanal, indole-3-carbinol, beta-caryophyllene….[36]
Tổng quan

8
1.2 Nhóm hợp chất catechin trong trà [6, 9, 10, 11, 14, 16, 60, 62]
1.2.1 Tính chất hóa lý
Nhóm hợp chất catechin trong trà đã được quan tâm nghiên cứu trong thời gian dài.
Các dữ liệu về tính chất hóa học, tính chất phổ IR, NMR, MS, các phương pháp
phân tích định tính, định lượng đã được công bố.
Catechin của trà thuộc họ flavonoid, nhóm flavan-3-ol, phân tử có 15 carbon bao
gồm hai vòng 6 carbon A và B được nối bởi 3 đơn vị carbon ở vị trí 2, 3, 4, hình
thành một dị vòng C chứa một nguyên tử oxy. Cấu trúc của catechin có chứa hai
carbon bất đối ở vị trí 2 và 3, không chứa nối đôi ở vị trí 2,3 và nhóm 4-oxo [6].
2'
3'
4'
8
1
1'
B
O 5'
7
2
C 6'
A
6 3
5 4
Hình 1.2 Cấu tạo khung cơ bản của hợp chất catechin và cách đánh số carbon [6]
Trà được biết là có 6 loại hợp chất catechin chính và một số lượng nhỏ các dẫn xuất
catechin khác. Các catechin được chia thành 2 nhóm: nhóm catechin tự do bao gồm
C, GC, EC, EGC (vị trí carbon số 3 có chứa nhóm thế hydroxyl) và nhóm đã bị ester
hóa hay nhóm galloyl catechin : ECG, EGCG (nhóm hydroxyl ở vị trí carbon số 3
được thay bằng một nhóm gallate). Các hợp chất catechin trong lá trà đã được tách
ra từng chất ở dạng tinh khiết, ở thể rắn chúng là những chất kết tinh không màu
hình kim hoặc hình lăng trụ, có vị chát dịu hoặc hơi đắng, tác dụng với FeCl3 cho
kết tủa xanh thẫm hoặc xanh nhạt tuỳ theo số lượng nhóm hydroxyl trong phân tử.
Các catechin đều dễ tan trong nước nóng, rượu, acetone, ethyl acetate tạo dung dịch
không màu, không tan trong các dung môi không phân cực hoặc ít phân cực như
benzene hoặc chloroform.
Tổng quan

9
Các catechin chính có mặt trong trà:
OH
OH
OH
OH
H HO
H
HO
O
O
OH
OH
H
H
OH
OH
(+) - Catechin C15H14O6, M = 290, (-) - Epicatechin C15H14O6, M = 290
Tnc = 176o
C, [α]D = +18o
Tnc = 242o
C, [α]D = -69o
OH OH
OH OH
HO
H
HO
H
O
OH
O
OH
O
OH
OC OH
H
H
OH
OH
OH
(- )- Epicatechin gallate, C22H14O10, (+) - Gallocatechin, C15H14O7, M = 306
M = 442, Tnc = 253o
C, [α]D = -177o
Tnc = 188o
C, [α]D = +15o
OH
OH
OH
OH
HO
H
H O
OH
OH
HO O
OH O
O C OH
OH H
H OH
OH
OH
(-) - Epigallocatechin C15H14O7, M = 306, (-) - Epigallocatechin gallate C22H18O11
Tnc = 276o
C, [α]D = -50o
M = 458, Tnc = 216o
C, [α]D = -179o
(Tnc : Nhiệt độ nóng chảy, M : Khối lượng phân tử, [α]D : góc quay cực)
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của các hợp chất catechin chính trong trà [10]
Hàm lượng catechin trong búp trà cao nhất đạt đến khoảng 30% trọng lượng khô.
Trong các hợp chất catechin được tìm thấy trong trà, thành phần gallate chiếm đa số
Tổng quan

10
(trên 80% tổng catechin). EGCG là thành phần đặc trưng của trà do chỉ được tìm
thấy trong trà, EGCG có thể chiếm đến hơn 50% tổng khối lượng các hợp chất
catechin và khoảng 10% tổng khối lượng khô của trà, tiếp theo là EGC và ECG
(chiếm khoảng 10 - 20% tổng catechin). Các hợp chất catechin (C, EC, GC) còn lại
có hàm lượng thấp và không phải là thành phần đặc trưng của trà do còn được tìm
thấy trong cacao, nho, táo, hành…, với mức độ phân bố rộng hơn. Hàm lượng của
các catechin trong lá trà luôn luôn thay đổi, phụ thuộc vào giống trà, thời kỳ sinh
trưởng, bộ phận cây trà, vị trí các lá trên búp trà và các yếu tố khác về thổ nhưỡng,
khí hậu, cách chăm bón…. Trong quá trình phát triển của lá trà, dưới tác dụng của
các enzyme, các catechin bị chuyển dần thành các hợp chất tannin và giảm dần hàm
lượng trong lá trưởng thành.
Bảng 1.5 Hàm lượng catechin trong từng bộ phận riêng biệt của búp trà [8]
Catechin Lá thứ 1 Lá thứ 2 Lá thứ 3
EGC 122,10 152,27 206,42
GC 0 0 0
EC 45,53 47,84 45,16
EGCG 580,54 577,93 431,14
ECG 138,52 132,27 103,09
Tổng lượng catechin 886,69 910,31 786,11
Đơn vị : mg/g chế phẩm chiết bằng ethyl acetate.
Lá già
232,36
0
45,16
431,14
103,09
701,82
Cọng
222,08
68,79
65,65
292,93
87,98
737,40
Hiện nay, các hợp chất catechin đã có được một cơ sở dữ liệu nghiên cứu khá chi
tiết. Tuy nhiên trong trà, ngoài catechin, các thành phần polyphenol cao phân tử
khác như theaflavin, thearubigin, leucoanthocyanidin chưa được quan tâm nghiên
cứu đầy đủ. Các thành phần này chiếm tỉ lệ cao trong các lá trà trưởng thành hoặc
trong các sản phẩm chế biến có lên men như trà đen và trà oolong [8, 10, 51, 60].
Tổng quan

11
1.2.2 Sinh tổng hợp catechin trong lá trà [6, 10, 20, 56]
Hiện nay, cơ chế về quá trình sinh tổng hợp các catechin trong lá trà vẫn chưa được
giải thích một cách đầy đủ, một phần do thành phần tương đối đặc biệt của các
catechin trong lá trà. Phần lớn các nghiên cứu vẫn dựa trên quá trình sinh tổng hợp
của các nhóm hợp chất flavonoid trong các loài cây khác từ đó suy luận cho trà.
Xét theo khung cơ bản gồm 3 vòng A, B, C (Hình 1.2), cấu trúc của họ flavonoid
được chia làm 2 phần :
- Phần C6 – C3 (Vòng B + 3C), xuất phát theo chu trình acid shikimic dẫn đến dẫn
chất phenylpropane
COOH
P
COOH
COOH O
ATP
H2C C COOH
P O OH Phospho enol pyruvic acid
P O O
HO OH OH C CH2
OH
OH COOH
Acid shikimic
5-phosphoshikimic 3 - enol pyruvyl shikimate 5 - phosphate
+ H2O -H PO
3 4
H
HOOC CH2COCOOH
CH=CH-COOH CH2 C COOH
NH
HC OH
-NH3
+NH3
HOCH -CO2
C
OH
OH
Acid paracoumaric OH
O
Tyrosin
Hình 1.4 Chu trình sinh tổng hợp tạo thành phenylpropan [6] -
Phần C6 (vòng A) xuất phát từ 3 đơn vị acetate dẫn đến acid triacetic
CH3 COOH
CH3 CO CH2 COOH
HCH2 COOH CH3 CO CH2 COOH
Acid acetoacetic
HCH2 COOH CH3 CO CH2 CO CH2 COOH
Acid triacetic
Hai phần này được đóng vòng ghép lại thành mạch chính chalcone. Từ chalcone,
xuất hiện nhiều dẫn xuất khác nhau của họ flavonoid.
Tổng quan

12
O O
HC OH
O O
HC OH
H-CH2 HOCH CH2
CH
COOH C COOH C
O O
-H2O
HO OH
B Enol
H H
A
OH O O
OH
HC
H
H
C CH
OH O H
O
Chalcone O
Hình 1.5 Quá trình phản ứng kết hợp thành mạch cơ bản chalcone [6]
Trong trường hợp chalcone và các dẫn xuất của chalcone, mạch 3C không đóng
vòng. Còn phần lớn các trường hợp khác, mạch 3C đóng vòng với vòng A tạo thành
vòng 6 dị thể chứa 1 nguyên tử oxy.
Qua các kết quả nghiên cứu, sơ đồ sinh tổng hợp sau được đề nghị cho các hợp chất
catechin trong lá trà:
3-Deoxy-D-arabino 5-Hehydroquiric 5-dehydroshikimic Shikimic
hepurronic acid – 7- acid acid acid
phosphate
Chu trình Phenyl Phenyl t-cinamic acid
Shikimic acetic acid byruvic acid
(Tạo vòng B)
Caffeic acid
p-Coumaric- CoA
Gallic acid
Glucose
Protocatechic
Chu trình acid
Acetic acid
Malonic acid 2,4,4’,6’-
(Tạo vòng A)
Pentahydroxychalcone (-)-EC (-)-ECG
Malonyl-CoA
Chalcone
(Vòng A) 2,4,4’,6- (-)-EGC (-)-EGCG
Tetrahydroxychalcone-2-
O -glucoside
Hình 1.6 Chu trình sinh tổng hợp hình thành các hợp chất catechin [20]
Tổng quan

13
1.2.3 Biến đổi sinh học của hợp chất nhóm catechin trong lá trà và quá trình
sản xuất sản phẩm trà truyền thống [8, 10, 51, 60]
Các quá trình biến đổi catechin trong trà đã được nghiên cứu kĩ trong các công trình
về trà, chủ yếu là về trà đen. Đóng vai trò chính trong quá trình chuyển hóa này là
enzyme polyphenol oxidase, được xác định thông qua hiện tượng oxy hóa không
cần oxy cũng như hiện tượng bị đầu độc khi có mặt kali cyanide trong sản xuất trà
đen. Hiện nay, enzyme polyphenol oxidase đã được tách ra ở dạng tự do với thành
phần cấu trúc chính là protein chứa nhân ion đồng [60]. Enzyme trong lá trà được
chứa trong các cấu trúc riêng của tế bào lá, trong quá trình phát triển của lá trà,
enzyme sẽ chuyển hóa dần các hợp chất catechin thành các tannin bậc cao.
OH OH
OH OH
HO O
OH
OH Catechin
PPO O
O
HO O
OR1
OH
Catechin quinone
OH
HO O
OH
OH
OH Gallocatechin
PPO O
O
HO O
OH
OR2
OH
PPO Gallocatechin quinone
OR 1 OH R
1, R2 : Hydro/gallate
OH
OH
HO O
O OOC OH
HO O
OH OH
PPO: polyphenol oxidase
OR2
OH
Theaflavin
+ catechin, gallocatechin
Thearubigin
Hình 1.7 Quá trình oxy hóa các hợp chất catechin trong trà [10]
Tổng quan

14
Trà tươi nguyên liệu
Diệt men
Vò
Sấy khô
Phân loại, đóng gói
Trà xanh thành phẩm
Vò
Lên men hạn chế
Diệt men, chấm dứt
quá trình lên men
Sấy khô
Vò
Lên men hoàn toàn
Sấy khô
Trà đen thành phẩm
Trà oolong thành phẩm
Sơ đồ 1.1 Sơ đồ công nghệ của quá trình chế biến các sản phẩm trà [8]
Trong quá trình sản xuất trà đen, trước giai đoạn lên men lá trà bị vò dập, tế bào lá
bị phá vỡ, để tạo điều kiện cho enzyme tiếp xúc và oxi hóa thành phần catechin, sau
thời gian lên men nhất định, lá trà được sấy, phân loại và đóng gói. Do đặc điểm của
quy trình chế biến nên hàm lượng của hầu hết các hợp chất catechin trong trà đen rất
thấp, khoảng 2-3% hàm lượng chất khô, so với hàm lượng 20 -30% trong trà
nguyên liệu ban đầu. Màu vàng đỏ đặc trưng của nước trà đen do các sản phẩm oxy
hóa như theaflavin và thearubigin gây ra.
Ngược lại, trong quá trình sản xuất trà xanh, các enzyme trong lá trà bị làm mất hoạt
tính bằng nhiệt hoặc hơi nước ngay khi bắt đầu chế biến nên không xảy ra quá
Tổng quan

15
trình oxy hóa các catechin. Vì vậy, nếu thực hiện quy trình tốt, hàm lượng các hợp
chất catechin trong sản phẩm trà xanh tương đương với trà nguyên liệu ban đầu.
Trà oolong là một sản phẩm trung gian giữa trà xanh và trà đen, trà tươi sử dụng
làm trà oolong vẫn trải qua quá trình lên men (quá trình oxi hóa catechin) như trà
đen, nhưng quá trình lên men này không xảy ra hoàn toàn mà được kiểm soát theo
mục đích tạo sản phẩm của người sản xuất. Khi quá trình chuyển hóa catechin trong
trà nguyên liệu đạt mức độ mong muốn, enzyme sẽ bị làm mất hoạt tính, quá trình
oxi hóa dừng lại. Vì vậy hàm lượng tổng catechin trong sản phẩm trà oolong nằm
giữa so với trà xanh và trà đen. Thông thường hàm lượng catechin trong trà oolong
chiếm khoảng 10-12% chất khô, tức là khoảng 50% so với trà nguyên liệu ban đầu.
1.3 Tác dụng sinh học của trà và của nhóm hợp chất catechin
1.3.1 Tác dụng dược lý của trà [18, 27, 28, 30, 32, 36, 51]
Trà đã được sử dụng như là một phương thuốc trong y học phương đông từ rất lâu.
Tuy nhiên các hiểu biết về cơ chế tác động của trà mới được bắt đầu nghiên cứu
mạnh mẽ trong thế kì 20. Trước đây, các tác dụng của trà được cho rằng là do tác
động của thành phần caffeine và vitamin C. Bắt đầu từ khoảng thập niên 70 của thế
kỉ 20, việc nghiên cứu chi tiết về trà đã chỉ ra rằng những tác dụng về mặt dược lý
của trà là do sự có mặt rất nhiều của các nhóm hợp chất catechin trong trà. Nhiều
công trình đã công bố về tác dụng của trà và các chất trích ly từ trà lên nhiều bệnh
khác nhau như các bệnh ung thư, bệnh về đường tim mạch, bệnh tiểu đường, bệnh
Alzheimer, bệnh Parkison, bệnh béo phì, bệnh sỏi thận, bệnh về đường tiêu hóa,
bệnh răng miệng…; ngoài ra, trà còn có tác dụng giảm hàm lượng cholesterol, làm
giảm sự nhiễm độc do kim loại, do phóng xạ….
Tác dụng ngăn chặn và chữa trị bệnh ung thư của trà và các hợp chất catechin được
nghiên cứu mạnh mẽ nhất. Khi tiến hành nghiên cứu in vivo, nhiều công trình công
bố đã cho thấy trà và các chất trích ly từ trà như EGCG, EGC, ECG ..của trà có khả
năng tương tác, ngăn chặn và hạn chế quá trình khơi mào, hình thành và phát triển
Tổng quan

16
của tế bào ung thư. Trong giai đoạn khơi mào, các hợp chất catechin trung hoà các
tác nhân bị kích hoạt bởi cytochrome P450 enzyme, các tác nhân này có khả năng
tương tác làm thay đổi cấu trúc của ADN; ngăn chặn sự tạo thành nitrosamine, một
nhóm các hợp chất phát sinh từ khói thuốc lá, các amine dị vòng trong thịt, cá nấu
chín, các tác nhân được cho là có thể gây ung thư. Các thử nghiệm in vivo cho thấy
khả năng tương tác trực tiếp và tăng cường hiệu quả của EGCG, EC vào hệ thống
bảo vệ bằng enzyme của tế bào, hạn chế sự hình thành của các tác nhân gây biến đổi
trong tế bào.
Trong giai đoạn bắt đầu của tế bào ung thư, EGCG có khả năng ức chế AP-1, một
chất dẫn truyền khơi mào cho sự phát triển của tế bào ung thư da; thể hiện khả năng
ngăn chặn protein kinase, enzyme kích hoạt tế bào trong giai đoạn phát triển của tế
bào ung thư, ức chế hoạt động của telomerase, làm giảm thời gian sống của tế bào
ung thư.
Khi quá trình ung thư đã diễn ra, EGCG có thể can thiệp, ức chế hoạt động của
urokinase, enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển và biến đổi của
tế bào ung thư, phá huỷ các dạng biến đổi đặc thù của tế bào gây ra do adevirus, hay
ngăn chặn quá trình tổng hợp ADN trong tế bào ung thư hepatoma, leukemia, và
ung thư phổi…
Các kết quả nghiên cứu in vivo, và các kết quả nghiên cứu trên động vật như chuột,
thỏ đều cho kết quả rất tốt về khả năng ngăn chặn ung thư của trà và các chất
catechin, tuy nhiên kết quả nghiên cứu trên người vẫn chưa cho thấy hiệu quả tương
tự. Một số công trình công bố catechin và trà có khả năng ngăn chặn ung thư ở
người như ung thư vòm họng, ung thư đường tiêu hóa, làm giảm khối u ung thư vú
[51]…tuy nhiên kết quả cũng mới mang tính cục bộ, chưa đạt được sự thống nhất
cao.
Tổng quan

17
1.3.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của nhóm catechin [18, 21, 32, 36, 42, 51]
1.4.2.1 Quá trình oxy hóa và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hóa
Theo các nghiên cứu đã được công bố, các bệnh như ung thư, tim mạch, lão hóa …
có liên hệ rất gần với các quy luật về quá trình oxy hóa trong tế bào sống. Các quá
trình oxy hóa, diễn ra dưới tác dụng của các gốc tự do, trong tế bào là cần thiết để
tạo ra năng lượng hoặc trong các quá trình tổng hợp nucleic acid, protein, hormon....
Gốc tự do là những hợp chất hoạt động mạnh, được tạo ra trong cơ thể trong quá
trình trao đổi chất hay được đưa vào từ bên ngoài do vi sinh vật hay vi rút. Các gốc
tự do được tạo thành gồm các gốc có hoạt tính cao như hydroxylOH, ion sắt
(Fe2+
O), Cu(OH)2, những gốc tự do hoạt tính trung bình và yếu như superoxide
anion O2, peroxyl (ROO), hydrogen peroxide H2O2, singlet oxy (O1), nitric oxide
(NO), peroxynitrite (ONOO-
), alkoxyl (RO)…. Gốc tự do trong tế bào sinh ra
trong quá trình sinh dưỡng được kiểm soát chặt chẽ thông qua quá trình kháng oxy
hóa nội tại bằng các hợp chất như glutathione, vitamin E, vitamin C và enzyme
superoxide dismutase, ngoài ra cơ thể còn có các tế bào như neutrophil, monocyte,
B-cell… có khả năng chống lại các yếu tố oxy hóa ngoại lai xâm nhập.
Tuy nhiên, trong tế bào có thể xuất hiện hiện tượng các gốc tự do được tạo ra quá
nhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên ngoài như các chất
độc, do nhiễm vi sinh vật, do ozone, bức xạ UV, nhiễm phóng xạ, do thuốc lá....Các
gốc tự do dư thừa, khi cơ thể thiếu các yếu tố bảo vệ để ngăn chặn, có khả năng
tương tác, phá hủy màng lipid không bão hoà của tế bào, làm giảm khả năng bảo vệ
tế bào, dẫn đến sự xâm nhập của các tác nhân gây bệnh từ bên ngoài; oxi hóa các
nucleic base làm thay đổi cấu trúc ADN, dẫn đến các quá trình đột biến, phát sinh
các khối u, ung thư; làm hỏng cấu trúc các protein mang nhóm SH (các protein này
đóng vai trò rất quan trọng như là chất mang hoặc chất hoạt hóa enzyme trong quá
trình hô hấp), gây ra các bệnh nghiêm trọng về đường hô hấp….
Các gốc tự do dư thừa là nguồn gốc phát sinh các bệnh nguy hiểm nên các nghiên
cứu đều hướng tới việc khảo sát khả năng kháng oxy hóa, quét gốc tự do trong quá
Tổng quan

18
trình tìm kiếm các hợp chất trong thiên nhiên có khả năng ngăn chặn hoặc chữa
bệnh.
1.4.2.2 Tính kháng oxy hóa của nhóm hợp chất catechin [5, 13, 21, 24, 28, 34,
41, 49, 51, 53, 55]
Công thức hóa học của các flavonoid với sự có mặt của các hydrogen phenolic thể
hiện khả năng kháng oxy hóa mạnh. Công thức cấu tạo catechin với nhiều nhóm
hydroxyl (5 nhóm ở các catechin, 6 ở các gallocatechin, 8 ở các catechin gallate và
9 ở các gallocatechin gallate) đảm bảo khả kháng oxy hóa rất mạnh của nhóm hợp
chất catechin.
Khi thực hiện khảo sát khả năng khảo sát trên các gốc tự do tổng hợp như DPPH,
ABTS…, các catechin thể hiện hoạt tính vượt trội so với các chất kháng oxy hóa đối
chứng như vitamin C, vitamin E, trolox (các catechin thể hiện hoạt tính mạnh hơn từ
3 đến 6 lần). Hoạt tính kháng oxy hóa của nhóm catechin thể hiện một sự khác biệt
về mối tương quan cấu trúc so với các hợp chất khác họ flavonoid. Khi so sánh với
hợp chất flavonoid có hoạt tính quét gốc tự do mạnh nhất trong môi trường phân
cực quercetin (do đặc điểm cấu trúc của quercetin có nhóm 4-oxo và nối đôi tại vị
trí carbon số 2 và 3 cho phép hình thành sự liên hợp giữa vòng A và vòng B giúp
giải toả điện tử tự do, 3 nhóm hydroxyl 3,5,7 và hai nhóm ortho-hydroxyl trên vòng
B [5, 13, 49]), các hợp chất C và EC, do trong công thức thiếu sự liên hợp giữa
vòng A và vòng B, có hoạt tính quét gốc tự do kém hơn, nhưng các gallate catechin
như EGCG và ECG có hoạt tính trội hơn. Sự khác biệt về khả năng của EGCG và
ECG được giải thích dựa trên số lượng lớn các nhóm hydroxyl trong công thức, cho
phép tiếp nhận electron dễ dàng hơn [13].
Hoạt tính kháng oxi hóa của các catechin trong trà, tính theo tỷ lệ mol, trong thử
nghiệm chống lại sự hình thành các gốc tự do DPPH trong dung dịch nước được xếp
theo trật tự giảm dần như sau: epicatechin gallate ≈ epigallocatechin gallte >
epigallocatechin > gallic acid > epicatechin ≈ catechin [49]. Với hàm lượng
Tổng quan

19
catechin tổng chiếm khoảng 30% khối lượng khô, trà và dịch trích trà cũng thể hiện
tính kháng oxy hóa rất mạnh trong các thử nghiệm, kết quả tính toán cho thấy thành
phần catechin đóng góp khoảng 70-80% khả năng kháng oxy hóa của trà [49, 51].
HO
OH
OH
O
HO O
H
OH
OH
O
OH
R.
RH
OH
O
HO O
OH
OH OH
OH
OH
. 3H
.
2H
O COOH
HO O
O
MeOH
HO O
OH
OH
O O O
HO
OH
OH
O O
Hình 1.8 Biến đổi của catechin trong quá trình quét gốc tự do [49]
Khi tiến hành thử nghiệm khả năng kháng oxy hóa trong môi trường lipid như
chống oxy hóa lipid màng tế bào (LDL), chống oxy hóa các acid béo, hay quét các
gốc tự do superoxyl, hydroxyl… trong môi trường lipid ở các thử nghiệm in vitro và
in vivo, các hợp chất catechin đều thể hiện khả năng phản ứng rất mạnh, mạnh hơn
nhiều so với trolox, vitamin E,C và cả quercetin [17, 19, 26, 28, 39]. Do đặc điểm
gần với môi trường trong cơ thể sống, các thử nghiệm kháng oxy hóa trong môi
trường lipid mô tả đầy đủ hơn triển vọng ứng dụng dược lý của các hợp chất. Đối
với khả năng ức chế quá trình peroxide lipid, các catechin của trà được xếp theo trật
tự sau: EGCG > ECG > EGC > EC; khả năng quét gốc tự do sinh ra trong quá
Tổng quan

20
trình peroxide lipid thì ECG > EGCG > EC > EGC; khả năng quét gốc tự doOH
giảm theo trật tự ECG > EC > EGCG >> EGC [21, 41, 49, 53, 55].
Các kết quả khả quan nói trên đã mở ra nhiều hướng nghiên cứu về tác dụng cụ thể
của các hợp chất catechin lên các bệnh ở người và khả năng sử dụng trong quá trình
ngăn ngừa và chữa trị bệnh.
1.3.3 Ứng dụng khả năng kháng oxy hóa của trà và các chất trích ly từ trà [2,
42, 43, 45]
Ứng dụng được quan tâm mạnh mẽ nhất hiện nay của nhóm các hợp chất catechin là
về khả năng dược lý. Nhưng ngoài ra, khả năng ngăn chặn có hiệu quả các quá trình
oxy hóa, đặc biệt là quá trình oxy hóa lipid, nhóm chất này còn được quan tâm sử
dụng trong các sản phẩm thuộc các lĩnh vực khác như mỹ phẩm và thực phẩm.
Trong các lĩnh vực này, do đặc điểm xuất phát từ thiên nhiên, an toàn, trà và các
chất từ trà đang được sử dụng chủ yếu như một phụ gia chống oxy hóa nhằm thay
thế các phụ gia tổng hợp thường dùng khác như BHT, BHA…. Trong mỹ phẩm, trà
và các chất từ trà được bổ sung vào các sản phẩm như chăm sóc cá nhân (kem đánh
răng, kem dưỡng da, sữa tắm…), các sản phẩm tẩy rửa (nước rửa chén, sữa tắm, dầu
gội…), sản phẩm tẩy mùi, diệt khuẩn nhẹ…Trong thực phẩm, ngoài khả năng kháng
oxy hóa trong các sản phẩm như bánh kẹo.., trà còn được sử dụng như một dạng
thực phẩm chức năng nhằm tăng cường khả năng phòng bệnh của cơ thể.
1.4 Trích ly polyphenol từ trà
Do đặc điểm về hàm lượng polyphenol trong trà, nên các quá trình trích ly
polyphenol từ trà thường được hiểu là trích ly nhằm thu sản phẩm là nhóm các hợp
chất catechin. Hiện nay, sản phẩm catechin từ trà đã được sản xuất ở quy mô công
nghiệp ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ…, sản lượng chế biến hàng
năm rất lớn [42, 43]. Nhìn chung, quy trình trích ly từ trà để tạo thành sản phẩm thô
hay dịch trích cũng tương đối đơn giản, không đòi hỏi nhiều thiết bị phức tạp. Hiện
Tổng quan

21
nay, trong công nghiệp vẫn sử dụng các phương pháp trích ly dung môi thông dụng
để thu sản phẩm thô ban đầu. Sơ đồ của quá trình được mô tả trong sơ đồ sau.
Trà tươi nguyên liệu
Diệt men
Nghiền nhỏ
Trích ly
Bã
Lọc
Dịch trích
Tinh chế
Dạng sản phẩm thích hợp
Sơ đồ 1.2 Sơ đồ quá trình trích ly [50]
1.4.1 Lựa chọn và chuẩn bị nguyên liệu [8, 11, 22, 25, 29, 37, 50]
Nguyên liệu trà dùng để trích ly catechin có thể dùng trà tươi, trà xanh bán thành
phẩm hoặc trà xanh thành phẩm, trà oolong. Nếu dùng sản phẩm trà bán thành phẩm
hoặc thành phẩm cần phải sử dụng loại trà đã trải qua quá trình ức chế enzyme để
đảm bảo hàm lượng catechin. Việc sử dụng trà xanh hoặc trà oolong làm nguyên
liệu bị hạn chế do giá thành cao và chất lượng không ổn định. Việc lựa chọn nguyên
liệu ảnh hưởng rất lớn đến kết quả trích ly polyphenol từ trà do đặc điểm phân bố
hàm lượng catechin không đồng đều, phụ thuộc rất nhiều vào giống trà, thổ nhưỡng,
thời điểm thu hái, cách bảo quản trước khi sử dụng...
Tổng quan

22
Trong thành phần của trà, búp trà và lá non có hàm lượng catechin cao nhất. Trong
quá trình phát triển, dưới tác dụng của enzyme polyphenol oxidase, các catechin sẽ
chuyển dần về các dạng hợp chất tannin có phân tử lớn, nên trong các lá già, hàm
lượng catechin rất thấp và không có ý nghĩa trong việc trích ly catechin. Vì vậy trà
tươi, nguyên liệu của quá trình chế biến sản phẩm trà, được sử dụng trong quá trích
ly.
Trong lá trà tươi, hợp chất catechin được tổng hợp và nằm trong tế bào lá, và được
giữ không tiếp xúc với enzyme polyphenol oxidase. Khi có tác dụng cơ học như vò,
xay nghiền… làm vỡ cấu trúc tế bào và giải phóng các enzyme, enzyme sẽ tiếp xúc
và oxy hóa nhanh chóng các catechin, vì vậy trước khi thực hiện quá trình trích ly
cần phải có giai đoạn làm mất hoạt tính enzyme. Hiện nay, trong công nghiệp chế
biến trà nói chung, hai phương pháp làm mất hoạt tính enzyme thường được sử
dụng là hấp bằng hơi nước và xử lý nhiệt [8, 25].
Trong phương pháp hấp bằng hơi nước, lá trà sau khi hái sẽ được đưa vào một thiết
bị dạng thùng quay, hơi nước ở khoảng 100o
C được xục vào và đảo liên tục, quá
trình diệt men hoàn thành sau 2-3 phút. Trong phương pháp này, lá trà thường bị
hấp thu một lượng quá nhiều nước nên hàm lượng ẩm cao, nên trong quy trình chế
biến cần quá trình sấy kéo dài sau đó.
Trong phương pháp diệt men bằng nhiệt, lá trà được cho vào thùng sấy nóng hoặc
chảo sao, nhiệt độ bề mặt truyền nhiệt khoảng 120-140o
C, lá trà được đảo đều. Quá
trình diệt men kết thúc sau khoảng 4-6 phút, quá trình diệt men bằng nhiệt thường
được kết hợp với quá trình sấy sơ bộ bằng cách kéo dài thời gian sấy. Phương pháp
diệt men bằng nhiệt có điểm hạn chế là nhiệt độ bề mặt quá cao, gây biến tính sản
phẩm ở vị trí tiếp xúc, nhiệt độ khối vật liệu không đều và chất lượng sản phẩm thấp
[8]. Phương pháp này cũng khó chuyển đổi để hoạt động liên tục nên chỉ đựơc áp
dụng trong các cơ sở sản xuất quy mô nhỏ. Hiện nay đã có nghiên cứu sử dụng năng
lượng vi sóng để thực hiện quá trình ức chế enzyme trong sản xuất trà xanh, mặc dù
Tổng quan

23
kết quả mới chỉ ở quy mô phòng thí nghiệm những cho thấy những điểm khả quan
để nghiên cứu mở rộng [22].
Sau khi diệt men, lá trà sẽ được xay nhỏ để tăng diệt tích tiếp xúc và đem trích ly.
Quá trình xay cắt có thể được thực hiện bằng các máy cắt nguyên liệu thông thường.
1.4.2 Phương pháp trích ly [2, 37, 38, 44, 45, 50, 59, 61]
Quá trình trích ly catechin từ trà hiện nay chủ yếu áp dụng phương pháp trích ly
bằng dung môi. Nguyên tắc của trích ly bằng dung môi là dựa sự thẩm thấu dung
môi vào tế bào, chất cần trích ly hoà tan vào dung môi và khuếch tán ra khỏi tế bào.
Quá trình trích ly kết thúc khi chất cần trích đạt nồng độ cân bằng trong và ngoài tế
bào. Quá trình trích ly bằng dung môi có ưu điểm là thiết bị đơn giản, có thể xử lý
một lượng rất lớn nguyên liệu và có thể thực hiện quy trình liên tục. Các yếu tố
chính cần lưu ý trong khi thực hiện quá trình trích ly bằng dung môi:
- Lựa chọn dung môi trích ly: dung môi trích ly là các dung môi hoà tan dược hợp
chất cần trích ly. Các polyphenol là các hợp chất phân cực, nên chủ yếu sử dụng
dung môi phân cực như nước, ethanol, methanol, aceton, ethyl acetate…Phần lớn
các tài liệu công bố đều sử dụng dung dịch ethanol hoặc methanol có nồng độ từ 40-
70 % (v/v), hoặc acteon 50 %, khi dùng dưới hoặc trên nồng độ này hiệu quả trích
ly thường thấp. Tuy nhiên cũng có một số tài liệu công bố việc sử dụng nước hoặc
dung dịch acid loãng để thực hiện trích ly [38, 50, 61].
-Kích thước vật liệu: quá trình trích ly xảy ra chủ yếu do thẩm thấu và khuếch tán
nên kích thước vật liệu càng nhỏ, diện tích tiếp xúc càng lớn và hiệu quả trích ly
càng cao.
-Nhiệt độ: nhiệt độ cao làm tăng vận tốc và hiệu quả quá trình, tuy nhiên cần lưu ý
để lựa chọn nhiệt độ phù hợp tránh làm oxi hóa catechin cần tách. Trong toàn bộ
quá trình trích ly, nhiệt độ không nên vượt quá 80o
C, một số quy trình thực hiện ở
nhiệt độ thấp 5-10o
C, 40-50o
C, thậm chí 100o
C [38, 59].
Tổng quan

24
-Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi : tỷ lệ nguyên liệu : dung môi càng nhỏ thì hiệu quả
quá trình trích càng cao. Tỷ lệ thường được sử dụng là 1:20 đến 1:30 cho nguyên
liệu là trà khô, 1:10 đến 1:20 cho nguyên liệu là trà tươi, tuy nhiên sử dụng nhiều
dung môi sẽ gây khó khăn cho các giai đoạn tiếp theo [37, 38, 50, 61].
-Khuấy trộn: khuấy trộn giúp tăng cường hiệu quả trích ly, do tăng cường quá trình
truyền khối.
- pH: catechin rất không bền ở pH base, bền ở pH acid. Khi thực hiện trích ly ở pH
thấp sẽ tránh được hiện tượng oxi hóa polyphenol và tăng hiệu quả trích ly. Tuy
nhiên, cũng có nghiên cứu cho rằng ảnh hưởng của pH không làm ảnh hưởng nhiều
đến hiệu quả trích ly, chỉ cần đảm bảo trích ly ở pH trung tính hoặc thấp hơn [50].
- Sử dụng chất kháng oxy hóa hỗ trợ: Việc sử dụng các chất kháng oxy hóa bổ sung
như acid arcosbic, acid citric, acid … được cho rằng làm tăng hiệu quả trích ly cũng
như làm giảm sự oxy hóa của catechin [44, 45, 61]. Nhưng cơ chế quá trình chưa rõ
ràng và điều này đạt được sự thống nhất, có ý kiến cho rằng, các catechin từ trà sẽ bị
oxy hóa trước các chất kháng oxy hóa cho vào [61], đồng thời việc bổ sung thêm
chất khác sẽ tạo thành tạp chất không mong muốn trong sản phẩm.
- Thời gian: quá trình trích ly catechin trong trà được thực hiện trong thời gian rất
khác nhau. Một số quy trình chỉ thực hiện quá trình trích ly dưới 30 phút, trong
khoảng từ 30 – 60 phút, hoặc kéo dài hơn 100 phút. Mặc dù hiệu quả trích ly thường
tăng theo thời gian, nhưng việc kéo dài thời gian trích ly lại có điểm bất lợi về mặt
năng lượng [2, 38, 45].
Nhìn chung các quá trình trích ly dung môi thông thường có hiệu quả trích ly không
cao, thời gian thực hiện dài, tiêu tốn nhiều dung môi. Việc thay đổi các yếu tố liên
quan chưa thực sự cải thiện đáng kể cho hiệu quả quá trình.
1.4.3 Các phương pháp trích ly hiện đại [17, 29, 30, 35, 39, 59, 61]
Để tăng hiệu quả của quá trình trích ly, các nghiên cứu đã được đưa ra để cải thiện
phương pháp trích ly bằng dung môi bằng cách áp dụng các biện pháp hỗ trợ như vi
Tổng quan

25
sóng, siêu âm, áp dụng các kĩ thuật trích ly bằng CO2 siêu tới hạn, trích ly pha rắn
(SPE – solid phase extraction) hoặc kỹ thuật trích ly bằng cách nén chất lỏng.
Quy trình trích ly có hỗ trợ của siêu âm : sử dụng siêu âm làm tăng nhanh quá trình
trích ly, do tác động của sóng siêu âm phá vỡ các tế bào. Nhưng hiệu quả của việc
dùng sóng siêu âm chưa thống nhất, do sóng siêu âm có thể làm tăng nhanh quá
trình oxy hóa catechin do việc thúc đẩy sự hình thành của các gốc tự do [61].
Các kĩ thuật trích ly bằng CO2 siêu tới hạn đã dược áp dụng để tách caffeine từ trà
[17], tuy nhiên chưa thấy áp dụng hiệu quả trong việc trích ly polyphenol trong thực
phẩm nói chung hay catechin trong trà nói riêng, mặc dù đã có một số nghiên cứu
bước đầu trong việc sử dụng CO2 siêu tới hạn để trích ly các hợp chất phân cực.
CO2 siêu tới hạn có những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp trích ly khác
như trích ly ở nhiệt độ thấp tránh sự phân huỷ hay oxi hóa sản phẩm, không phải
tách dung môi sau quá trình trích ly [35], tuy nhiên CO2 là một dung môi không
phân cực nên phải có biện pháp hiệu chỉnh dung môi để có thể sử dụng được trong
quá trình trích ly catechin.
Phương pháp trích ly bằng cách nén chất lỏng tỏ ra có một số ưu điểm như thực
hiện nhanh, môi trường hoàn toàn trơ, và đã được áp dụng khi thực hiện trích ly
polyphenol từ hạt nho [35]. Quy trình này vẫn còn đang được nghiên cứu và chưa
ứng dụng cho trích ly catechin từ trà. Quá trình trích ly pha rắn có hiệu quả cao,
nhưng chỉ mới được ứng dụng chủ yếu trong quá trình chuẩn bị mẫu do chỉ xử lý
được một lượng mẫu tương đối nhỏ [61].
1.4.4 Phương pháp trích ly có hỗ trợ của vi sóng
1.4.4.1 Giới thiệu về vi sóng [7, 30, 48, 54]
Vi sóng là sóng điện từ lan truyền với vận tốc ánh sáng, có tần số trong khoảng 0.3
– 3GHz. Máy phát vi sóng đầu tiên được thiết kế bởi Radall và Booth tại đại học
Birmingham và được áp dụng trong kỹ thuật radar. Sau đó, vào những năm 50 các
lò vi sóng gia dụng bắt đầu được thương mại hóa ở Mỹ và phổ biến trên toàn thế
giới. Vi sóng được ứng dụng rộng rãi trong gia dụng, y tế, công nghiệp và nghiên
Tổng quan

26
cứu khoa học với giải tần số sử dụng thể hiện trong Bảng 1.6. Tần số 2450 MHz là
tần số quy ước trên thế giới sử dụng trong các lò vi sóng gia dụng (trừ một số khu
vực sử dụng tần số 2375MHz).
Bảng 1.6 Tần số vi sóng quy ước trong ứng dụng gia dụng, y tế, công nghiệp,
nghiên cứu khoa học tại các khu vực khác nhau trên thế giới [54]
Tần số Khu vực sử dụng
0.434 Austria, Netherlands, Portugal, Germany, Switzerland
0.896 United Kingdom
0.915 Bắc Mỹ và Nam Mỹ
2.375 Albania, Bulgaria, Hungary, Romania, Czech và Slovak
2.450 Toàn thế giới (trừ những nơi dùng tần số 2.375 GHz)
3.390 Netherlands
5.800 Toàn thế giới
6.780 Netherlands
24.150 Toàn thế giới
40.680 United Kingdom
Vi sóng có đặc tính là có thể đi xuyên qua được không khí, gốm sứ, thuỷ tinh,
polymer và phản xạ trên bề mặt kim loại. Đối với vật chất có độ ẩm 50% với tần số
2450 Mhz (tương đương với bước sóng 12.2cm) có độ xuyên thấu 10 cm. Năng
lượng vi sóng tương đối yếu, nhỏ hơn năng lượng liên kết cộng hóa trị, nên bức xạ
vi sóng không gây ra sự ion hóa và không phá huỷ các liên kết hóa học .
Vi sóng có khả năng đốt nóng các vật chất có cấu trúc phân cực do có khả năng làm
quay các phân tử trong điện trường xoay chiều có tần số rất cao. Quá trình đốt nóng
diễn ra từ bên trong vật thể nên quá trình truyền nhiệt diễn ra nhanh và đều hơn quá
trình gia nhiệt thông thường. Quá trình gia nhiệt các hợp chất càng phân cực diễn ra
càng nhanh dưới tác dụng chiếu vi sóng.
Tổng quan

27
1.4.4.2 Kĩ thuật trích ly có hỗ trợ của vi sóng [7, 12, 29, 30, 48, 54, 61]
Từ khi ra đời, vi sóng đã thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học và
được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong ngành hóa học, vi sóng được
nghiên cứu nhiều trong các quá trình tổng hợp hữu cơ, trích ly tinh dầu, trích ly hợp
chất thiên nhiên, phá hủy mẫu trong phân tích, phân huỷ các hợp chất độc hại trong
xử lý môi trường…, các nghiên cứu ứng dụng vi sóng cho thấy ưu điểm vượt trội
của vi sóng so với các phương pháp gia nhiệt truyền thống khác .
Trích ly với sự hỗ trợ của vi sóng (Microwave-assisted extraction (MAE)) được
đăng ký bản quyền đầu tiên ở Mỹ. Trong những năm gần đây, phương pháp này đã
được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như trích ly các chất ô nhiễm có nguồn gốc hữu
cơ, trích ly các chất trong công nghiệp thực phẩm và sinh học, các hợp chất tự
nhiên, tinh dầu có trong các loài thực vật. MAE được biết đến như là một kỹ thuật
“sạch”, mang lại nhiều ích lợi như : đơn giản, phạm vi ứng nhiều, hiệu quả trích ly
cao, giảm thời gian và dung môi sử dụng.
Trong lĩnh vực trích ly hợp chất thiên nhiên và tinh dầu, phương pháp trích ly bằng
vi sóng mang lại hiệu quả cao do tính chất đặc biệt trong quá trình truyền năng
lượng. Khi thực hiện quá trình bằng phương pháp gia nhiệt thường, nhiệt độ được
truyền từ bên ngoài qua thành bình chứa vào dung môi và lớp vật liệu, hình thành
gradient nhiệt từ ngoài vào trong, nhiệt độ tại thành thường cao hơn nhiệt độ sôi của
dung môi. Khi thực hiện bằng vi sóng, vi sóng tạo ra hiện tượng nâng nhiệt độ của
vật thể từ bên trong bằng cách tác động trực tiếp lên các phân tử phân cực một cách
đồng đều với tốc độ rất nhanh. Hiện tượng này làm tăng tốc quá trình khuếch tán
của chất cần trích ly vào dung môi, đồng thời sự tăng nhiệt đột ngột làm hóa hơi các
phân tử dung môi, gia tăng đột ngột áp suất giúp phá vỡ cấu trúc tế bào, giải phóng
vật chất vào dung môi. Các quá trình trích ly bằng vi sóng thường có thời gian ngắn
hơn rất nhiều so với phương pháp trích ly thông thường, cho phép trích ly có hiệu
quả hơn các phân tử dễ bị phân hủy dưới tác động của nhiệt độ .
Tổng quan

28
Hình 1.9 Nguyên tắc gia nhiệt bằng phương pháp thường (a) và vi sóng (b) [54]
Các điểm cần lưu ý trong quá trình trích ly bằng vi sóng:
- Dung môi trích ly : do đặc tính của vi sóng nên thông thường dung môi trích được
lựa chọn chủ yếu là các dung môi có độ phân cực cao (nước, ethanol, methanol…),
cho phép tiếp nhận dễ dàng năng lượng vi sóng. Tuy nhiên cũng có nghiên cứu cho
rằng khi dùng các dung môi không phân cực như hexane, cho phép sự truyền dẫn
năng lượng vào bên trong tế bào thực vật tốt hơn [61].
- Nhiệt độ và áp suất trích ly : thông thường quá trình trích ly bằng vi sóng thường
được thực hiện ở áp suất khí quyển và nhiệt độ sôi của dung môi. Một số công trình
cho rằng dưới tác dụng của vi sóng, dung môi có thể chuyển sang trạng thái quá
nhiệt (sôi ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ sôi thông thường ở áp suất khí quyển), hoặc ở
trạng thái siêu tới hạn trong các lò đóng kín. Những trạng thái này có thể giải thích
một phần cho hiệu quả trích ly cao của phương pháp vi sóng [30, 54].
- Thời gian trích ly : phương pháp vi sóng cho phép giảm đáng kể thời gian trích ly
do tăng tốc độ trích lý. Quá trình trích ly thông thường hoặc bằng Sohlex có thể kéo
dài từ vài tiếng cho tới vài ngày, nhưng quá trình trích ly vi sóng chỉ cần kéo dài
khoảng 10 – 20 phút để đạt được hiệu quả tương đương [7, 61].
Tổng quan

29
Hình 1.10 Sơ đồ hệ thống trích ly có hộ trợ của vi sóng (a) trích ly với sinh hàn
hoàn lưu trong lò monomode; (b) trích ly kín trong lò multimode [54].
Điểm yếu hiện nay đối với phương pháp trích ly bằng vi sóng là thiết bị còn hạn
chế. Phần lớn các nghiên cứu chỉ sử dụng các lò gia dụng thông thường (có hoặc
không sửa đổi) nên quy mô thí nghiệm rất nhỏ, các quá trình trích ly vi sóng trong
công nghiệp cũng đang ở giai đoạn thử nghiệm.
Đối với quá trình trích ly catechin từ trà, kĩ thuật trích ly bằng vi sóng đã được công
bố trong công trình [29], tác giả đã thực hiện quy trình trích ly với nguyên liệu là trà
xanh thành phẩm cho thấy phương pháp trích ly bằng vi sóng có nhiều ưu điểm hơn
phương pháp thường. Các thông số thu được là khả quan tạo định hướng tốt cho
nghiên cứu tiếp tục.
Việt Nam có nguồn nguyên liệu trà phong phú, nhưng sản phẩm về trà còn đơn
giản, công nghệ thô sơ, nhỏ lẻ, chủ yếu tập trung khai thác các sản phẩm trà truyền
thống. Việc nghiên cứu sản xuất polyphenol từ trà là điều cần thiết nhằm tạo ra sản
phẩm có giá trị thương mại cao, đẩy mạnh sự phát triển của ngành công nghiệp trà.
Hiện nay, tại Việt Nam đã có nghiên cứu về trích ly polyphenol từ trà, nhưng chủ
yếu tập trung vào phương pháp trích ly thường [2], việc có thêm các nghiên cứu về
phương pháp trích ly khác như vi sóng là cần thiết, tạo tiền đề về công nghệ cho
việc sản xuất một sản phẩm có hàm lượng giá trị gia tăng cao.
Tổng quan

PHƯƠNG PHÁP
THỰC NGHIỆM

30
2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.1 Mục tiêu nghiên cứu
- Đánh giá một số các phương pháp so màu để định lượng hàm lượng tổng
polyphenol trong dịch trích trà.
- Đánh giá và lựa chọn giống trà nguyên liệu từ một số giống trà đang được trồng
tại vùng trà Bảo Lộc – Lâm Đồng.
- Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu và trích ly polyphenol từ búp trà bằng
phương pháp có hỗ trợ của vi sóng
- Tinh chế và tạo chế phẩm dạng bột từ dịch trích trà thu được
- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro, tiền in vivo của chế phẩm
2.2 Sơ đồ tiến hành thực nghiệm
4 phương pháp:
Phương pháp ức chế
enzyme có hỗ trợ của
vi sóng
Đánh giá các yếu tố
ảnh hưởng:
- Tỷ lệ nguyên liệu:
dung môi,
- Dung môi sử dụng,
- Thời gian trích ly,
- Chất kháng oxy hóa
hỗ trợ,
- Hi ệu quả trích ly
Khảo sát phương pháp đo
Khảo sát quá trình ức chế
enzyme
Lựa chọn nguyên liệu
Khảo sát phương pháp
trích ly có hỗ trợ vi sóng
Tinh chế sơ bộ sản phẩm
- Folin – Ciocalteu
- Prussian Blue
- Vanillin – HCl
- Diazotized
5 giống trà nguyên liệu:
LD97, LDP1, HAT, PH1, TB14
- Hàm lượng catechin
- Hoạt tính kháng oxy hóa in vitro,
Đánh giá tính chất của sản phẩm tiền in vivo
- Hoạt tính kháng khuẩn
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tiến hành thực nghiệm
Phương pháp thực nghiệm

31
2.3 Phương pháp thực nghiệm
2.3.1 Phương pháp phân tích HPLC
(Thực hiện tại Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y Tp.HCM)
Phương pháp HPLC sử dụng trong phân tích catechin đã được phát triển trong thời
gian gần đây, nhiều phương thức thực hiện với gradient, cột tách và đầu dò khác
nhau đã được công bố [10, 11, 14, 16], và hiện nay, phương pháp HPLC được coi là
phương pháp chuẩn trong phân tích các thành phần catechin của trà.
Điều kiện thực hiện :
- HPLC : HP 1100 Agilant
- Pha động : dung dịch acetonitrile và acid H3PO4 1% theo gradient như
sau:
Thời gian (phút) : 0 10 10.1
ACN : 5 40 5
H3PO4 (0.1%) : 95 60 95
- Tốc độ dòng : 1 ml/phút
- Cột : C18, Synergi Hydro-RP 80R, Phenomenex, US
- Detector : UV 230 nm
2.3.2 Phương pháp so màu
Hiện nay, phương pháp chính xác nhất dùng để khảo sát và định lượng thành phần
polyphenol trong dịch trích trà là phương pháp HPLC. Tuy nhiên phương pháp này
tương đối đắt tiền và đòi hỏi quá trình xử lý phức tạp. Vì vậy, các phương pháp phân
tích so màu được lựa chọn nhằm để định lượng hàm lượng polyphenol tổng và so sánh
nhanh hiệu quả trích ly trong quá trình khảo sát phương pháp trích ly. Nhiều phương
pháp so màu khác nhau đã được phát triển như phương pháp Folin-ciocalteu, Prussian –
Blue nhằm đo hàm lượng polyphenol tổng, phương pháp AlCl3

32
trong methanol hoặc AlCl3, NaNO2 trong NaOH dùng đánh giá hàm lượng
flavonoid tổng, phương pháp dùng Vanillin-HCl, BuOH-HCl hoặc Diazotized
sulfanilamide để xác dịnh hàm lượng catechin tổng. Mỗi phương pháp đều có ưu và
nhược điểm riêng, như phương pháp sử dụng Folin-ciocalteu và Prussian Blue rất
ổn định nhưng quá tổng quát cho nhóm phenolic, không đặc trưng cho nhóm hợp
chất catechin cần khảo sát, thường dẫn đến kết quả có sai số thừa, các phương pháp
sử dụng AlCl3, vanillin, hay diazo có độ lựa chọn cao đối với nhóm catechin thì
không đạt được độ ổn định, không thuận tiện trong quá trình tiến hành thí nghiệm
[15, 23, 37, 43, 47, 57, 60].
Tuy vậy, các phương pháp so màu có ưu thế rẻ tiền, thao tác nhanh, đơn giản, không
đòi hỏi các thiết bị phức tạp nên vẫn được sử dụng để đánh giá sơ bộ hay so sánh
kết quả. Trong thực nghiệm, bốn phương pháp Folin-ciocalteu, Prussian Blue,
Vanillin-HCl và Diazotized sẽ được đánh giá để lựa chọn phương pháp định lượng
sử dụng trong các thí nghiệm sau.
2.3.2.1 Phương pháp Folin–ciocalteu [1, 15]
Thuốc thử Folin–ciocalteu (hỗn hợp muối phức polyphosphotungstate - molydate)
rất nhạy đối với chất khử, nếu có mặt hợp chất polyphenol trong môi trường kiềm
nhẹ thì sẽ bị khử thành sản phẩm phức molydenium-tungsten có màu xanh.
Hóa chất: Thuốc thử Folin-ciocalteu, dung dịch Na2CO3 bão hoà, nước cất.
Chất chuẩn : Dung dịch (+)- catechin.
Phương pháp thực hiện: Lấy 0.5 ml dung dịch (chuẩn hoặc dung dịch cần đo đã
pha loãng- mẫu trắng dùng nước cất) cho vào bình định mức 10ml, cho tiếp 4.5ml
nước cất, lắc đều, cho nhanh 0.2 ml Folin và 0.5 ml Na2CO3 bão hòa, lắc đều dung
dịch, sau đó địch mức bằng nước cất đến 10 ml, lắc đều. Để yên trong 1giờ, sau đó
tiến hành đo độ hấp thu A tại bước sóng λ = 725 nm (Máy Jenway 6505 UV/VIS
Spectrophotometer).

33
2.3.2.2 Phương pháp Prussian Blue [2, 15, 57]
Hỗn hợp thuốc thử là FeCl3 và K3Fe(CN)6 bị khử bởi các hợp chất phenol và tạo
thành phức ferric (III) hexacyanoferrate (II) có màu xanh.
Hóa chất : dung dịch 0.02M FeCl3 trong 0.1M HCl, dung dịch 0.016M K3Fe(CN)6,
chất ổn định: nước cất + 85 % H3PO4 + 1 % gum arabic theo tỉ lệ 3:1:1 (thể tích).
Chất chuẩn: dung dịch (+)- catechin.
Phương pháp thực hiện : Lấy 0.1 ml dung dịch (chất chuẩn hoặc mẫu cần đo đã
pha loãng đến nồng độ thích hợp) cho vào ống nghiệm, cho tiếp 3 ml nước cất, lắc
đều, tiếp theo cho nhanh 1 ml K3Fe(CN)6 và 1 ml FeCl3, lắc đều dung dịch. Để yên
dung dịch trong 15 phút, sau đó đem đo độ hấp thu A tại bước sóng λ = 700 nm.
2.3.2.3 Phương pháp Vanillin – HCl [15, 23]
Vanillin có khả năng bị proton hóa trong môi trường acid, tạo thành ion mang điện
dương ái điện tử yếu sau đó phản ứng với các chất catechin tại vị trí 6 hoặc 8, tách
nước tạo thành hợp chất có màu đỏ.
Hóa chất : dung dịch vanillin 1 % trong methanol (pha mới trước khi sử dụng),
dung dịch HCl 9M trong methanol, methanol.
Chất chuẩn : Dung dịch (+)- catechin.
Phương pháp thực hiện : Lấy 1 ml dung dịch (dung dịch chuẩn hoặc dịch trích trà
đã pha loãng phù hợp – mẫu trắng thay bằng 1 ml methanol) cho vào ống nghiệm,
cho tiếp 2.5 ml dung dịch vanillin, lắc đều, sau đó 2.5 ml dung dịch HCl. Lắc đều
và để yên dung dịch trong thời gian 30 phút, sau đó đem đo độ hấp thu tại bước
sóng λ = 500 nm.

34
2.3.2.4 Phương pháp Diazotized [22, 47]
Các chất catechin có khả năng phản ứng ghép đôi với hợp chất diazo trong môi
trường acid tạo thành hợp chất có màu vàng đặc trưng.
Hóa chất : dung dịch diazotized sulfanilamide 1% trong acetone, dung dịch HCl
30/70 trong acetone (30 thể tích HCl đậm đặc pha loãng trong 70 thể tích acetone).
Chất chuẩn : dung dịch (+)- catechin.
Quy trình tổng hợp diazotized từ sulfanilamide và NaNO2/HCl:
1g Sulfanilamide
50 ml nước cất + 1ml HCl đđ
Hoà tan
0.5g NaNO2
Hỗn hợp sinh hàn đá - muối
Làm lạnh
Hoà tan
t < 5o
C
Thêm chậm
Phản ứng diazo hóa
Khuấy, t<5o
C
15 phút
Lọc Giữ lạnh
1ml nước cất
Làm khô t phòng
Diazotized sulfanilamide
Sơ đồ 2.2 Sơ đồ tổng hợp diazotized từ sulfanilamide [47]
Phương trình phản ứng:
NH2
NaNO2/HCl
+ N N
+ H2O
+ NO
+
t < 5
o
C
SO2NH2 SO2NH2
Sulfanilamide Diazotized sulfanilamide

35
Thuốc thử diazotized được tổng hợp theo sơ đồ trên (Sơ đồ 3.1). Hiệu suất phản
ứng thu được khoảng 20 %, sản phẩm diazotized sulfanilamide kết tinh dạng tinh
thể hình kim, màu vàng nhạt, rất dễ tan trong acetone, không bền với nhiệt độ và
ánh sáng, bị phân huỷ nhanh khi hoà tan trong nước. Sản phẩm rắn được giữ trong
lọ kín, ở nhiệt độ ~ 5o
C. Dung dịch diazo 1 % trong acetone được pha mới trước
khi sử dụng.
Phương pháp thực hiện : Lấy 0.1 ml dung dịch mẫu (dung dịch chuẩn hoặc dịch
trích trà đã pha loãng phù hợp, mẫu trắng sử dụng acetone) cho vào bình định mức
25 ml, thêm tiếp 1 ml dung dịch diazo 1 % trong acetone, 1 ml dung dịch HCl
30/70 trong acetone. Lắc đều, để yên dung dịch trong 1 giờ, định mức bằng nước
cất, sau đó đem đo độ hấp thu tại bước sóng λ = 415 nm.
a b c d
(a) Persain Blue; (b) Folin - Ciocalteu; (c) Vanillin-HCl; (d) Diazotized Sulfanilamide
Hình 2.1 Màu tạo thành từ chất chuẩn và tác chất trong các phương
pháp 2.3.3 Lựa chọn nguyên liệu
Thành phần catechin trong lá trà thay đổi rất nhiều, tuỳ thuộc vào bộ phận (búp trà,
lá non, lá già,…), giống trà, thời gian sinh trưởng, thổ nhưỡng, thời điểm thu hoạch.
Hàm lượng catechin cao nhất ở búp trà và hai lá non, khi lá trà càng già, hàm lượng
càng giảm dần. Hiện nay, búp trà và hai lá non cũng là nguyên liệu sử dụng quá
trình chế biến các sản phẩm trà thông thường. Do vậy để thu được hàm lượng
catechin cao và đồng thời cũng thuận tiện trong việc cung cấp nguyên liệu, toàn bộ
thí nghiệm sử dụng búp trà tươi.

Luận Văn Thạc Sĩ Nghiên Cứu Trích Ly Polyphenol Từ Trà Camellia Sinensis (L.).doc

Luận Văn Thạc Sĩ Nghiên Cứu Trích Ly Polyphenol Từ Trà Camellia Sinensis (L.).doc

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Luận Văn Thạc Sĩ Nghiên Cứu Trích Ly Polyphenol Từ Trà Camellia Sinensis (L.).doc

Similar to Luận Văn Thạc Sĩ Nghiên Cứu Trích Ly Polyphenol Từ Trà Camellia Sinensis (L.).doc (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Luận Văn Thạc Sĩ Nghiên Cứu Trích Ly Polyphenol Từ Trà Camellia Sinensis (L.).doc